特异性结合cd33的嵌合抗原受体及其应用
技术领域：
：1.本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体而言，本发明涉及特异性结合cd33的抗体或其抗原结合片段以及包含所述抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(car)及偶联物。本发明还涉及编码这种car的序列和表达载体，包括这种car的经改造的免疫细胞以及制备这种经改造的免疫细胞的方法。本发明还涉及这些抗体、偶联物、car和经改造的免疫细胞如t细胞、nk细胞用于治疗急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)等髓系恶性肿瘤和恶性淋巴瘤的用途及方法。
背景技术：
：：2.aml是一种常见的血液恶性肿瘤，是国内高发的恶性肿瘤之一，发病率为1.6～2.3/10万人，而且有逐年增加的趋势，可发生于任何年龄，起病急骤，进展迅速，自然存活期6月-1年，已成为严重威胁人生命健康的一种凶险性疾病。随着联合化疗、hsct、靶向治疗的广泛展开，该病的缓解率较以往有了显著提高，但整体长期生存率仍未达到预期目标，主要面临着化疗耐药及缓解后早期复发的问题。复发/难治性aml的治疗仍然是临床面临的重大挑战。3.细胞治疗是目前治疗肿瘤的创新疗法，靶向cd19、bcma的car-t疗法在治疗b细胞恶性肿瘤中已取得显著疗效。在治疗aml领域，许多肿瘤相关抗原已被用于car-t疗法，包括cd33、clec12a、cd44v6、emr2、tim3、cd70、lewisyantigen、cd123、叶酸受体-β、flt3receptor(cd135)和cll-1(clec12a)。但迄今为止，尚无单一抗原被证明是aml细胞和白血病干细胞所特有的。4.cd33是一种跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的一个成员，有两个免疫球蛋白样胞外结构域，同时与唾液酸黏附酶、cd22及髓磷脂结合糖蛋白共同组成了黏附素家族，cd33配体是唾液酸。cd33是髓系细胞的特异性抗原，表达在造血细胞亚群中，在正常造血干/祖细胞也有少量表达。cd33在约90％的aml患者中表达，该靶点主要应用于治疗aml。5.第一个靶向cd33的单克隆抗体对aml的疗效微乎其微。靶向cd33的抗体-药物结合物gemtuzumab-ozagamicin于2000年获得fda的批准，该药物上市后由于毒性问题被辉瑞撤回，调整剂量后显示出临床优势，于2017年重新上市。使用gemtuzumab-ozagamicin产生了较强的骨髓抑制作用和肝脏毒性。6.基于cd33的表达特异性，针对cd33的car-t细胞治疗有希望成为攻克aml等血液学恶性肿的方式之一。因此，发展具有高特异性和良好疗效的靶向cd33的car-t疗法是迫切而必要的。技术实现要素：7.在本技术中，发明人首先开发了具有优良性质的能够特异性识别/结合cd33的全人源抗体，在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，进一步构建获得了能够特异性结合cd33的嵌合抗原受体(car)。本发明的car能够以非mhc限制的方式将免疫效应细胞特异性和反应性指向表达cd33的细胞从而使其被清除，且与已知的靶向cd33的car相比具有更优的功能特性。因此，本发明的car具有用于预防和/或治疗aml、cml、mds、恶性淋巴瘤等cd33相关肿瘤的潜力，具有重大的临床价值。8.本发明的抗体9.本发明第一方面提供了一种能够特异性结合cd33的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：10.(1a)如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：3或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：4或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：5或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：6或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：7或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；11.或12.(1b)如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：9或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：10或其变体的cdr‑ꢀh2；序列为seqidno：11或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：12或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：13或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；13.或14.(2a)如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：16或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：17或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：18或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：19或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：20或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；15.或16.(2b)如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：22或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：23或其变体的cdr‑ꢀh2；序列为seqidno：24或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：25或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：26或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；17.或18.(3a)如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：29或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：30或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：31或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：32或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：33或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；19.或20.(3b)如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：35或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：36或其变体的cdr‑ꢀh2；序列为seqidno：37或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：38或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；21.或22.(4a)如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：42或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：43或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：44或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：45或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：46或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；23.或24.(4b)如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：48或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：49或其变体的cdr‑ꢀh2；序列为seqidno：50或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：51或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；25.其中，(1a)、(1b)、(2a)、(2b)、(3a)、(3b)、(4a)、(4b)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。26.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包括来自人的构架区(frs)。27.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人cd33。28.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：29.(a)如下六个根据kabat编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：3或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：4或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：5或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：6或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：7或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；或30.(b)如下六个根据imgt编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：9或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：10或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：11或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：12或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：13或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；31.其中，(a)或(b)中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。32.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：33.具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh和/或具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。34.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：35.(a)如下六个根据kabat编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：16或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：17或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：18或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：19或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：20或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；或36.(b)如下六个根据imgt编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：22或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：23或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：24或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：25或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：26或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；37.其中，(a)或(b)中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。38.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：39.具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh和/或具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。40.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：41.(a)如下六个根据kabat编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：29或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：30或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：31或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：32或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：33或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；或42.(b)如下六个根据imgt编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：35或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：36或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：37或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：38或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；43.其中，(a)或(b)中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。44.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：45.具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh和/或具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。46.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：47.(a)如下六个根据kabat编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：42或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：43或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：44或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：45或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：46或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；或48.(b)如下六个根据imgt编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：48或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：49或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：50或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：51或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；49.其中，(a)或(b)中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。50.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：51.具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh和/或具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。52.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自骆驼ig、ignar、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、单链抗体(例如scfv、di-scfv或(scfv)2)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白(dsfv)和单结构域抗体(sdab，纳米抗体)。53.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体，例如scfv、di-scfv或(scfv)2。在某些实施方案中，所述单链抗体从n端至c端包含：54.(1)具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh；或55.(2)具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh；或56.(3)具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh；或57.(4)具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh；58.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。59.在某些实施方案中，所述连接子为多肽。在某些实施方案中，所述连接子包含一个或几个(例如1个、2个或3个)如(gms)n所示的序列，其中m选自1-6的整数，n选自1-6的整数。优选地，m为3、4、或5；优选地，n为1或2。更优选地，所述连接子具有seqidno：60所示或seqidno：91所示的序列。60.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为包含选自下列的氨基酸序列的scfv：(1)seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列；(2)与seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；或(3)与seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。61.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。62.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(ch)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，63.所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(cl)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。64.在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg、igm、ige、igd或iga重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。65.在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。在某些优选的实施方案中，所述轻链恒定区是人κ轻链恒定区。66.抗体的制备67.本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的dna分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。68.本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见morimotoetal.,j.biochem.biophys.methods24:107-117(1992)andbrennanetal.,science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewedinhudson,curr.opin.immunol.11:548‑ꢀ557(1999)；littleetal.,immunol.today,21:364-370(2000))。比如，fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将fab’片段化学偶联形成f(ab’)2片段(carteretal.,bio/technology,10:163-167(1992))。