一种热反硝化地芽孢杆菌HX-4及其生产纤维素酶的方法和应用

一种热反硝化地芽孢杆菌hx-4及其生产纤维素酶的方法和应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种热反硝化地芽孢杆菌hx-4及其生产纤维素酶的方法和应用。


背景技术：

2.稻壳、植物秸秆、污泥、畜禽粪便等有机固体废弃物中含有大量的植物纤维素，植物纤维素结构复杂且较难降解，很难有效实现资源化利用。现阶段，国内外对于植物纤维素高效稳定的资源化利用基本依靠生物法，利用微生物产生的纤维素酶降解纤维素，将其制成生物肥料。好氧堆肥是实现有机固体废弃物资源化利用的主流处理方式，堆肥腐熟是由微生物主导的生理生化过程，其前提是能够获取具有高效降解纤维素能力的微生物。有机固体废弃物堆肥腐熟过程常常伴随着放热，使堆肥内部的温度升高至60℃～70℃，能产生纤维素酶的超嗜热菌在堆肥方面更具有优势。
3.目前的纤维素降解菌分解纤维素的效果不佳，纤维素降解菌产酶量相对较少，特别指在堆肥内部温度升高后产酶能力下降明显，不能满足人们对高效纤维素酶菌种在超高温环境下的要求。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种热反硝化地芽孢杆菌hx-4及其生产纤维素酶的方法和应用，该菌株能在超高的温度下产生高活性的纤维素酶，具有良好的纤维素降解效果。为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案。
5.一种热反硝化地芽孢杆菌hx-4，其分类名称为热反硝化地芽孢杆菌hx-4（geobacillus thermodenitrificans），该菌株于2021年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.24155，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
6.上述热反硝化地芽孢杆菌hx-4，能在55℃~70℃的条件下正常生长，其产生的纤维素酶酶活可达到33.52u/ml，应用于污泥稻壳粉混合堆肥中能将混合堆肥的纤维素含量降低26.81%，在污泥、稻壳和/或畜禽粪便等纤维素质固体废弃物资源化处置利用领域具有极大的应用价值。
7.上述热反硝化地芽孢杆菌hx-4-的培养方法，在温度为55℃~70℃、ph为6.5~8.0、转速为180r/min~220r/min的培养条件下培养24h~48h。
8.优化的培养条件为：培养温度65℃，ph 7.0，转速190r/min，培养时间32h。
9.上述优化的培养条件可以进一步提高热反硝化地芽孢杆菌hx-4的繁殖速度和产纤维素酶效率。
10.利用上述热反硝化地芽孢杆菌hx-4生产纤维素酶的方法，包括以下步骤。
11.步骤一：将所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4接种到ph为7.0的lb培养基中进行培养，
制成种子液；步骤二：将生长至对数生长期的热反硝化地芽孢杆菌hx-4种子液，按3%~5%的接种体积接种至发酵培养基中，在55℃~70℃、ph为6.5~8.0、转速为180r/min~220r/min的条件下培养60h~84h，得到含纤维素酶的发酵液。
12.优选地，上述生产纤维素酶的方法中优化培养条件为：培养温度65℃，ph7.0，转速190r/min。
13.优选地，所述步骤二中的发酵培养基包括以下组分：蛋白胨10.0g、酵母提取物10.0g、(nh4)2so
4 2.0g、kh2po
4 4.0g、cacl2·
2h2o 0.3g、mgso4·
7h2o 0.3g、cmc-na 10.0g、蒸馏水1000ml。
14.本发明还提供了所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4在降解纤维素领域的应用。
15.所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4具有在55℃~70℃正常生长并合成纤维素酶的能力，可作为微生物菌种资源应用于污泥、稻壳和/或畜禽粪便堆肥等固体废弃物资源化处置利用领域。
16.本发明的热反硝化地芽孢杆菌hx-4生产纤维素酶的方法简单、高效，将热反硝化地芽孢杆菌hx-4种子液以4%的接种体积接种到发酵培养基中，在65℃下培养至60h时，经检测得到的纤维素酶酶活可达到33.52u/ml。
