甘薯IbSAP15基因在调控甘薯叶型与花型中的应用的制作方法

甘薯ibsap15基因在调控甘薯叶型与花型中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种甘薯ibsap15基因在调控甘薯叶型和花型中的应用。


背景技术：

2.锌指结构域中包含多个半胱氨酸和组氨酸残基，能通过这些残基与锌离子结合，自我折叠为“手指”状，故称锌指。包含锌指结构域的蛋白被称为锌指蛋白(kluget al.,1987)。锌指蛋白可以与dna、rna或其他蛋白相互作用，调控基因的转录、翻译等过程。植物胁迫相关蛋白(stress-associated protein,sap)家族成员包含a20/an1锌指结构域，具有泛素连接酶活性或转录因子活性，或可通过构象改变感受细胞内氧化还原状态的变化，调控植物的生物、非生物胁迫响应与生长发育。
3.甘薯是重要的粮食作物，同时也是重要的蔬菜、饲料和工业原料作物。21世纪以来，甘薯也逐渐被人们作为观赏植物。按照用于观赏的部位不同，观赏甘薯可分为观叶型、观藤型、观花型、观薯型4种(任韵等，2005)。甘薯的叶片形状多样，有心形、掌状、戟形等，观叶甘薯叶形以复缺刻、鸡爪形为主，或叶色为紫色、嫩绿色、混色。甘薯的花冠呈漏斗状，由5个花瓣联合组成，与牵牛花花型一致，花色主要为白色、淡紫、淡粉。
4.观花甘薯要求易开花、花量大、花期长，可通过短日照诱导开花(孟羽莎等，2019)，并通过施用肥料提高甘薯的花量(邱才飞等，2010)。观赏甘薯可在室内通过水培或基质栽培，装点室内环境。水培操作简单、成本低，且可以与观赏鱼、乌龟或其他水草等水生生物构成生机盎然的生态圈。盆栽甘薯则可用于客厅、阳台、办公室、会议厅等的装饰。室外种植观赏甘薯则可用于立体装饰、坡体绿化、行道绿化、岩石绿化。与室内种植不同，室外种植观赏甘薯的面积更大，可以通过不同叶色、株型的观赏甘薯搭配，或观赏甘薯与其他植被搭配，形成更具美感的景观(孟羽莎等，2019)。目前，对于观花型甘薯花型的研究较少，而且市场观花型甘薯品种较少。