另外，fv、fab或f(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。69.因此，本发明第二方面提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。70.本发明第三方面提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。71.本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。72.在另一个方面，本发明还涉及制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。73.偶联物74.本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用于制备偶联物。因此，本发明第五方面还提供了一种偶联物，其包含前述的抗体或其抗原结合片段及与所述抗体或其抗原结合片段偶联的偶联部分(couplingmoiety)，所述偶联部分选自:放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶、多肽、蛋白、聚乙二醇(peg)，核素，核酸，小分子毒素，受体或配体。在某些实施方案中，所述偶联部分选自能够抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡或坏死的活性物质。75.嵌合抗原受体(car)76.本发明涉及靶向cd33的car，其特征包括非mhc限制的cd33识别能力，其赋予表达该car的免疫细胞(例如，t细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)不依赖于抗原加工及提呈而识别表达cd33的细胞的能力。77.因此，本发明第六方面提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包含抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域。78.i.抗原结合结构域79.本发明的嵌合抗原受体中所包含的抗原结合结构域赋予所述car识别cd33的能力。80.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含能够特异性结合cd33(例如人cd33)的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。81.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含vh和vl，其中，82.所述vh包含如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：3或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：4或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：5或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：6或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：7或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；或者，83.所述vh包含如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：9或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：10或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：11或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：12或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：13或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；84.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。85.在某些实施方案中，所述vh包含如seqidno:1所示的序列或其变体，所述vl包含如seqidno:2所示的序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。86.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含vh和vl，其中，87.所述vh包含如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：16或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：17或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：18或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：19或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：20或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；或者，88.所述vh包含如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：22或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：23或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：24或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：25或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：26或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；89.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。90.在某些实施方案中，所述vh包含如seqidno:14所示的序列或其变体，所述vl包含如seqidno:15所示的序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。91.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含vh和vl，其中，92.所述vh包含如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：29或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：30或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：31或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：32或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：33或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；或者，93.所述vh包含如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：35或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：36或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：37或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：38或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；94.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。95.在某些实施方案中，所述vh包含如seqidno:27所示的序列或其变体，所述vl包含如seqidno:28所示的序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。96.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含vh和vl，其中，97.所述vh包含如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：42或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：43或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：44或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：45或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：46或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；或者，98.所述vh包含如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：48或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：49或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：50或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：51或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；99.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。100.在某些实施方案中，所述vh包含如seqidno:40所示的序列或其变体，所述vl包含如seqidno:41所示的序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。101.在某些实施方案中，以上任一实施方案中所述的抗原结合结构域所包含的抗体或其抗原结合片段选自骆驼ig、ignar、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、单链抗体(例如scfv、di-scfv或(scfv)2)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白(dsfv)和单结构域抗体(sdab，纳米抗体)。102.在某些实施方案中，以上任一实施方案中所述的抗原结合结构域为单链抗体，例如scfv、di-scfv或(scfv)2。103.在某些实施方案中，以上任一实施方案中所述的抗原结合结构域所包含的vh和vl、或所述抗原结合结构域所包含的抗体或其抗原结合片段的vh和vl通过连接子连接。104.在某些实施方案中，所述连接子通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头，例如富含甘氨酸和丝氨酸的一种肽接头。接头包括富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下苏氨酸的那些接头。在一些实施方案中，接头还包括带电荷的残基(如赖氨酸和/或谷氨酸)，其可以改善溶解性。在一些实施方案中，接头还包括一个或多个脯氨酸。富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少为或约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸组成。示例性的连接子包含一个或几个(例如1个、2个或3个)如(gms)n所示的序列，其中m选自1-6的整数，n选自1-6的整数。在某些实施方案中，m为3、4、或5。示例性的连接子包括具有一个或多个重复的ggggs或gggs的接头。在某些实施方案中，n为1或2。在某些示例性实施方案中，所述连接子包括seqidno：91所示的序列。在某些示例性实施方案中，所述连接子具有seqidno：60或seqidno：91的序列。105.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含单链抗体，所述单链抗体从其n端至c端包括：106.(1)具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh；或107.(2)具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh；或108.(3)具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh；或109.(4)具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh；110.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。111.在某些示例性实施方案中，所述抗原结合结构域包含单链抗体，所述单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列；(2)与seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；或(3)与seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。112.在某些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体的抗原结合结构域可以进一步包括结合选自下列的靶点的抗原结合结构域：cd44v6、emr2、tim3、cd70、lewisy抗原、cd123、叶酸受体-β、flt3受体(cd135)和cll-1(clec12a)。113.ii.跨膜结构域114.本发明的嵌合抗原受体所包含的跨膜结构域可以是本领域已知的任何蛋白结构，只要其能够在细胞膜(特别是真核细胞膜)中热力学稳定。适用于本发明的car的跨膜结构域可衍生自天然来源。在此类实施方案中，所述跨膜结构域可衍生自任何膜结合的或跨膜的蛋白质。或者，所述跨膜结构域可为合成的非天然存在的蛋白质区段，例如主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸的蛋白质区段。115.在某些实施方案中，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：t细胞受体的α、β或ζ链、cd3ε、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd28、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154和pd-1及其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：cd8α、cd4、pd-1、cd152和cd154。在某些优选的实施方案中，所述跨膜结构域包含cd8α的跨膜区。在某些示例性实施方案中，所述跨膜结构域包含如seqidno:64所示的氨基酸序列。116.iii.间隔结构域117.本发明的嵌合抗原受体所包含间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间。118.在某些实施方案中，所述间隔结构域包含免疫球蛋白(例如igg1或igg4)的ch2和ch3区。在此类实施方案中，不受特定理论的约束，认为ch2和ch3使所述car的抗原结合结构域从表达car的细胞的细胞膜延伸出去，并且可更精确地模拟天然tcr的大小和结构域结构。119.在某些实施方案中，所述间隔结构域包含铰链结构域。铰链结构域可以是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，其可以允许蛋白质具有柔性并且允许一个或两个结构域相对于彼此的运动。因此，所述铰链结构域可以是任何氨基酸序列，只要其能够提供胞外抗原结合结构域的这种柔性以及其相对于跨膜结构域的这种运动性。120.在某些实施方案中，所述铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。在某些实施方案中，所述铰链结构域包含cd8α的铰链区或其部分，例如含有cd8α的铰链区的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。在某些示例性实施方案中，所述间隔结构域包含seqidno:62所示的氨基酸序列。121.iv.信号肽122.在某些实施方案中，本发明的car可进一步在其n端包含信号肽。通常，信号肽是将与其连接的序列靶向至所需位点的多肽序列。在某些实施方案中，所述信号肽可以将与其连接的car靶向至细胞的分泌途径，并允许该car进一步整合并锚定到脂质双分子层中。可用于car的信号肽是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，所述信号肽包含重链信号肽(例如igg1的重链信号肽)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2(gm-csfr2)信号肽、il2信号肽或cd8α信号肽。在某些优选的实施方案中，所述信号肽选自cd8α信号肽。在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含seqidno:72所示的氨基酸序列。123.v.胞内信号传导结构域124.本发明的car中所包含的胞内信号传导结构域参与将本发明的car与cd33的结合所产生的信号传导进免疫效应细胞内部，激活表达car的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能，或增强表达car的免疫效应细胞的至少一种细胞因子的分泌(例如il-2，ifn-γ)。125.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。126.在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域可以是包含免疫受体酪氨酸活化基序(itam)的任何胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(itam)。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含选自下列的蛋白的胞内信号传导结构域：cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cds、cd22、cd79a、cd79b或cd66d。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含cd3ζ的胞内信号传导结构域。127.在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激分子的胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含选自下列的蛋白的胞内信号传导结构域：card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd150(slamf1)、cd270(hvem)、cd278(icos)或dap10。128.在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域选自cd28的胞内信号传导结构域、或cd137(4-1bb)的胞内信号传导结构域、或二者片段的组合。129.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含一个共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含两个或更多个共刺激信号传导结构域。在此类实施方案中，所述两个或更多个共刺激信号传导结构域可以是相同的，也可以是不同的。130.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域。所述初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域可以以任意顺序串联至跨膜结构域的羧基端。131.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域可包含cd3ζ的胞内信号传导结构域和cd137的胞内信号传导结构域。在某些示例性实施方案中，所述cd3ζ的胞内信号传导结构域包含seqidno:68所示的氨基酸序列。在某些示例性实施方案中，所述cd137的胞内信号传导结构域包含seqidno:66所示的氨基酸序列。132.在某些示例性实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域具有seqidno：70所示序列。133.vi.全长car134.本发明提供了能够特异性地结合cd33的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体从其n端至c端依次包含信号肽、抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域。在某些优选实施方案中，其中所述胞内信号传导结构域从n端到c端为共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。135.在某些实施方案中，所述间隔结构域包含cd8(例如cd8α)的铰链区，其具有seqidno：62所示序列。在某些实施方案中，所述跨膜结构域包含cd8(例如cd8α)的跨膜区，其具有seqidno：64所示序列。136.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中初级信号传导结构域包含cd3ζ的胞内信号传导结构域，其具有seqidno：68所示序列。共刺激信号传导结构域包含cd137的胞内信号传导结构域，其具有seqidno：66所示序列。在某些优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域具有seqidno：70所示序列。137.在某些优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体从其n端至c端依次包含所述信号肽、胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域(从n端到c端为共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域)。138.在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含igg1的重链信号肽或cd8α信号肽。