17.本发明的热反硝化地芽孢杆菌hx-4能在55℃~70℃的条件下正常生长，适用条件广；应用于污泥-稻壳粉混合堆肥后，堆肥温度可达到85℃，堆肥中的纤维素含量下降26.81%，在降解纤维素方面有优异的堆肥效果。本发明的生产方法得到的纤维素酶酶活高，而且具有优异的纤维素降解能力，在污泥、稻壳和/或畜禽粪便堆肥等固体废弃物资源化处置利用领域具有广阔的应用前景。
附图说明
18.图1为本发明所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4的生长曲线。
19.图2为本发明所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4的菌落形态图。
20.图3为本发明所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4的菌株扫描电镜图。
21.图4为本发明所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4基于16s rdna序列构建的系统发育树。
22.图5为本发明所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4在发酵过程中的纤维素酶活变化曲线图。
23.图6为本发明所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4在堆肥过程中纤维素降解率变化图。
24.图7为本发明所述热反硝化地芽孢杆菌hx-4在堆肥过程中堆肥的温度变化曲线。
具体实施方式
25.为了使本发明的目的、技术方案及菌株的优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.以下为实施例所用培养基和药品的配方及配制方法。
27.纤维素-刚果红培养基：cmc-na 10.0g，nacl 5.0g，酵母提取物0.5g，kh2po
4 1.0g，
刚果红0.4g，琼脂15g~20g，蒸馏水1000ml，ph7.2。
28.lb培养基：取蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，蒸馏水1000ml。
29.发酵培养基：蛋白胨10.0g、酵母提取物10.0g、(nh4)2so
4 2.0g、kh2po
4 4.0g、cacl2·
2h2o 0.3g、mgso4·
7h2o 0.3g、cmc-na 10.0g、蒸馏水1000ml，ph7.2。
30.柠檬酸溶液（0.1mol/l）：称取一水柠檬酸21.01g加蒸馏水溶解定容至1000ml。
31.柠檬酸钠溶液（0.1mol/l）：称取二水柠檬酸钠29.41g加蒸馏水溶解定容至1000ml。
32.柠檬酸盐缓冲液（0.05mol/l，ph5.5）：称取一水柠檬酸10.5g，加入氢氧化钠5.0g，溶于约800ml蒸馏水中，用柠檬酸溶液或柠檬酸钠溶液调节ph至5.5，再用蒸馏水定容至1000ml。
33.羧甲基纤维素钠溶液（5g/l）：称取羧甲基纤维素钠（cmc-na）0.50g，加入柠檬酸盐缓冲液80ml，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠全部溶解；然后停止加热，继续搅拌30min，用柠檬酸盐缓冲液定容至100ml。羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，4℃避光处放置，有效期为3d。
34.dns试剂：称取3,5-二硝基水杨酸（dns）3.15g，置于约500ml蒸馏水中，在50℃水浴中搅拌溶解，逐渐加入0.2g/ ml氢氧化钠溶液100ml，再依次加入酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.5g和无水亚硫酸钠2.5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用蒸馏水定容至1000ml，过滤；贮存于棕色试剂瓶中，避光处放置7d后使用，有效期为6个月。
35.实施例11.1 菌株的筛选采集样品：在石家庄市餐厨垃圾处置中心的好氧堆肥基质中距离堆肥基质表面深度0.5m处取样。
36.样品预处理：取上述样品10g，加入到装有90ml无菌水的无菌三角瓶中，封口膜密封后在150r/min摇床上摇动220min，静置10min后取悬浮液得到菌悬液，备用。
37.梯度稀释：利用无菌水对上述菌悬液进行10倍梯度稀释，得到浓度分别为10-2
、10-3
、10-4