技术实现要素：

5.本发明提供一种甘薯ibsap15基因在调控甘薯叶型与花型中的应用。
6.本发明所述的ibsap15基因是从甘薯中克隆出的一种an1锌指蛋白编码基因，其编码的蛋白包含两个保守的an1锌指结构域，为具有特定序列的dna分子，其cds为579bp，核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供上述ibsap15基因编码的蛋白ibsap15，其包含192个氨基酸残基，氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明首次发现将甘薯ibsap15基因在甘薯中过表达，能够加深叶片缺刻，并使得漏斗状花冠开裂，改变甘薯的叶型和花型，适用于培育不同叶型、花型的甘薯种质，增加观花型/观叶型甘薯品种。
附图说明
9.图1是线性化的入门载体结构示意图。
10.图2是重组入门载体-ibsap15结构示意图。
11.图3是植物过表达载体pgwb12结构示意图。
12.图4是重组植物表达载体pgwb12-ibsap15的结构示意图。
13.图5是ibsap15-oe株系的检测结果图，zi8、-ck、 ck分别为栽培种、阴性对照和阳性对照的检测结果，ibsap15-oe为不同ibsap15-oe株系的检测结果。
14.图6是ibsap15-oe株系及对照株系中ibsap15的相对表达量结果图。
15.图7是ibsap15-oe株系与栽培种株系叶型的比较图，箭头所指为缺刻变深的部位，比例尺为2cm。
16.图8是ibsap15-oe株系与栽培种株系花型的比较图，图8a为ibsap15-oe株系与栽培种株系花的主视图，图8b为ibsap15-oe株系与栽培种株系花的俯视图，比例尺为2cm。
具体实施方式
17.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
18.下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
19.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
20.实施例1：ibsap15的克隆及过表达载体的构建
21.实施例中使用的甘薯品种为徐紫薯8号(zi8)，通过杂交育种选育，亲本为徐紫薯3号和万紫56，是产量高、干率高、花青素含量高的鲜食品种。徐紫薯8号叶型为戟形，易开花，也是优质的观赏甘薯。
22.通过在甘薯的转录组测序数据中得到ibsap15的cds序列(见genbank登录号mw661075，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/2026807425)。根据ibsap15的cds序列设计特异引物tibsap15-f(seq id no.3)和tibsap15-r(seq id no.4)，通过pcr从甘薯各组织混合样cdna中扩增到ibsap15的cds全长，并连接到入门载体上，构建得到重组入门载体-ibsap15。通过lr反应，将测序正确的-ibsap15上的ibsap15片段置换到植物表达载体pgwb12上，得到重组植物表达载体pgwb12-ibsap15。具体步骤为：
23.1、甘薯混合样rna提取及完整性检测：收取水培甘薯叶片、不定根、花的样品，分别在液氮中研磨成粉末，等比例混合。取约100mg样品粉末，使用华越洋通用快速植物rna提取试剂盒，参照说明书提取混合样总rna。使用nano drop 1000紫外分光光度计检测rna的浓度，并取1μg总rna通过1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性。
24.2、第一链cdna合成：使用revertraqpcr rt master mix with gdna remover(toyobo)cdna合成试剂盒进行第一链cdna的合成。以500ng rna为模板，总体系10μl，具体合成步骤参照试剂盒说明书。
25.3、ibsap15的扩增和入门载体构建：使用引物对tibsap15-f(seq id no.3)和tibsap15-r(seq id no.4)，以甘薯混合样cdna为模板进行pcr扩增，所使用的dna聚合酶为taq
tm
version 2.0plus dye(takara)。反应总体系50μl，包括taq version 2.0plus dye(2
×
)25μl，cdna模板1μl，10mmol l-1
正反向引物各2μl，ddh2o 20μl。pcr扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃充分延伸2min，4℃保温。pcr产物进行电泳检测和胶回收，通过ta克隆将胶回收产物连接在(invitrogen)上，构建入门载体-ibsap15，转化大肠杆菌dh5α。挑取阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，选取序列及方向均正确的单克隆提取-ibsap15质粒用于后续实验。
26.tibsap15-f(seq id no.3)：5
’‑
atgggaggaggaacagaagct-3’，
27.tibsap15-r(seq id no.4)：5
’‑
tcaaaaagctttaacagaaggtatggtagttgg-3’。
28.4、ibsap15表达载体构建：取100ng-ibsap15与100ng pgwb12质粒，混合均匀，加入2μl gateway lr clonase ii enzyme mix(invitrogen)，补水至10μl，25℃孵育1h。加入1μl蛋白酶k，37℃10min终止反应。取1μl反应液转化至大肠杆菌dh5α中，挑取阳性克隆提取质粒，获得植物表达载体pgwb12-ibsap15。
29.实施例2：在甘薯中过表达ibsap15基因
30.为研究ibsap15基因的功能，将基因ibsap15在甘薯中过表达，通过对比过表达株系和栽培种的表型来分析ibsap15的功能。农杆菌介导的甘薯遗传转化方法包括侵染、共培养、筛选鉴定、诱导成苗等，后续通过组培快繁和移栽后扦插来进行扩繁。所用抗生素和激素有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-d)、脱落酸(abscisic acid，aba)、卡那霉素(kanamycin，kan)、潮霉素(homomycin b，hyg)、利福平(rifampin，rif)、头孢(cefotaxime sodium，cef)。所用培养基有：yeb(酵母提取物1g l-1