在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含cd8α信号肽，其具有seqidno：72所示序列。139.在某些示例性实施方案中，本发明的car包含选自下列的氨基酸序列：140.(1)seqidnos:73、75、77、79、95、97、99任一项所示的氨基酸序列；141.(2)与seqidnos:73、75、77、79、95、97、99任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或者，142.(3)与seqidnos:73、75、77、79、95、97、99任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；143.其中，(2)或(3)中所述的序列基本保留了其所源自的氨基酸序列的至少一种生物学活性(例如，能够以非mhc限制的方式将免疫效应细胞的特异性和反应性指向表达cd33的细胞的能力)。144.在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。145.嵌合抗原受体的制备146.生成嵌合抗原受体以及包含该嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如t细胞)的方法是本领域已知的，可包括用至少一种编码car的多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达多核苷酸。例如，可将编码本发明的car的核酸分子包含于表达载体(例如，慢病毒载体)中，所述表达载体能够在宿主细胞例如t细胞中表达，以制造所述car。147.因此，本发明第七方面提供了一种分离的核酸分子，其包含编码第六方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。148.本领域技术人员理解，由于遗传密码的简并性，编码一种本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列可以具有多种不同的序列。因此，除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。149.在某些示例性实施方案中，所述编码第六方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列选自：(1)seqidno:74、76、78、80、96、98、100所示的序列或其简并变体；(2)与(1)所述的序列相比基本上相同的序列，例如，与(1)所述相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列，或，与(1)所述的序列相比具有一个或更多个核苷酸取代的序列；并且所述序列基本保留了其所源自的核苷酸序列的至少一种生物学活性(例如，能够编码具有以非mhc限制的方式将免疫效应细胞的特异性和反应性指向表达cd33的细胞的能力)。150.本发明第八方面提供了一种载体，其包含第七方面所述的分离的核酸分子。151.在某些实施方案中，所述载体选自dna载体，rna载体，质粒，转座子载体，crispr/cas9载体，病毒载体。152.在某些实施方案中，所述载体是表达载体。153.在某些实施方案中，所述载体是游离型载体。154.在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。155.在某些示例性实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。156.在某些实施方案中，所述载体是游离型或非整合病毒载体，例如整合缺陷型逆转录病毒或慢病毒。157.本发明第九方面提供了制备表达本发明的嵌合抗原受体的细胞的方法，其包括：(1)提供宿主细胞；(2)将如第七方面所述的分离的核酸分子或包含所述核酸分子的载体引入所述宿主细胞，以获得能够表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞。158.在某些实施方案中，所述宿主细胞是免疫细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及这些细胞的任意组合。159.在某些实施方案中，在步骤(1)中，所述免疫细胞提供自患者或者健康供体，并且经过预处理；所述预处理包括免疫细胞的分选、激活和/或增殖；在某些实施方案中，所述预处理包括将免疫细胞与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触，从而刺激所述免疫细胞并诱导其增殖，由此生成经预处理的免疫细胞。160.在某些实施方案中，在步骤(2)中，将核酸分子或载体通过病毒感染引入免疫细胞。在某些实施方案中，在步骤(2)中将核酸分子或载体通过非病毒载体转染的方式引入免疫细胞，如通过转座子的载体系统、crispr/cas9载体、talen方法、zfn方法、电穿孔方法、磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染或显微注射等方法。161.在某些实施方案中，在步骤(2)之后，所述方法还包括：扩增步骤(2)获得的免疫细胞。162.经改造的免疫细胞163.通过本发明第九方面提供的方法可将来源于患者或健康供体的免疫细胞改造为表达特异性结合cd33的car的免疫细胞。164.因此，本发明第十方面还提供了一种经改造的免疫细胞，其表达本发明的特异性结合cd33的car。165.在某些实施方案中，所述经改造的免疫细胞包含第七方面所述的分离的核酸分子或包含所述核酸分子的载体。166.在某些实施方案中，所述免疫细胞来源于患者或健康供体的t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。这些免疫细胞被通过第九方面所提供的方法导入如第七方面所述的分离的核酸分子或第八方面所述的载体从而制备为经改造的免疫细胞。167.在某些实施方案中，经改造的免疫细胞可以具有cd33靶点以外的结合特异性，如经改造的免疫细还结合cd44v6、emr2、tim3、cd70、lewisy抗原、cd123、叶酸受体-β、flt3受体(cd135)或cll-1(clec12a)。168.免疫细胞组合物169.在第十一方面，本发明还提供了免疫细胞组合物，所述免疫细胞组合物包括前述经改造的免疫细胞，以及可选的未改造和/或未成功改造的免疫细胞，这些未改造和/或未成功改造的免疫细胞不表达特异性针对cd33的car。限制于当前的技术水平及一些未知的原因，并不是所有免疫细胞经过改造都能表达特异性针对cd33的car。而且不表达car的免疫细胞也有一定的生物学活性，因此免疫细胞组合物可以含有表达和不表达特异性针对cd33的car的免疫细胞，该免疫细胞组合物依然能够满足临床应用的需求。170.在某些实施方案中，经改造的表达特异性针对cd33的car的免疫细胞占免疫细胞组合物总细胞数的大约10％-100％，优选地40％-80％。171.在某些实施方案中，免疫细胞组合物被培养成免疫细胞系，因此，另一方面，本发明还提供了含有免疫细胞组合物的免疫细胞系。172.在另一个方面，本发明提供了制备特异性结合cd33的嵌合抗原受体，或用于制备表达所述嵌合抗原受体的细胞的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括第七方面所述的分离的核酸分子或第八方面所述的载体，和必要的溶剂，如无菌水，生理盐水，或细胞培养液，如lb培养液，如elitecell原代t淋巴细胞培养体系(产品编号：primed-elitecell-024)，以及可选的，还包括使用说明书。173.在另一个方面，本发明提供了前述试剂盒用于制备能够特异性结合cd33的嵌合抗原受体、或表达所述嵌合抗原受体的细胞的应用。174.药物组合物175.在第十二方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。176.在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如具有抗肿瘤活性的药物(例如化疗药物)。177.在某些实施方案中，本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物与所述另外的药学活性剂(例如具有抗肿瘤活性的药物)组合施用，例如可以同时、分开或相继施用。178.在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含：第七方面所述的分离的核酸分子、或第八方面所述的载体。179.在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含：第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物。180.在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含：第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物。181.本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。182.本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物通过静脉注射或推注给予。183.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。184.治疗方法及用途185.在另一方面，本发明提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物。186.在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物。187.在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明第六方面所述的嵌合抗原受体、第七方面所述的分离的核酸分子、第八方面所述的载体、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物。188.在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(1)提供所述受试者所需的免疫细胞(例如t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、或这些细胞的任意组合)；(2)将包含本发明第七方面所述的分离的核酸分子或第八方面所述的载体导入步骤(1)所述的免疫细胞，以获得表达所述嵌合抗原受体的细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞施用至所述受试者以进行治疗。189.在某些实施方案中，所述方法通过剂量分次，例如一次，两次，三次或更多次分开施用部分剂量，向所述受试者施用表达本发明的car的免疫细胞，例如在治疗的第一天施用总剂量的第一百分比，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的第二百分比，例如在随后的(例如第三，第四，第五，第六，第七，第八，第九，第十或更晚)治疗日施用总剂量的第三百分比(例如，剩余百分比)。190.在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的10％的细胞，在第二天施用总剂量的30％的细胞，并且在第三天施用总剂量的剩余60％的细胞。191.在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的50％的细胞，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的50％的细胞。在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的1/3的细胞，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的1/3的细胞，在随后的(例如第三，第四，第五，第六，第七，第八，第九，第十或更晚)施用总剂量的1/3的细胞。192.在某些实施方案中，总细胞剂量包含1×107至10×108个car阳性免疫细胞，例如包含(1-5)×107至(5-10)×108个car阳性免疫细胞。193.在某些实施方案中，医师可以根据病人的状态，肿瘤的大小和阶段，或联合治疗的药物等临床情况来调节剂量或治疗方案。194.在某些实施方案中，所述肿瘤是血液学恶性肿瘤。195.在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤是cd33阳性血液恶性肿瘤。196.在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自髓系恶性肿瘤或恶性淋巴瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)、恶性淋巴瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、血小板白血病、难治性贫血、白血病前期综合征、淋巴样白血病、或未分化白血病。197.在某些实施方案中，所述恶性淋巴瘤选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤，以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。198.在某些实施方案中，将本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物与另外的试剂联合施用。在某些实施方案中，所述另外的试剂包括(i)增加包含car核酸或car多肽的细胞(例如表达本发明的car的免疫细胞，本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物)的功效的作用剂；(ii)改善与施用包含car核酸或car多肽的细胞(例如表达本发明的car的免疫细胞，本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物)相关的一种或多种副作用的作用剂；(iii)具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂。这些试剂可以与本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物，同时(以相同或分开的组合物)、或依序给予。199.本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物还可以与其他疗法组合使用。因此，在某些实施方案中，以上所述方法还包括向所述受试者施用第二疗法，所述第二疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、dna疗法、rna疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法及其任意组合。200.在某些实施方案中，所述第二疗法可以与以上所述的方法分开或联合应用；或，所述第二疗法可以与以上所述的方法同时或相继应用。201.在某些实施方案中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。202.在另一个方面，提供了本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。前述治疗方法中的剂量，剂型，给药途径，适应症，联合治疗等各个方面都可以应用到所述药物的用途中。203.检测方法和试剂盒204.本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合cd33，从而可用于检测cd33在样品中的存在或其水平。205.因此，本发明另一个方面还提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。206.在某些实施方案中，所述试剂盒用于诊断受试者是否患有表达cd33的肿瘤。207.在某些实施方案中，所述表达cd33的肿瘤选自血液学恶性肿瘤。208.在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤是cd33阳性血液恶性肿瘤。209.在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自髓系恶性肿瘤或恶性淋巴瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)、恶性淋巴瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、血小板白血病、难治性贫血、白血病前期综合征、淋巴样白血病、或未分化白血病。在某些实施方案中，所述恶性淋巴瘤选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤，以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。210.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。211.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。212.在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)，例如酶、放射性核素、荧光染料、化学发光物质或生物素。213.在另一个方面，本发明提供了检测cd33在样品中的存在或其量的方法，其包括以下步骤：214.(1)将所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；215.(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与cd33之间复合物的形成或检测所述复合物的量。216.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。217.所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的。218.本发明另一方面还提供了一种用于诊断受试者是否患有表达cd33的肿瘤的方法，其包括使用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段检测cd33在来自所述受试者的样品中的量。219.在某些实施方案中，所述方法还包括：将所述cd33在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较，并确定来自所述受试者的样品的cd33水平是否落入与肿瘤相关的cd33水平内。220.在某些实施方案中，通过以下步骤检测cd33在来自所述受试者的样品中的量：221.(1)将来自所述受试者的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；222.(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与cd33所形成的复合物的量。223.在某些实施方案中，在步骤(1)中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。224.在某些实施方案中，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。225.在某些实施方案中，所述表达cd33的肿瘤选自血液学恶性肿瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤是cd33阳性血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自髓系恶性肿瘤或恶性淋巴瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)、恶性淋巴瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、血小板白血病、难治性贫血、白血病前期综合征、淋巴样白血病、或未分化白血病。在某些实施方案中，所述恶性淋巴瘤选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤，以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。226.在某些实施方案中，所述方法还包括给被诊断为患有表达cd33的肿瘤的受试者施用靶向cd33的免疫疗法。227.在某些实施方案中，所述靶向cd33的免疫疗法包括施用本发明的抗体或其抗原结合片段、偶联物、经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物。228.在某些实施方案中，所述靶向cd33的免疫疗法包括施用表达本发明第六方面所述的嵌合抗原受体的免疫细胞。所述方法包括以下步骤：(1)提供受试者所需的的免疫细胞；(2)将编码本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列导入步骤(1)所述的免疫细胞，以获得表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞以及可选的未改造和/或未成功改造的免疫细胞施用至所述受试者。229.在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断受试者是否患有表达cd33的肿瘤。230.缩略词231.carꢀꢀꢀꢀꢀ嵌合抗原受体232.cdrꢀꢀꢀꢀꢀꢀ免疫球蛋白可变区中的互补决定区233.cdr-h1ꢀꢀꢀ免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区1234.cdr-h2ꢀꢀꢀ免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2235.cdr-h3ꢀꢀꢀ免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区3236.cdr-l1ꢀꢀꢀ免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区1237.cdr-l2ꢀꢀꢀ免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区2238.cdr-l3ꢀꢀꢀ免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区3239.frꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ抗体构架区：抗体可变区中除cdr残基以外的氨基酸残基240.vhꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ抗体重链可变区sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定义。255.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个cdrs，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。256.在本发明中，抗体或其抗原结合片段含有的cdr可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat或imgt编号系统确定。257.如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。