和10-5
的菌悬液。
38.平板涂布：在超净操作台中，分别取10-3
、10-4
和10-5
的菌悬液0.1ml滴加到纤维素-刚果红培养基上，进行平板涂布分离，并将接种好的培养基65℃倒置培养48h~60h。
39.选定菌种：在显微镜下进行观察，在平板上生长良好，挑取有明显水解圈的菌落，通过平板划线得到单菌落。
40.菌株的生长特性及鉴定（1）菌株的生长特性将1.1选定的单菌落菌株分别接种到ph为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的lb培养基中（用naoh和hcl调整ph），65℃，摇床转速180r/min培养24h；测定在600nm处的od值，得到该菌株生长的ph范围为6.5~8.0，最适合生长的ph为7.0。
41.将1.1选定的单菌落菌株接种到ph为7.0的lb培养基中，分别在55℃、60℃、65℃、70℃、75℃不同条件下，摇床转速180r/min培养24h；测定在600nm处od值，得到该菌株生长的温度范围为55℃~70℃，最适合生长的温度为65℃。
42.将1.1选定的单菌落菌株接种到ph为7.0的lb培养基中，摇床转速分别设置180r/
min、190r/min、200r/min、210r/min、220r/min，在65℃摇床培养24h，测定在600nm处od值，得到该菌株生长的摇床转速范围为180r/min~220r/min，最适合摇床转速为190r/min。
43.生长曲线测定：将1.1选定的单菌落菌株接种在ph为7.0的lb培养基中，在65℃条件下，摇床转速190r/min培养48h，每隔2h取培养基样品，测定在600nm处od值，绘制菌株的生长曲线，如图1所示，最适合培养时间为32h。
44.（2）菌株的鉴定形态学鉴定：1.1选定的单菌落菌株在ph为7.0的lb培养基上培养24h后，菌落呈椭圆形扁平且边缘不整齐，白色不透明，表面粗糙褶皱，如图2所示；革兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态和排列呈长杆状，产芽孢、有鞭毛，无荚膜，如图3所示。
45.生物学鉴定：细菌基因组dna采用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取，采用细菌16srdna通过引物27f和1492r进行pcr扩增；pcr产物由上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果显示所述的16srdna序列长度为1448bp，具体序列如序列表所示。
46.其中，pcr反应体系（25μl）如表1所示。
47.表1pcr反应体系试剂体积（μl）10xpcrbuffer2.5dntp(each10mm)0.25taqplusdnapolymerase（5u/μl）0.2550mmmgso49.5引物27f(10
µ
m)1引物1492r(10
µ
m)1template(dna)1ddh2o9.5上游引物的27f的序列为：5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’（seqidno:2）。
48.下游引物的1492r的序列为：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’（seqidno:3）。
49.pcr扩增的条件见表2。
50.表2pcr扩增条件温度时间程序95℃5min预变性94℃30s30cycle57℃30s30cycle72℃90s30cycle72℃10min修复延伸4℃∞终止反应通过blast工具将扩增序列结果在ncbi网站上进行同源性比对分析，数据库比较分析发现，其16srdna序列与热反硝化地芽孢杆菌geobacillusthermodenitrificans的同源性高达99%，同时基于16srdna序列构建的系统发育树，如图4所示，通过blast比对和系统发育树构建可知，上述分离所得的菌株在分类上属于热反硝化地芽孢杆菌，因此将其命名为热反硝化地芽孢杆菌hx-4（geobacillusthermodenitrificans）。该菌株于2021年
12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24155，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
51.实施例2利用实施例1筛选得到的热反硝化地芽孢杆菌hx-4生产纤维素酶并测定酶活力测定。