，牛肉浸膏5g l-1
，蔗糖5g l-1
，蛋白胨5g l-1
，mgso47h2o 0.5g l-1
)、ms(购买自北京酷来搏科技有限公司)、msd(ms 2mg
·
l-1 2,4-d)。其他试剂有：乙酰丁香酮(acetosyringone，as)。具体步骤如下：
31.1、农杆菌介导的甘薯遗传转化：
32.通过液氮冻融法将植物表达载体pgwb12-ibsap15转入农杆菌菌株gv3101感受态中，挑取阳性克隆接种到1ml含有50mg l-1
kan和20mg ml-1
rif的yeb液体培养基中，28℃过夜培养。吸取500μl过夜培养的菌液，转接到新的50ml含有50mg l-1
kan和20mg ml-1
rif的yeb液体培养基中，培养至od
600
＝0.6左右。4000rpm离心5min，收集菌体，以msd液体培养基重悬，调整od
600
在0.1～0.2之间，并加入as至终浓度30mg l-1
。将甘薯愈伤研磨成1～2mm的颗粒，使用msd清洗3次，放入10ml重悬的农杆菌菌液中，40rpm、25℃避光培养30min，超声波处理15s。将愈伤取出，放置于垫有滤纸的msd 30mg l-1
as培养基中，避光共培养。3d后，使用msd清洗至上清清澈，转移至msd 300mg l-1
cef液体培养基中，室温避光慢摇1h，接种到msd 200mg l-1
cef固体培养基上共培养2周。
33.2、抗性愈伤的筛选、诱导与移栽
34.将共培养2周后的愈伤转移至msd 10mg l-1
hyg 200mg l-1
cef固体培养基上，2周后挑选状态良好的愈伤继代到新的培养基上再培养2周。将愈伤转移到ms 10mg l-1
hyg 200mg l-1
cef 1mg l-1
aba固体培养基上诱导体细胞胚，每2周继代一次。体胚形成芽之后转移到固体培养基ms 10mg l-1
hyg 200mg l-1
cef上成苗。试管苗长至6cm以上后切段转移至ms固体培养基上扩繁，在组培苗数量较多后，选取一部分长势较好的进行移栽。用水清洗干
净组培苗上的培养基，将其移栽至营养土中，用保鲜膜保湿，置于28℃培养室中光照培养。1d后去除保鲜膜，正常培养。
35.实施例3：ibsap15-oe株系的鉴定与ibsap15表达量的检测
36.1、ibsap15-oe转基因株系的鉴定
37.使用改良的ctab法提取阳性株系及栽培种甘薯的基因组dna，使用ibsap15-oe检测引物flag-f(pgwb12)(seq id no.5)和attb2-r(seq id no.6)进行pcr扩增，检测是否为ibsap15转基因，并以pgwb12-ibsap15质粒为阳性对照，以栽培种徐紫薯8号基因组dna为阴性对照，以ddh2o为空白对照。所使用的dna聚合酶为2
×
pcr master mix(cwbio)。反应总体系20μl，包括2
×
pcr master mix 10μl，模板1μl，10mmol l-1
正反向引物各0.5μl，ddh2o 8μl。pcr扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸2min；4℃保温。反应结束后使用琼脂糖凝胶电泳分析，栽培种(zi8)和阴性对照(-ck)未扩增出条带，阳性对照( ck)扩增出950bp大小的条带，8个拟转基因株系中有7个扩增出了与阳性对照一致的条带，确定这7个株系为ibsap15-oe转基因株系(图5)。
38.flag-f(pgwb12)(seq id no.5)：5
’‑
atgagcgactacaaggatgacgat-3’，attb2-r(seq id no.6)：5
’‑
accactttgtacaagaaagctggg-3’。
39.2、ibsap15-oe转基因株系ibsap15表达量的检测
40.参照实施例1提取ibsap15-oe转基因株系叶片的rna，并反转录为cdna。使用rt-qpcr检测ibsap15的表达量。使用sybr green realtime pcr master mix(toyobo)试剂盒进行rt-qpcr检测，反应体系为10μl，其中2
×
sybr green realtime pcr master mix(toyobo)50μl，20倍稀释的cdna模板2μl，10mmol l-1
正反向引物qibsap15-f(seq id no.7)和qibsap15-r(seq id no.8)各0.5μl，ddh2o 2μl。所采用的rt-qpcr程序为：第一阶段：95℃预变性10min；第二阶段：95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环；第三阶段：65℃-95℃检测溶解曲线。以甘薯adp核糖基化因子(adp-ribosylation factor，ibarf)基因(park et al.,2012)为内参，引物序列为qibarf-f(seq id no.9)和qibarf-r(seq id no.10)。通过2-δδct
法计算ibsap15在各个株系中相对栽培种徐紫薯8号的表达量。其中3个ibsap15-oe株系的表达量如图6所示，分别为栽培种徐紫薯8号的123.56、30.78、16.16倍，分别命名为oe1、oe2和oe3。
41.qibsap15-f(seq id no.7)：5
’‑
gatcacgcttgcaaaggcag-3’，
42.qibsap15-r(seq id no.8)：5
’‑
cgtagaatccctgctcttgtttcc-3’，
43.qibarf-f(seq id no.9)：5
’‑
ctttgccaagaaggagatgc-3’，
44.qibarf-r(seq id no.10)：5
’‑
tcttgtcctgaccaccaaca-3’。
45.实施例4：ibsap15-oe株系与栽培种徐紫薯8号叶型、花型的比较
46.过表达株系的叶片相比栽培种徐紫薯8号的叶片，其叶型发生了变化。oe1、oe2两个株系的叶片相比于栽培种更小，且缺刻变深，特别是oe1株系，叶片近似鸡爪状，更具观赏价值(图7)。
47.将ibsap15-oe株系和栽培种徐紫薯8号栽种于花盆中，正常日照培养，待开花后比较花型。期间可通过短日照处理加速开花，即8h光照/16h黑暗培养。栽培种的花冠为漏斗状，每个花冠的5个花瓣相互联合在一起，ibsap15-oe株系的花冠则出现了不同程度的开裂。oe1株系的花筒完全开裂，oe2株系花筒部分开裂，这在甘薯及其近缘种中都是极其少见
的，具有极高的观赏价值(图8)。