258.如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为ꢀ“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括骆驼ig、ignar、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、fd、fv、scfv、di-scfv、(scfv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于holliger等,2005；natbiotechnol,23:1126-1136中。259.如本文中所使用的，术语“fd”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段；术语“dab片段”意指由vh结构域组成的抗体片段(ward等人,nature341:544546(1989))；术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段；术语“fab’片段”意指还原连接f(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的fd片段(由vh和ch1结构域组成)组成。260.如本文中所使用的，术语“fv”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段。fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个cdrs赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的cdrs)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。261.如本文中所使用的，术语“fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。262.如本文中所使用的，术语“scfv”是指，包含vl和vh结构域的单个多肽链，其中所述vl和vh通过接头(linker)相连(参见，例如,bird等人,science242:423-426(1988)；huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988)；和pluckthun，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，roseburg和moore编，springer-verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh‑ꢀcooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情况下，scfv的vh与vl之间还可以存在二硫键。在某些实施方案中，vh和vl结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如，包含nh2-vh-vh-cooh、nh2-vl-vl-cooh的scfv。所述scfv可以形成任何工程上可能的结构，单链抗体(scfv)，串联抗体(tandemdi‑ꢀscfvs)，双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白，骆驼ig、ignar等。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成di-scfv，其指的是两个或两个以上单个scfv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成(scfv)2，其指的是两个或两个以上单个scfv并联而形成抗体。263.如本文中所使用的，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在同一多肽链(vh-vl)中包含连接到轻链可变结构域(vl)的重链可变结构域(vh)。通过使用过短以使得同一链上的两个结构域之间不能配对的连接子，迫使结构域与另一链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体可以是二价的或双特异性的。双功能抗体更全面描述于例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等人,自然医学(nat.med.)9:129-134(2003)；和hollinger等人,pnasusa90:6444‑ꢀ6448(1993)中。三功能抗体和四功能抗体也描述于hudson等人,自然医学9:129-134(2003)中。264.如本文中所使用的，术语“单域抗体(single-domainantibody,sdab)”ꢀ具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力(holt,l.等人,生物技术趋势(trendsinbiotechnology),21(11):484-490，2003)。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。265.上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。266.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。267.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。268.如本文中所使用的，表述“特异性结合”或“特异性针对”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。269.两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见malmqvistm,nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数kd(参见davies等人,annualrevbiochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(spr)在biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或kinexa来测量解离常数。270.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。271.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。272.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。273.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。载体可以包括在细胞中直接自主复制的序列，或可以包括足以允许整合到宿主细胞dna中的序列。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及病毒载体等。病毒载体的非限制性实例包括，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。274.如本文中所使用的，术语“游离型载体”中游离型是指载体能够复制而不整合到宿主的染色体dna中并且不由分裂宿主细胞逐渐丧失，还意指所述载体在染色体外或游离地复制。275.如本文中所使用的，术语“病毒载体”广泛用以指包括典型地促进核酸分子转移或整合到细胞的基因组中的病毒衍生的核酸元件的核酸分子(例如转移质粒)，或介导核酸转移的病毒颗粒。除了核酸之外，病毒颗粒典型地将包括各种病毒组分并且有时还包括宿主细胞组分。276.术语“病毒载体”可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。277.如本文中所使用的，术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。278.如本文中所使用的，术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包括ltr)的病毒载体或质粒。在某些实施方案中，术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”可以用以指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。在本文提及元件(例如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等)时，应理解，这些元件的序列以rna形式存在于本发明的慢病毒颗粒中并且以dna形式存在于本发明的dna质粒中。279.如本文中所使用的，“整合缺陷型”逆转录病毒或慢病毒是指具有不能将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中的整合酶的逆转录病毒或慢病毒。在某些实施方案中，整合酶蛋白突变以特异性降低其整合酶活性。整合缺陷型慢病毒载体可以通过修饰编码整合酶蛋白的pol基因，产生编码整合缺陷型整合酶的突变pol基因而获得。所述整合缺陷型病毒载体已经描述于专利申请wo2006/010834中，所述专利申请以全文引用的方式并入ed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：无菌水，生理盐水，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。288.如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。289.如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤(例如与cd33相关的肿瘤)，或者，具有患有上述疾病的风险。290.如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。291.如本文中使用的，术语“免疫细胞”是指涉及免疫反应例如涉及促进免疫效应子功能的细胞。免疫细胞的实例包括t细胞(例如α/βt细胞和γ/δt细胞)、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞和骨髓来源巨噬细胞。292.本发明所述的免疫细胞可以是自身的/自体的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。如本文中使用的，“自身的”是指来自同一受试者的细胞；“同种异体的”是指与比较细胞遗传不同的同一物种的细胞；“同基因的”是指与比较细胞遗传相同的来自不同受试者的细胞；“异基因的”是指与比较细胞来自不同物种的细胞。在优选实施例中，本发明的细胞是同种异体的。293.可用于本文所述的car的示例性免疫细胞包括t淋巴细胞和/或nk细胞。术语“t细胞”或“t淋巴细胞”是本领域公知的并且意图包括胸腺细胞、未成熟的t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静息t淋巴细胞或活化的t淋巴细胞。t细胞可以是t辅助(th)细胞，例如t辅助1(th1)或t辅助2(th2)细胞。t细胞可以是辅助t细胞(htl；cd4t细胞)cd4t细胞、细胞毒性t细胞(ctl；cd8t细胞)、cd4cd8t细胞、cd4cd8t细胞或任何其它t细胞子组。在某些实施方案中，t细胞可以包括原初t细胞和记忆t细胞。294.本领域技术人员将理解，其它细胞也可以用作具有如本文所述的car的免疫细胞。具体来说，免疫细胞还包括nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞、nkt细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞。免疫细胞还包括免疫细胞的祖细胞，其中所述祖细胞可以在体内或体外经诱导以分化成免疫细胞。因此，在某些实施方案中，免疫细胞包括免疫细胞的祖细胞，例如含于衍生自脐血、骨髓或流动周边血液的cd34 细胞群体内的造血干细胞(hsc)，其在受试者中投与后分化成成熟免疫细胞，或其可以在体外经诱导以分化成成熟免疫细胞。295.如本文中使用的，术语“经改造的免疫细胞”是指，表达本文所述的任何一种car，或导入了本文所述的任何一种分离的核酸或载体的免疫细胞。可以用多种方法将编码car多肽的多核苷酸引入细胞后，也可以在细胞中原位合成car多肽。或者，可以在细胞外生产car多肽，然后将其引入细胞。将多核苷酸构建体引入细胞的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以使用稳定的转化方法将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其他实施方案中，瞬时转化方法可用于瞬时表达多核苷酸构建体，并且多核苷酸构建体未整合到细胞的基因组中。在其它实施方案中，可以使用病毒介导的方法。多核苷酸可以通过任何合适的方法引入细胞，例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)，脂质体等。瞬时转化方法包括，例如但不限于显微注射、电穿孔或微粒轰击。多核苷酸可以包括在载体中，例如质粒载体或病毒载体。296.如本文中使用的，术语“免疫效应子功能”是指免疫效应细胞的增强或促进对靶细胞的免疫攻击(例如对靶细胞的杀伤，或者抑制其生长或增殖)的功能或反应。例如，t细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。297.如本文中使用的，术语“血液学恶性肿瘤”包括淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾癌和淋巴结肿瘤。术语“cd33阳性血液恶性肿瘤”是指特征在于在恶性细胞表面上表达cd33的血液恶性肿瘤。cd33阳性血液恶性肿瘤包括但不限于急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、慢性骨髓单核细胞性白血病、血小板白血病、急性成巨核细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤、髓系肉瘤、肥大细胞增生病症、骨髓增生异常综合征(mds)等。298.发明的有益效果299.本发明提供了靶向cd33的包含本发明的抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体。表达本发明的嵌合抗原受体的免疫效应细胞相比于已知靶向cd33的car-t具有提高的效应子功能(例如，肿瘤杀伤活性以及释放细胞因子活性)。因此，本发明的嵌合抗原受体特别适用于预防和/或治疗血液学恶性肿瘤(例如髓系恶性肿瘤或恶性淋巴瘤)，具有重大的临床价值。300.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。附图说明301.图1-2显示了实施例1中4种scfv-fc(组1-组4)与表达cd33细胞的结合活性检测结果。302.图3显示了实施例1中2种scfv-fc(组1、组2)与cd33结合的octet动力学测定结果。303.图4-图6显示了car-t的细胞水平杀伤活性检测结果。图4，molm‑ꢀ13细胞；图5，hl60细胞；图6，u937细胞。304.图7显示了car-t细胞激活后il-2分泌水平检测结果。305.图8显示了car-t细胞激活后ifn-γ分泌水平检测结果。306.图9显示了经car-t细胞治疗的荷瘤小鼠的生存率曲线。307.序列信息308.本发明涉及的序列信息提供如下：309.310.311.具体实施方式312.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。313.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。314.实施例1：结合人类cd33的特异性单链抗体(scfv)的制备315.1.1基于噬菌体展示的cd33scfv筛选316.(1)取0.5ml全人源噬菌体文库，用生物素化cd33与sv磁珠对其进行筛选，筛选产物通过铺板检测噬菌体滴定。317.(2)取第一轮淘筛产物0.5ml与0.5mlmpbst混合，按上述步骤进行第2轮、第3轮或第4轮淘筛。318.1.2elisa检测单克隆噬菌体319.从噬菌体淘筛产物滴定板中接种单个菌落到96深孔板中，elisa检测单克隆噬菌体。320.1.3cd33-scfv测序321.用于测序的正向和反向引物分别为：pklt1f(seqidno:81)；pklt1r：(seqidno:82)。使用sequcher软件分析序列结果，最终获得11个克隆序列。322.1.4scfv-fc的构建与表征323.(1)分别采用sfii将噬菌体淘筛的11个抗cd33scfv序列从载体pklt1中消化下来，融合fc(seqidno:107)以构建scfv-fc，并与sfii消化的tegx-kal载体连接。将纯化的载体按6ml规模转染expi293细胞，培养4天。用mabselectsureproteinaresin(ge)纯化表达的scfv-fc。在11个抗cd33scfv-fc样品中，7个在sds-page中显示出良好或相对良好的表达。为了选择合适的候选物，通过生物物理分析和细胞结合活性来表征7种纯化的scfv-fc，最终获得4个克隆(组1-组4)，其scfv全长序列分别如seqidnos:83、84、85、86所示，其可变区及cdr序列如下表所示。324.表1：4个克隆(组1-组4)的可变区及cdr序列[0325][0326][0327](2)sec的结果如表2所示，组1、组3、组4样品显示的主峰面积百分比高，纯度较好，组2主峰面积百分比少，纯度较低。[0328]表2：抗cd33scfv-fcsec数据[0329][0330](3)cd33细胞结合试验[0331]为鉴定cd33scfv-fc蛋白结合亲和力，将表达cd33抗原的293t稳定细胞系用于细胞结合测定，野生型293t细胞为阴性对照。从400nm浓度开始，通过连续3次稀释产生一系列抗cd33scfv-fc。流式检测抗cd33scfv-fc与细胞结合情况。图1、图2、表3显示了用于car-t构建的4种scfv-fc的细胞结合结果。4组cd33scfv-fc都能与cd33 细胞结合，组1、组2、组4细胞亲和力优于组3。[0332]表3：抗cd33scfv-fc与表达cd33细胞结合的kd值[0333]组别组1组2组3组4阴性对照kd(nm)4.451.647.36*1033.37不结合[0334]4)octet动力学试验[0335]首先将生物素化的cd33(5μg/ml)加载到抗链霉亲和素生物传感器(streptavidinbiosensor18-5019)上。从10ug/ml的浓度开始将scfv-fc在动力学缓冲液中连续稀释2次。记录不同浓度结合scfv-fc与cd33的反应曲线，并分析结合常数。其中，对标序列来源于gemtuzumab‑ꢀozogamicin的scfv序列。结果图3和表4所示，cd33亲和力组2优于组1。[0336]表4：octet试验结果[0337]组别kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fullr^2组14.55e-095.79e 042.64e-040.9953组28.58e-115.45e 054.67e-050.9734对标《1.0e-126.78e 05《1.0e-070.9769[0338]以上获得的组1～组4scfv也可称为组1～组4scfv(vh-vl)。[0339]基于上述组1～组3scfv序列，进一步构建了三种scfv，命名为组1‑ꢀscfv(vl-vh)、组2-scfv(vl-vh)、组3-scfv(vl-vh)，其全长序列分别如seqidnos:95、97、99所示，并具有vl-linker2-vh所示的结构，其中linker2如seqidno:91所示。[0340]实施例2：慢病毒质粒的构建及病毒包装[0341]1)慢病毒质粒的构建概述：scfv序列经密码子优化后合成并构建到lenti-ef1a-at-free(苏州爱康得有限公司制备)载体，挑取单克隆进行培养及保种，提取质粒进行测序，将测序正确的菌液用于制备慢病毒质粒。[0342]详细地：基于上述实施例中获得的scfv序列，进一步构建car慢病毒表达载体。以cd137的胞内结构域和cd3ζ的itam区作为激活信号，与上述scfv进行融合，同时加上信号肽，cd8铰链区，cd8跨膜区，构建嵌合抗原受体表达载体，并亚克隆至lenti-ef1a-at-free(苏州爱康得有限公司制备)载体中，挑取单克隆进行培养及保种，提取质粒进行测序，将测序正确的菌液用于制备慢病毒质粒。[0343]所构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中从n端到c端各元件氨基酸序列分别如下表5所示。同时，以辉瑞cd33adc药物gemtuzumab‑ꢀozogamicinscfv序列构建car，作为对标car。[0344]表5：嵌合抗原受体中从n端到c端各元件的氨基酸序列[0345][0346]2)病毒包装：[0347]将以上构建的car慢病毒质粒与转染试剂混合液逐滴加入到293t(atcc)细胞中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱；培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。收集连续培养48小时、72小时后的含有病毒的培养基上清，加入peg后4℃过夜沉淀，4000×g4℃离心1小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入300μl病毒冻存液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。[0348]实施例3：car-t细胞制备[0349]3.1原代t细胞分离、激活：[0350](1)采用淋巴细胞分离液分离得到人的pbmc细胞，按细胞液：全能核酸酶＝10ml:1ul的比例加入全能核酸酶，置于37℃，5％co2的培养箱中培养3小时；[0351](2)按pbmc：磁珠＝3:1的比例吸取cd3/cd28磁珠，用hdpbs(含2％人血白蛋白的dpbs)洗涤后用100ulhdpbs重悬于冻存管。[0352](3)收集悬浮细胞于冻存管中，500g离心5min后加入1mlhdpbs重悬细胞，并将细胞悬液转入100ul磁珠中，轻轻混匀，室温下翻转孵育30分钟；[0353](4)将孵育后的混合液插入磁极中，室温静置2分钟，保持冻存管继续留在磁极中，轻轻倒置，将管内的细胞倒出。[0354](5)将细胞重悬于x-vivo15培养基中，并添加300u/mlil-2,5ng/mlil-15和10ng/mlil-7。[0355]3.2病毒感染：[0356](1)按照1×106cells加入200ul病毒液的比例从-80℃冰箱取出病毒，于室温下融化；[0357](2)在六孔板中加入上述病毒液，添加终浓度为5μg/ml的deae，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800g离心1.5小时。[0358](3)离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃5％co2的培养箱中，继续培养24小时。[0359](4)250g离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3-6天备用。