52.2.1生产纤维素酶的方法步骤一：将热反硝化地芽孢杆菌hx-4接种到ph为7.0的lb培养基中，65℃、190r/min摇床中培养24h，制成种子液。
53.步骤二：将种子液以4%接种量加入到发酵培养基中，65℃、ph为7.0、190r/min摇床培养72h，制成发酵液。
54.步骤三：将发酵液在4℃、4200r/min条件下离心10min去除菌体，取上清液为粗酶液。
55.2.2 纤维素酶活力的测定方法根据《qb 2583-2003》采用还原糖法测定羧甲基纤维素酶活力，采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法（dns）测定酶解液中的还原糖含量，因为纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖，在沸水浴条件下可以与dns试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。
56.纤维素酶活力，在一定温度和ph条件下，1ml酶液1min催化底物生成1μg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，以u/ml表示。
57.标准曲线：往8支干净的20ml的具塞比色试管中，依次分别加入0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml标准葡萄糖溶液（1.00mg/ml），再往这8支具塞比色试管中依次分别加入2.0ml、1.8ml、1.6ml、1.4ml、1.2ml、1.0ml、0.8ml、0.6ml蒸馏水，每个试管中再各加1.5ml的dns试剂，每个试管中的混合液均为3.5ml。将混合液摇匀后于沸水浴中煮沸5min，然后迅速置于凉水中冷却，加蒸馏水定容到10ml，摇匀，在540nm处测定吸光度a值，以葡萄糖浓度（y）和吸光度（x）绘制标准曲线。
58.取0.5ml粗酶液置于试管中，用经高温灭活的粗酶液做空白对照组，再分别加入cmc-na溶液1.5ml，置于65℃水浴30min，取出后立即加入1.5ml的dns显色剂终止反应。再将上述试管一同沸水浴5min后，迅速冷却并用蒸馏水定容至10ml，摇匀后在540nm波长处测定吸光度a值。
59.每隔12h采用2.2的测定方法测定2.1中发酵液的纤维素酶含量，结果显示，在发酵0h、12h、24h、36h、48h、60h时，酶活力分别为0u/ml、8.21u/ml、19.64u/ml、27.13u/ml、31.28u/ml、33.52u/ml，如图5所示。
60.实施例3用实施例1筛选得到的热反硝化地芽孢杆菌hx-4处理污泥-稻壳粉混合堆肥，并测定该混合堆肥中的纤维素含量变化。
61.污泥-稻壳粉混合堆肥：污泥与稻壳粉按照重量4:1混合，含水率控制在65%左右，接种5%含有热反硝化地芽孢杆菌hx-4的菌剂。采用正压曝气，曝气量为0.9m3/h，采用“通风30min，停10min”间歇式曝气。堆肥过程中，0d、3d、5d、8d、14d、21d进行翻堆取样，总堆肥反
应时间为21d。
62.本实施例使用美国ankom a2000i全自动纤维测定仪对堆肥样品中的adf和adl含量进行测定，通过计算测得其中纤维素含量（纤维素含量=adf-adl）。
63.通过计算，热反硝化地芽孢杆菌hx-4可以有效降低污泥稻壳粉混合堆肥中的纤维素含量，在第21天时，纤维素降含量下降26.81%，如图6所示。
64.堆肥温度测试：分别测试了空白组与实验组堆肥体系的温度变化情况。
65.空白组：污泥与稻壳粉按照重量4:1混合，含水率65%；实验组：污泥与稻壳粉按照重量4:1混合，含水率65%，接种5%含有热反硝化地芽孢杆菌hx-4的菌剂。将两种物料放入堆肥反应器中，初始温度为20℃，每天测一次堆肥的温度情况，温度曲线如图7所示。
66.堆肥开始阶段，实验组的堆肥体温度迅速上升，第2天达到66.08℃，第7天达到峰值85.25℃，超高温期(≥80℃)维持了5天，到第14天温度下降到43.01℃，之后到第18天趋于稳定。空白组的堆体温度上升较慢，到第7天达到最高温度69.48℃，之后温度缓慢下降，到第14天为43.54℃。在21天的堆肥处理中，实验组的温度在50℃以上维持11天～12天，堆肥体温度上升速度快，最高温度相对于空白组明显提升，且高温期持续更长。
67.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。