[0360](5)制备得到：组1-car(vh-vl)t细胞(简称为组1(vh-vl))、组2-car(vh-vl)t细胞(简称为组2(vh-vl))、组3-car(vh-vl)t细胞(简称为组3(vh-vl))、组4-car(vh-vl)t细胞(简称为组4(vh-vl))、组1-car(vl-vh)t细胞(简称为组1(vl-vh))、组2‑ꢀcar(vl-vh)t细胞(简称为组2(vl-vh))、组3-car(vl-vh)t细胞(简称为组3(vl-vh))。[0361]实施例4：car-t细胞的阳性率检测[0362]编码car的核酸序列在启动子的驱动下表达，使用生物素化cd33抗原对慢病毒转染的t细胞进行标记并通过流式进行测定，反映car在t细胞表面的表达水平。通过如上方法检测实施例3获得的car-t细胞的car阳性率，facs检测结果如下表6所示。结果显示，组1(vh-vl)、组2(vh-vl)、组3(vh-vl)、组4(vh-vl)的car阳性率均大于30％，表明慢病毒转染效应细胞后，成功表达了car，成功构建了表达cd33‑ꢀcar的嵌合抗原受体t细胞。[0363]表6：car的阳性率检测结果[0364]嵌合抗原受体cd33-car阳性率cd33-car组1(vh vl)38.19％cd33-car组2(vh vl)60.07％cd33-car组3(vh vl)35.13％cd33-car组4(vh vl)44.9％[0365]实施例5：car-t细胞对靶细胞的杀伤活性评价[0366]通过测定car-t细胞对靶细胞的裂解能力来评价car-t细胞的杀伤活性，具体步骤如下：[0367]分别使用含20％fbs的imdm培养基、1640培养基将hl60-luc细胞(爱康得生物医学技术(苏州)有限公司)、u937-luc(爱康得生物医学技术(苏州)有限公司)和molm-13-luc(南京科佰生物科技有限公司)细胞密度调整至1×105个/ml，按照100μl/孔的量接种靶细胞至96孔板中，5％co237℃培养箱静置30min。收集car-t，离心收集并用imdm、1640培养基重悬car-t细胞，组1～组4car阳性t细胞、对标car阳性t细胞和未转染病毒的空白t细胞作为效应细胞，按照3:1、1:1、0.33:1的e/t(效应细胞/靶细胞)比例分别加入到含有hl60-luc和molm-13-luc的96孔板中。按照10:1、5:1、2.5:1、1:1的e/t(效应细胞/靶细胞)比例加入到含有u937-luc的96孔板中。100μl/孔，最终体积为200μl/孔，使用空白t细胞调整并使各组t细胞总数保持一致。将96孔板放入5％co237℃培养箱中培养18～24h。培养结束后，将孔板从培养箱中取出，加入20ul荧光检测试剂，使用酶标仪检测荧光读值。将上述处理后的数据使用graphpad进行作图。[0368]基于组1～组4scfv(vh-vl)构建的car-t的杀伤活性检测结果如图4～图6。图4的结果显示，组2(vh-vl)、组3(vh-vl)、组4(vh-vl)对molm-13细胞均有较强的杀伤作用，组2(vh-vl)杀伤最强。图5的结果显示，组1(vh-vl)、组2(vh-vl)、组3(vh-vl)、组4(vh-vl)对hl60细胞均有较强的杀伤作用，组1(vh-vl)杀伤最强。图6的结果显示，组1(vh-vl)对u937细胞有较强的杀伤作用，组2(vh-vl)对u937有较弱杀伤。[0369]实施例6：car-t细胞细胞因子释放[0370]收集u937-luc细胞，分别使用培养基调整细胞密度至1×105个/ml，按照100μl/孔的量接种靶细胞于96孔板中，并用培养基重悬car-t细胞，组1～组4car阳性t细胞、对标car阳性t细胞和未转染病毒的空白t细胞作为效应细胞，按照3:1、1:1、0.33:1的e/t(效应细胞/靶细胞)比例分别加入到含有hl60-luc、u937-luc和molm-13-luc的96孔板中，100μl/孔，最终体积为200μl/孔，使用空白t细胞调整并使各组t细胞总数保持一致。5％co237℃培养箱中培养过夜。培养结束后，将孔板从培养箱中取出，离心，取上清，使用htrf(il2和ifn-γ)检测细胞因子释放。检测结果如图7、图8所示，组1(vh-vl)、组3(vh-vl)均能分泌ifn-γ和il2，组1(vh-vl)分泌量较高，且优于对标。[0371]实施例7：体内模型评估car-t细胞对靶细胞的杀伤能力[0372]将体重、大小均一的健康nsg小鼠(购自百奥赛图)随机分为5组，组1(vh-vl)、组2(vh-vl)、组3(vh-vl)及空白t组各5只，对标组2只。尾静脉注射接种u937细胞1×106cells/只。3天后，将制备好的car-t细胞复苏，用pbs重悬后，按5×106car阳性t细胞/只接种小鼠，使用空白t细胞调整细胞数，保证各组注射总t细胞数一致，注射细胞液体积一致。结果如下图9所示，组1(vh-vl)、组2(vh-vl)处理后小鼠生存期显著延长(组1＞60天，组256天，对标17天，空白t16天)。[0373]尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体而言，本发明涉及特异性结合cd33的抗体或其抗原结合片段以及包含所述抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(car)及偶联物。本发明还涉及编码这种car的序列和表达载体，包括这种car的经改造的免疫细胞以及制备这种经改造的免疫细胞的方法。本发明还涉及这些抗体、偶联物、car和经改造的免疫细胞如t细胞、nk细胞用于治疗急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)等髓系恶性肿瘤和恶性淋巴瘤的用途及方法。
背景技术：
：：2.aml是一种常见的血液恶性肿瘤，是国内高发的恶性肿瘤之一，发病率为1.6～2.3/10万人，而且有逐年增加的趋势，可发生于任何年龄，起病急骤，进展迅速，自然存活期6月-1年，已成为严重威胁人生命健康的一种凶险性疾病。随着联合化疗、hsct、靶向治疗的广泛展开，该病的缓解率较以往有了显著提高，但整体长期生存率仍未达到预期目标，主要面临着化疗耐药及缓解后早期复发的问题。复发/难治性aml的治疗仍然是临床面临的重大挑战。3.细胞治疗是目前治疗肿瘤的创新疗法，靶向cd19、bcma的car-t疗法在治疗b细胞恶性肿瘤中已取得显著疗效。在治疗aml领域，许多肿瘤相关抗原已被用于car-t疗法，包括cd33、clec12a、cd44v6、emr2、tim3、cd70、lewisyantigen、cd123、叶酸受体-β、flt3receptor(cd135)和cll-1(clec12a)。但迄今为止，尚无单一抗原被证明是aml细胞和白血病干细胞所特有的。4.cd33是一种跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的一个成员，有两个免疫球蛋白样胞外结构域，同时与唾液酸黏附酶、cd22及髓磷脂结合糖蛋白共同组成了黏附素家族，cd33配体是唾液酸。cd33是髓系细胞的特异性抗原，表达在造血细胞亚群中，在正常造血干/祖细胞也有少量表达。cd33在约90％的aml患者中表达，该靶点主要应用于治疗aml。5.第一个靶向cd33的单克隆抗体对aml的疗效微乎其微。靶向cd33的抗体-药物结合物gemtuzumab-ozagamicin于2000年获得fda的批准，该药物上市后由于毒性问题被辉瑞撤回，调整剂量后显示出临床优势，于2017年重新上市。使用gemtuzumab-ozagamicin产生了较强的骨髓抑制作用和肝脏毒性。6.基于cd33的表达特异性，针对cd33的car-t细胞治疗有希望成为攻克aml等血液学恶性肿的方式之一。因此，发展具有高特异性和良好疗效的靶向cd33的car-t疗法是迫切而必要的。技术实现要素：7.在本技术中，发明人首先开发了具有优良性质的能够特异性识别/结合cd33的全人源抗体，在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，进一步构建获得了能够特异性结合cd33的嵌合抗原受体(car)。本发明的car能够以非mhc限制的方式将免疫效应细胞特异性和反应性指向表达cd33的细胞从而使其被清除，且与已知的靶向cd33的car相比具有更优的功能特性。因此，本发明的car具有用于预防和/或治疗aml、cml、mds、恶性淋巴瘤等cd33相关肿瘤的潜力，具有重大的临床价值。8.本发明的抗体9.本发明第一方面提供了一种能够特异性结合cd33的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：10.(1a)如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：3或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：4或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：5或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：6或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：7或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；11.或12.(1b)如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：9或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：10或其变体的cdr‑ꢀh2；序列为seqidno：11或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：12或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：13或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；13.或14.(2a)如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：16或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：17或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：18或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：19或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：20或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；15.或16.(2b)如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：22或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：23或其变体的cdr‑ꢀh2；序列为seqidno：24或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：25或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：26或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；17.或18.(3a)如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：29或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：30或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：31或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：32或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：33或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；19.或20.(3b)如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：35或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：36或其变体的cdr‑ꢀh2；序列为seqidno：37或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：38或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；21.或22.(4a)如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：42或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：43或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：44或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：45或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：46或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；23.或24.(4b)如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：48或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：49或其变体的cdr‑ꢀh2；序列为seqidno：50或其变体的cdr-h3；和/或，如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：51或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；25.其中，(1a)、(1b)、(2a)、(2b)、(3a)、(3b)、(4a)、(4b)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。26.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包括来自人的构架区(frs)。27.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人cd33。28.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：29.(a)如下六个根据kabat编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：3或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：4或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：5或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：6或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：7或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；或30.(b)如下六个根据imgt编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：9或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：10或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：11或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：12或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：13或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；31.其中，(a)或(b)中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。32.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：33.具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh和/或具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。34.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：35.(a)如下六个根据kabat编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：16或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：17或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：18或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：19或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：20或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；或36.(b)如下六个根据imgt编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：22或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：23或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：24或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：25或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：26或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；37.其中，(a)或(b)中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。38.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：39.具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh和/或具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。40.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：41.(a)如下六个根据kabat编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：29或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：30或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：31或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：32或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：33或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；或42.(b)如下六个根据imgt编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：35或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：36或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：37或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：38或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；43.其中，(a)或(b)中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。44.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：45.具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh和/或具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。46.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：47.(a)如下六个根据kabat编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：42或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：43或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：44或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：45或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：46或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；或48.(b)如下六个根据imgt编号系统所定义的重链和轻链cdrs：序列为seqidno：48或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：49或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：50或其变体的cdr-h3；序列为seqidno：51或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；49.其中，(a)或(b)中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。50.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：51.具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh和/或具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。52.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自骆驼ig、ignar、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、单链抗体(例如scfv、di-scfv或(scfv)2)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白(dsfv)和单结构域抗体(sdab，纳米抗体)。53.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体，例如scfv、di-scfv或(scfv)2。在某些实施方案中，所述单链抗体从n端至c端包含：54.(1)具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh；或55.(2)具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh；或56.(3)具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh；或57.(4)具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh；58.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。59.在某些实施方案中，所述连接子为多肽。在某些实施方案中，所述连接子包含一个或几个(例如1个、2个或3个)如(gms)n所示的序列，其中m选自1-6的整数，n选自1-6的整数。优选地，m为3、4、或5；优选地，n为1或2。更优选地，所述连接子具有seqidno：60所示或seqidno：91所示的序列。60.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为包含选自下列的氨基酸序列的scfv：(1)seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列；(2)与seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；或(3)与seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。61.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。62.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(ch)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，63.所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(cl)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。64.在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg、igm、ige、igd或iga重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。65.在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。在某些优选的实施方案中，所述轻链恒定区是人κ轻链恒定区。66.抗体的制备67.本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的dna分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。68.本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见morimotoetal.,j.biochem.biophys.methods24:107-117(1992)andbrennanetal.,science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewedinhudson,curr.opin.immunol.11:548‑ꢀ557(1999)；littleetal.,immunol.today,21:364-370(2000))。比如，fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将fab’片段化学偶联形成f(ab’)2片段(carteretal.,bio/technology,10:163-167(1992))。另外，fv、fab或f(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。69.因此，本发明第二方面提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。70.本发明第三方面提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。71.本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。72.在另一个方面，本发明还涉及制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。73.偶联物74.本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用于制备偶联物。因此，本发明第五方面还提供了一种偶联物，其包含前述的抗体或其抗原结合片段及与所述抗体或其抗原结合片段偶联的偶联部分(couplingmoiety)，所述偶联部分选自:放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶、多肽、蛋白、聚乙二醇(peg)，核素，核酸，小分子毒素，受体或配体。在某些实施方案中，所述偶联部分选自能够抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡或坏死的活性物质。75.嵌合抗原受体(car)76.本发明涉及靶向cd33的car，其特征包括非mhc限制的cd33识别能力，其赋予表达该car的免疫细胞(例如，t细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)不依赖于抗原加工及提呈而识别表达cd33的细胞的能力。77.因此，本发明第六方面提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包含抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域。78.i.抗原结合结构域79.本发明的嵌合抗原受体中所包含的抗原结合结构域赋予所述car识别cd33的能力。80.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含能够特异性结合cd33(例如人cd33)的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。81.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含vh和vl，其中，82.所述vh包含如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：3或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：4或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：5或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：6或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：7或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；或者，83.所述vh包含如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：9或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：10或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：11或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：12或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：13或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：8或其变体的cdr-l3；84.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。85.在某些实施方案中，所述vh包含如seqidno:1所示的序列或其变体，所述vl包含如seqidno:2所示的序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。86.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含vh和vl，其中，87.所述vh包含如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：16或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：17或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：18或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：19或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：20或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；或者，88.所述vh包含如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：22或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：23或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：24或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：25或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：26或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：21或其变体的cdr-l3；89.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。90.在某些实施方案中，所述vh包含如seqidno:14所示的序列或其变体，所述vl包含如seqidno:15所示的序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。91.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含vh和vl，其中，92.所述vh包含如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：29或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：30或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：31或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：32或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：33或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；或者，93.所述vh包含如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：35或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：36或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：37或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：38或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：34或其变体的cdr-l3；94.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。95.在某些实施方案中，所述vh包含如seqidno:27所示的序列或其变体，所述vl包含如seqidno:28所示的序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。96.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含vh和vl，其中，97.所述vh包含如下三个根据kabat编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：42或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：43或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：44或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据kabat编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：45或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：46或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；或者，98.所述vh包含如下三个根据imgt编号系统所定义的重链cdrs：序列为seqidno：48或其变体的cdr-h1；序列为seqidno：49或其变体的cdr-h2；序列为seqidno：50或其变体的cdr-h3；所述vl包含如下三个根据imgt编号系统所定义的轻链cdrs：序列为seqidno：51或其变体的cdr-l1；序列为seqidno：39或其变体的cdr-l2；序列为seqidno：47或其变体的cdr-l3；99.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。100.在某些实施方案中，所述vh包含如seqidno:40所示的序列或其变体，所述vl包含如seqidno:41所示的序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。101.在某些实施方案中，以上任一实施方案中所述的抗原结合结构域所包含的抗体或其抗原结合片段选自骆驼ig、ignar、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、单链抗体(例如scfv、di-scfv或(scfv)2)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白(dsfv)和单结构域抗体(sdab，纳米抗体)。102.在某些实施方案中，以上任一实施方案中所述的抗原结合结构域为单链抗体，例如scfv、di-scfv或(scfv)2。103.在某些实施方案中，以上任一实施方案中所述的抗原结合结构域所包含的vh和vl、或所述抗原结合结构域所包含的抗体或其抗原结合片段的vh和vl通过连接子连接。104.在某些实施方案中，所述连接子通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头，例如富含甘氨酸和丝氨酸的一种肽接头。接头包括富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下苏氨酸的那些接头。在一些实施方案中，接头还包括带电荷的残基(如赖氨酸和/或谷氨酸)，其可以改善溶解性。在一些实施方案中，接头还包括一个或多个脯氨酸。富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少为或约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸组成。示例性的连接子包含一个或几个(例如1个、2个或3个)如(gms)n所示的序列，其中m选自1-6的整数，n选自1-6的整数。在某些实施方案中，m为3、4、或5。示例性的连接子包括具有一个或多个重复的ggggs或gggs的接头。在某些实施方案中，n为1或2。在某些示例性实施方案中，所述连接子包括seqidno：91所示的序列。在某些示例性实施方案中，所述连接子具有seqidno：60或seqidno：91的序列。105.在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含单链抗体，所述单链抗体从其n端至c端包括：106.(1)具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:2所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:1所示的序列或其变体的vh；或107.(2)具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:15所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:14所示的序列或其变体的vh；或108.(3)具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:28所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:27所示的序列或其变体的vh；或109.(4)具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh-连接子-具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl；或具有如seqidno:41所示的序列或其变体的vl-连接子-具有如seqidno:40所示的序列或其变体的vh；110.其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。111.在某些示例性实施方案中，所述抗原结合结构域包含单链抗体，所述单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列；(2)与seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；或(3)与seqidnos:83、84、85、86、95、97和99任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。112.在某些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体的抗原结合结构域可以进一步包括结合选自下列的靶点的抗原结合结构域：cd44v6、emr2、tim3、cd70、lewisy抗原、cd123、叶酸受体-β、flt3受体(cd135)和cll-1(clec12a)。113.ii.跨膜结构域114.本发明的嵌合抗原受体所包含的跨膜结构域可以是本领域已知的任何蛋白结构，只要其能够在细胞膜(特别是真核细胞膜)中热力学稳定。适用于本发明的car的跨膜结构域可衍生自天然来源。在此类实施方案中，所述跨膜结构域可衍生自任何膜结合的或跨膜的蛋白质。或者，所述跨膜结构域可为合成的非天然存在的蛋白质区段，例如主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸的蛋白质区段。115.在某些实施方案中，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：t细胞受体的α、β或ζ链、cd3ε、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd28、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154和pd-1及其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：cd8α、cd4、pd-1、cd152和cd154。在某些优选的实施方案中，所述跨膜结构域包含cd8α的跨膜区。在某些示例性实施方案中，所述跨膜结构域包含如seqidno:64所示的氨基酸序列。116.iii.间隔结构域117.本发明的嵌合抗原受体所包含间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间。118.在某些实施方案中，所述间隔结构域包含免疫球蛋白(例如igg1或igg4)的ch2和ch3区。在此类实施方案中，不受特定理论的约束，认为ch2和ch3使所述car的抗原结合结构域从表达car的细胞的细胞膜延伸出去，并且可更精确地模拟天然tcr的大小和结构域结构。119.在某些实施方案中，所述间隔结构域包含铰链结构域。铰链结构域可以是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，其可以允许蛋白质具有柔性并且允许一个或两个结构域相对于彼此的运动。因此，所述铰链结构域可以是任何氨基酸序列，只要其能够提供胞外抗原结合结构域的这种柔性以及其相对于跨膜结构域的这种运动性。120.在某些实施方案中，所述铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。在某些实施方案中，所述铰链结构域包含cd8α的铰链区或其部分，例如含有cd8α的铰链区的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。在某些示例性实施方案中，所述间隔结构域包含seqidno:62所示的氨基酸序列。121.iv.信号肽122.在某些实施方案中，本发明的car可进一步在其n端包含信号肽。通常，信号肽是将与其连接的序列靶向至所需位点的多肽序列。在某些实施方案中，所述信号肽可以将与其连接的car靶向至细胞的分泌途径，并允许该car进一步整合并锚定到脂质双分子层中。可用于car的信号肽是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，所述信号肽包含重链信号肽(例如igg1的重链信号肽)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2(gm-csfr2)信号肽、il2信号肽或cd8α信号肽。在某些优选的实施方案中，所述信号肽选自cd8α信号肽。在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含seqidno:72所示的氨基酸序列。123.v.胞内信号传导结构域124.本发明的car中所包含的胞内信号传导结构域参与将本发明的car与cd33的结合所产生的信号传导进免疫效应细胞内部，激活表达car的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能，或增强表达car的免疫效应细胞的至少一种细胞因子的分泌(例如il-2，ifn-γ)。125.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。126.在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域可以是包含免疫受体酪氨酸活化基序(itam)的任何胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(itam)。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含选自下列的蛋白的胞内信号传导结构域：cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cds、cd22、cd79a、cd79b或cd66d。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含cd3ζ的胞内信号传导结构域。127.在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激分子的胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含选自下列的蛋白的胞内信号传导结构域：card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd150(slamf1)、cd270(hvem)、cd278(icos)或dap10。128.在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域选自cd28的胞内信号传导结构域、或cd137(4-1bb)的胞内信号传导结构域、或二者片段的组合。129.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含一个共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含两个或更多个共刺激信号传导结构域。在此类实施方案中，所述两个或更多个共刺激信号传导结构域可以是相同的，也可以是不同的。130.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域。所述初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域可以以任意顺序串联至跨膜结构域的羧基端。131.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域可包含cd3ζ的胞内信号传导结构域和cd137的胞内信号传导结构域。在某些示例性实施方案中，所述cd3ζ的胞内信号传导结构域包含seqidno:68所示的氨基酸序列。在某些示例性实施方案中，所述cd137的胞内信号传导结构域包含seqidno:66所示的氨基酸序列。132.在某些示例性实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域具有seqidno：70所示序列。133.vi.全长car134.本发明提供了能够特异性地结合cd33的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体从其n端至c端依次包含信号肽、抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域。在某些优选实施方案中，其中所述胞内信号传导结构域从n端到c端为共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。135.在某些实施方案中，所述间隔结构域包含cd8(例如cd8α)的铰链区，其具有seqidno：62所示序列。在某些实施方案中，所述跨膜结构域包含cd8(例如cd8α)的跨膜区，其具有seqidno：64所示序列。136.在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中初级信号传导结构域包含cd3ζ的胞内信号传导结构域，其具有seqidno：68所示序列。共刺激信号传导结构域包含cd137的胞内信号传导结构域，其具有seqidno：66所示序列。在某些优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域具有seqidno：70所示序列。137.在某些优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体从其n端至c端依次包含所述信号肽、胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域(从n端到c端为共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域)。138.在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含igg1的重链信号肽或cd8α信号肽。在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含cd8α信号肽，其具有seqidno：72所示序列。139.在某些示例性实施方案中，本发明的car包含选自下列的氨基酸序列：140.(1)seqidnos:73、75、77、79、95、97、99任一项所示的氨基酸序列；141.(2)与seqidnos:73、75、77、79、95、97、99任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或者，142.(3)与seqidnos:73、75、77、79、95、97、99任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；143.其中，(2)或(3)中所述的序列基本保留了其所源自的氨基酸序列的至少一种生物学活性(例如，能够以非mhc限制的方式将免疫效应细胞的特异性和反应性指向表达cd33的细胞的能力)。144.在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。145.嵌合抗原受体的制备146.生成嵌合抗原受体以及包含该嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如t细胞)的方法是本领域已知的，可包括用至少一种编码car的多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达多核苷酸。例如，可将编码本发明的car的核酸分子包含于表达载体(例如，慢病毒载体)中，所述表达载体能够在宿主细胞例如t细胞中表达，以制造所述car。147.因此，本发明第七方面提供了一种分离的核酸分子，其包含编码第六方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。148.本领域技术人员理解，由于遗传密码的简并性，编码一种本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列可以具有多种不同的序列。因此，除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。149.在某些示例性实施方案中，所述编码第六方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列选自：(1)seqidno:74、76、78、80、96、98、100所示的序列或其简并变体；(2)与(1)所述的序列相比基本上相同的序列，例如，与(1)所述相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列，或，与(1)所述的序列相比具有一个或更多个核苷酸取代的序列；并且所述序列基本保留了其所源自的核苷酸序列的至少一种生物学活性(例如，能够编码具有以非mhc限制的方式将免疫效应细胞的特异性和反应性指向表达cd33的细胞的能力)。150.本发明第八方面提供了一种载体，其包含第七方面所述的分离的核酸分子。151.在某些实施方案中，所述载体选自dna载体，rna载体，质粒，转座子载体，crispr/cas9载体，病毒载体。152.在某些实施方案中，所述载体是表达载体。153.在某些实施方案中，所述载体是游离型载体。154.在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。155.在某些示例性实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。156.在某些实施方案中，所述载体是游离型或非整合病毒载体，例如整合缺陷型逆转录病毒或慢病毒。157.本发明第九方面提供了制备表达本发明的嵌合抗原受体的细胞的方法，其包括：(1)提供宿主细胞；(2)将如第七方面所述的分离的核酸分子或包含所述核酸分子的载体引入所述宿主细胞，以获得能够表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞。158.在某些实施方案中，所述宿主细胞是免疫细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及这些细胞的任意组合。159.在某些实施方案中，在步骤(1)中，所述免疫细胞提供自患者或者健康供体，并且经过预处理；所述预处理包括免疫细胞的分选、激活和/或增殖；在某些实施方案中，所述预处理包括将免疫细胞与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触，从而刺激所述免疫细胞并诱导其增殖，由此生成经预处理的免疫细胞。160.在某些实施方案中，在步骤(2)中，将核酸分子或载体通过病毒感染引入免疫细胞。在某些实施方案中，在步骤(2)中将核酸分子或载体通过非病毒载体转染的方式引入免疫细胞，如通过转座子的载体系统、crispr/cas9载体、talen方法、zfn方法、电穿孔方法、磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染或显微注射等方法。161.在某些实施方案中，在步骤(2)之后，所述方法还包括：扩增步骤(2)获得的免疫细胞。162.经改造的免疫细胞163.通过本发明第九方面提供的方法可将来源于患者或健康供体的免疫细胞改造为表达特异性结合cd33的car的免疫细胞。164.因此，本发明第十方面还提供了一种经改造的免疫细胞，其表达本发明的特异性结合cd33的car。165.在某些实施方案中，所述经改造的免疫细胞包含第七方面所述的分离的核酸分子或包含所述核酸分子的载体。166.在某些实施方案中，所述免疫细胞来源于患者或健康供体的t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。这些免疫细胞被通过第九方面所提供的方法导入如第七方面所述的分离的核酸分子或第八方面所述的载体从而制备为经改造的免疫细胞。167.在某些实施方案中，经改造的免疫细胞可以具有cd33靶点以外的结合特异性，如经改造的免疫细还结合cd44v6、emr2、tim3、cd70、lewisy抗原、cd123、叶酸受体-β、flt3受体(cd135)或cll-1(clec12a)。168.免疫细胞组合物169.在第十一方面，本发明还提供了免疫细胞组合物，所述免疫细胞组合物包括前述经改造的免疫细胞，以及可选的未改造和/或未成功改造的免疫细胞，这些未改造和/或未成功改造的免疫细胞不表达特异性针对cd33的car。限制于当前的技术水平及一些未知的原因，并不是所有免疫细胞经过改造都能表达特异性针对cd33的car。而且不表达car的免疫细胞也有一定的生物学活性，因此免疫细胞组合物可以含有表达和不表达特异性针对cd33的car的免疫细胞，该免疫细胞组合物依然能够满足临床应用的需求。170.在某些实施方案中，经改造的表达特异性针对cd33的car的免疫细胞占免疫细胞组合物总细胞数的大约10％-100％，优选地40％-80％。171.在某些实施方案中，免疫细胞组合物被培养成免疫细胞系，因此，另一方面，本发明还提供了含有免疫细胞组合物的免疫细胞系。172.在另一个方面，本发明提供了制备特异性结合cd33的嵌合抗原受体，或用于制备表达所述嵌合抗原受体的细胞的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括第七方面所述的分离的核酸分子或第八方面所述的载体，和必要的溶剂，如无菌水，生理盐水，或细胞培养液，如lb培养液，如elitecell原代t淋巴细胞培养体系(产品编号：primed-elitecell-024)，以及可选的，还包括使用说明书。173.在另一个方面，本发明提供了前述试剂盒用于制备能够特异性结合cd33的嵌合抗原受体、或表达所述嵌合抗原受体的细胞的应用。174.药物组合物175.在第十二方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。176.在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如具有抗肿瘤活性的药物(例如化疗药物)。177.在某些实施方案中，本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物与所述另外的药学活性剂(例如具有抗肿瘤活性的药物)组合施用，例如可以同时、分开或相继施用。178.在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含：第七方面所述的分离的核酸分子、或第八方面所述的载体。179.在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含：第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物。180.在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含：第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物。181.本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。182.本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物通过静脉注射或推注给予。183.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。184.治疗方法及用途185.在另一方面，本发明提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物。186.在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物。187.在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明第六方面所述的嵌合抗原受体、第七方面所述的分离的核酸分子、第八方面所述的载体、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物。188.在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(1)提供所述受试者所需的免疫细胞(例如t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、或这些细胞的任意组合)；(2)将包含本发明第七方面所述的分离的核酸分子或第八方面所述的载体导入步骤(1)所述的免疫细胞，以获得表达所述嵌合抗原受体的细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞施用至所述受试者以进行治疗。189.在某些实施方案中，所述方法通过剂量分次，例如一次，两次，三次或更多次分开施用部分剂量，向所述受试者施用表达本发明的car的免疫细胞，例如在治疗的第一天施用总剂量的第一百分比，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的第二百分比，例如在随后的(例如第三，第四，第五，第六，第七，第八，第九，第十或更晚)治疗日施用总剂量的第三百分比(例如，剩余百分比)。190.在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的10％的细胞，在第二天施用总剂量的30％的细胞，并且在第三天施用总剂量的剩余60％的细胞。191.在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的50％的细胞，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的50％的细胞。在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的1/3的细胞，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的1/3的细胞，在随后的(例如第三，第四，第五，第六，第七，第八，第九，第十或更晚)施用总剂量的1/3的细胞。192.在某些实施方案中，总细胞剂量包含1×107至10×108个car阳性免疫细胞，例如包含(1-5)×107至(5-10)×108个car阳性免疫细胞。193.在某些实施方案中，医师可以根据病人的状态，肿瘤的大小和阶段，或联合治疗的药物等临床情况来调节剂量或治疗方案。194.在某些实施方案中，所述肿瘤是血液学恶性肿瘤。195.在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤是cd33阳性血液恶性肿瘤。196.在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自髓系恶性肿瘤或恶性淋巴瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)、恶性淋巴瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、血小板白血病、难治性贫血、白血病前期综合征、淋巴样白血病、或未分化白血病。197.在某些实施方案中，所述恶性淋巴瘤选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤，以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。198.在某些实施方案中，将本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物与另外的试剂联合施用。在某些实施方案中，所述另外的试剂包括(i)增加包含car核酸或car多肽的细胞(例如表达本发明的car的免疫细胞，本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物)的功效的作用剂；(ii)改善与施用包含car核酸或car多肽的细胞(例如表达本发明的car的免疫细胞，本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物)相关的一种或多种副作用的作用剂；(iii)具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂。这些试剂可以与本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物，同时(以相同或分开的组合物)、或依序给予。199.本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物还可以与其他疗法组合使用。因此，在某些实施方案中，以上所述方法还包括向所述受试者施用第二疗法，所述第二疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、dna疗法、rna疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法及其任意组合。200.在某些实施方案中，所述第二疗法可以与以上所述的方法分开或联合应用；或，所述第二疗法可以与以上所述的方法同时或相继应用。201.在某些实施方案中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。202.在另一个方面，提供了本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第五方面所述的偶联物、第六方面所述的嵌合抗原受体、第二方面或第七方面所述的分离的核酸分子、第三方面或第八方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞、第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十一方面所述的免疫细胞组合物、或第十二方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。前述治疗方法中的剂量，剂型，给药途径，适应症，联合治疗等各个方面都可以应用到所述药物的用途中。203.检测方法和试剂盒204.本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合cd33，从而可用于检测cd33在样品中的存在或其水平。205.因此，本发明另一个方面还提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。206.在某些实施方案中，所述试剂盒用于诊断受试者是否患有表达cd33的肿瘤。207.在某些实施方案中，所述表达cd33的肿瘤选自血液学恶性肿瘤。208.在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤是cd33阳性血液恶性肿瘤。209.在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自髓系恶性肿瘤或恶性淋巴瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)、恶性淋巴瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、血小板白血病、难治性贫血、白血病前期综合征、淋巴样白血病、或未分化白血病。在某些实施方案中，所述恶性淋巴瘤选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤，以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。210.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。211.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。212.在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)，例如酶、放射性核素、荧光染料、化学发光物质或生物素。213.在另一个方面，本发明提供了检测cd33在样品中的存在或其量的方法，其包括以下步骤：214.(1)将所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；215.(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与cd33之间复合物的形成或检测所述复合物的量。216.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。217.所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的。218.本发明另一方面还提供了一种用于诊断受试者是否患有表达cd33的肿瘤的方法，其包括使用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段检测cd33在来自所述受试者的样品中的量。219.在某些实施方案中，所述方法还包括：将所述cd33在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较，并确定来自所述受试者的样品的cd33水平是否落入与肿瘤相关的cd33水平内。220.在某些实施方案中，通过以下步骤检测cd33在来自所述受试者的样品中的量：221.(1)将来自所述受试者的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；222.(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与cd33所形成的复合物的量。223.在某些实施方案中，在步骤(1)中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。224.在某些实施方案中，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。225.在某些实施方案中，所述表达cd33的肿瘤选自血液学恶性肿瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤是cd33阳性血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自髓系恶性肿瘤或恶性淋巴瘤。在某些实施方案中，所述血液学恶性肿瘤选自急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)、恶性淋巴瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、血小板白血病、难治性贫血、白血病前期综合征、淋巴样白血病、或未分化白血病。在某些实施方案中，所述恶性淋巴瘤选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤，以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。226.在某些实施方案中，所述方法还包括给被诊断为患有表达cd33的肿瘤的受试者施用靶向cd33的免疫疗法。227.在某些实施方案中，所述靶向cd33的免疫疗法包括施用本发明的抗体或其抗原结合片段、偶联物、经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物。228.在某些实施方案中，所述靶向cd33的免疫疗法包括施用表达本发明第六方面所述的嵌合抗原受体的免疫细胞。所述方法包括以下步骤：(1)提供受试者所需的的免疫细胞；(2)将编码本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列导入步骤(1)所述的免疫细胞，以获得表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞以及可选的未改造和/或未成功改造的免疫细胞施用至所述受试者。229.在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断受试者是否患有表达cd33的肿瘤。230.缩略词231.carꢀꢀꢀꢀꢀ嵌合抗原受体232.cdrꢀꢀꢀꢀꢀꢀ免疫球蛋白可变区中的互补决定区233.cdr-h1ꢀꢀꢀ免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区1234.cdr-h2ꢀꢀꢀ免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2235.cdr-h3ꢀꢀꢀ免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区3236.cdr-l1ꢀꢀꢀ免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区1237.cdr-l2ꢀꢀꢀ免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区2238.cdr-l3ꢀꢀꢀ免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区3239.frꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ抗体构架区：抗体可变区中除cdr残基以外的氨基酸残基240.vhꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ抗体重链可变区sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定义。255.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个cdrs，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。256.在本发明中，抗体或其抗原结合片段含有的cdr可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat或imgt编号系统确定。257.如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。258.如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为ꢀ“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括骆驼ig、ignar、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、fd、fv、scfv、di-scfv、(scfv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于holliger等,2005；natbiotechnol,23:1126-1136中。259.如本文中所使用的，术语“fd”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段；术语“dab片段”意指由vh结构域组成的抗体片段(ward等人,nature341:544546(1989))；术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段；术语“fab’片段”意指还原连接f(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的fd片段(由vh和ch1结构域组成)组成。260.如本文中所使用的，术语“fv”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段。fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个cdrs赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的cdrs)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。261.如本文中所使用的，术语“fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。262.如本文中所使用的，术语“scfv”是指，包含vl和vh结构域的单个多肽链，其中所述vl和vh通过接头(linker)相连(参见，例如,bird等人,science242:423-426(1988)；huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988)；和pluckthun，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，roseburg和moore编，springer-verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh‑ꢀcooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情况下，scfv的vh与vl之间还可以存在二硫键。在某些实施方案中，vh和vl结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如，包含nh2-vh-vh-cooh、nh2-vl-vl-cooh的scfv。所述scfv可以形成任何工程上可能的结构，单链抗体(scfv)，串联抗体(tandemdi‑ꢀscfvs)，双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白，骆驼ig、ignar等。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成di-scfv，其指的是两个或两个以上单个scfv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成(scfv)2，其指的是两个或两个以上单个scfv并联而形成抗体。263.如本文中所使用的，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在同一多肽链(vh-vl)中包含连接到轻链可变结构域(vl)的重链可变结构域(vh)。通过使用过短以使得同一链上的两个结构域之间不能配对的连接子，迫使结构域与另一链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体可以是二价的或双特异性的。双功能抗体更全面描述于例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等人,自然医学(nat.med.)9:129-134(2003)；和hollinger等人,pnasusa90:6444‑ꢀ6448(1993)中。三功能抗体和四功能抗体也描述于hudson等人,自然医学9:129-134(2003)中。264.如本文中所使用的，术语“单域抗体(single-domainantibody,sdab)”ꢀ具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力(holt,l.等人,生物技术趋势(trendsinbiotechnology),21(11):484-490，2003)。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。265.上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。266.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。267.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。268.如本文中所使用的，表述“特异性结合”或“特异性针对”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。269.两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见malmqvistm,nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数kd(参见davies等人,annualrevbiochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(spr)在biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或kinexa来测量解离常数。270.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。271.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。272.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。273.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。载体可以包括在细胞中直接自主复制的序列，或可以包括足以允许整合到宿主细胞dna中的序列。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及病毒载体等。病毒载体的非限制性实例包括，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。274.如本文中所使用的，术语“游离型载体”中游离型是指载体能够复制而不整合到宿主的染色体dna中并且不由分裂宿主细胞逐渐丧失，还意指所述载体在染色体外或游离地复制。275.如本文中所使用的，术语“病毒载体”广泛用以指包括典型地促进核酸分子转移或整合到细胞的基因组中的病毒衍生的核酸元件的核酸分子(例如转移质粒)，或介导核酸转移的病毒颗粒。除了核酸之外，病毒颗粒典型地将包括各种病毒组分并且有时还包括宿主细胞组分。276.术语“病毒载体”可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。277.如本文中所使用的，术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。278.如本文中所使用的，术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包括ltr)的病毒载体或质粒。在某些实施方案中，术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”可以用以指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。在本文提及元件(例如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等)时，应理解，这些元件的序列以rna形式存在于本发明的慢病毒颗粒中并且以dna形式存在于本发明的dna质粒中。279.如本文中所使用的，“整合缺陷型”逆转录病毒或慢病毒是指具有不能将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中的整合酶的逆转录病毒或慢病毒。在某些实施方案中，整合酶蛋白突变以特异性降低其整合酶活性。整合缺陷型慢病毒载体可以通过修饰编码整合酶蛋白的pol基因，产生编码整合缺陷型整合酶的突变pol基因而获得。所述整合缺陷型病毒载体已经描述于专利申请wo2006/010834中，所述专利申请以全文引用的方式并入ed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：无菌水，生理盐水，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。288.如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。289.如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤(例如与cd33相关的肿瘤)，或者，具有患有上述疾病的风险。290.如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。291.如本文中使用的，术语“免疫细胞”是指涉及免疫反应例如涉及促进免疫效应子功能的细胞。免疫细胞的实例包括t细胞(例如α/βt细胞和γ/δt细胞)、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞和骨髓来源巨噬细胞。292.本发明所述的免疫细胞可以是自身的/自体的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。如本文中使用的，“自身的”是指来自同一受试者的细胞；“同种异体的”是指与比较细胞遗传不同的同一物种的细胞；“同基因的”是指与比较细胞遗传相同的来自不同受试者的细胞；“异基因的”是指与比较细胞来自不同物种的细胞。在优选实施例中，本发明的细胞是同种异体的。293.可用于本文所述的car的示例性免疫细胞包括t淋巴细胞和/或nk细胞。术语“t细胞”或“t淋巴细胞”是本领域公知的并且意图包括胸腺细胞、未成熟的t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静息t淋巴细胞或活化的t淋巴细胞。t细胞可以是t辅助(th)细胞，例如t辅助1(th1)或t辅助2(th2)细胞。t细胞可以是辅助t细胞(htl；cd4t细胞)cd4t细胞、细胞毒性t细胞(ctl；cd8t细胞)、cd4cd8t细胞、cd4cd8t细胞或任何其它t细胞子组。在某些实施方案中，t细胞可以包括原初t细胞和记忆t细胞。294.本领域技术人员将理解，其它细胞也可以用作具有如本文所述的car的免疫细胞。具体来说，免疫细胞还包括nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞、nkt细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞。免疫细胞还包括免疫细胞的祖细胞，其中所述祖细胞可以在体内或体外经诱导以分化成免疫细胞。因此，在某些实施方案中，免疫细胞包括免疫细胞的祖细胞，例如含于衍生自脐血、骨髓或流动周边血液的cd34 细胞群体内的造血干细胞(hsc)，其在受试者中投与后分化成成熟免疫细胞，或其可以在体外经诱导以分化成成熟免疫细胞。295.如本文中使用的，术语“经改造的免疫细胞”是指，表达本文所述的任何一种car，或导入了本文所述的任何一种分离的核酸或载体的免疫细胞。可以用多种方法将编码car多肽的多核苷酸引入细胞后，也可以在细胞中原位合成car多肽。或者，可以在细胞外生产car多肽，然后将其引入细胞。将多核苷酸构建体引入细胞的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以使用稳定的转化方法将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其他实施方案中，瞬时转化方法可用于瞬时表达多核苷酸构建体，并且多核苷酸构建体未整合到细胞的基因组中。在其它实施方案中，可以使用病毒介导的方法。多核苷酸可以通过任何合适的方法引入细胞，例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)，脂质体等。瞬时转化方法包括，例如但不限于显微注射、电穿孔或微粒轰击。多核苷酸可以包括在载体中，例如质粒载体或病毒载体。296.如本文中使用的，术语“免疫效应子功能”是指免疫效应细胞的增强或促进对靶细胞的免疫攻击(例如对靶细胞的杀伤，或者抑制其生长或增殖)的功能或反应。例如，t细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。297.如本文中使用的，术语“血液学恶性肿瘤”包括淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾癌和淋巴结肿瘤。术语“cd33阳性血液恶性肿瘤”是指特征在于在恶性细胞表面上表达cd33的血液恶性肿瘤。cd33阳性血液恶性肿瘤包括但不限于急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、慢性骨髓单核细胞性白血病、血小板白血病、急性成巨核细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤、髓系肉瘤、肥大细胞增生病症、骨髓增生异常综合征(mds)等。298.发明的有益效果299.本发明提供了靶向cd33的包含本发明的抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体。表达本发明的嵌合抗原受体的免疫效应细胞相比于已知靶向cd33的car-t具有提高的效应子功能(例如，肿瘤杀伤活性以及释放细胞因子活性)。因此，本发明的嵌合抗原受体特别适用于预防和/或治疗血液学恶性肿瘤(例如髓系恶性肿瘤或恶性淋巴瘤)，具有重大的临床价值。300.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。附图说明301.图1-2显示了实施例1中4种scfv-fc(组1-组4)与表达cd33细胞的结合活性检测结果。302.图3显示了实施例1中2种scfv-fc(组1、组2)与cd33结合的octet动力学测定结果。303.图4-图6显示了car-t的细胞水平杀伤活性检测结果。图4，molm‑ꢀ13细胞；图5，hl60细胞；图6，u937细胞。304.图7显示了car-t细胞激活后il-2分泌水平检测结果。305.图8显示了car-t细胞激活后ifn-γ分泌水平检测结果。306.图9显示了经car-t细胞治疗的荷瘤小鼠的生存率曲线。307.序列信息308.本发明涉及的序列信息提供如下：309.310.311.具体实施方式312.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。313.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。314.实施例1：结合人类cd33的特异性单链抗体(scfv)的制备315.1.1基于噬菌体展示的cd33scfv筛选316.(1)取0.5ml全人源噬菌体文库，用生物素化cd33与sv磁珠对其进行筛选，筛选产物通过铺板检测噬菌体滴定。317.(2)取第一轮淘筛产物0.5ml与0.5mlmpbst混合，按上述步骤进行第2轮、第3轮或第4轮淘筛。318.1.2elisa检测单克隆噬菌体319.从噬菌体淘筛产物滴定板中接种单个菌落到96深孔板中，elisa检测单克隆噬菌体。320.1.3cd33-scfv测序321.用于测序的正向和反向引物分别为：pklt1f(seqidno:81)；pklt1r：(seqidno:82)。使用sequcher软件分析序列结果，最终获得11个克隆序列。322.1.4scfv-fc的构建与表征323.(1)分别采用sfii将噬菌体淘筛的11个抗cd33scfv序列从载体pklt1中消化下来，融合fc(seqidno:107)以构建scfv-fc，并与sfii消化的tegx-kal载体连接。将纯化的载体按6ml规模转染expi293细胞，培养4天。用mabselectsureproteinaresin(ge)纯化表达的scfv-fc。在11个抗cd33scfv-fc样品中，7个在sds-page中显示出良好或相对良好的表达。为了选择合适的候选物，通过生物物理分析和细胞结合活性来表征7种纯化的scfv-fc，最终获得4个克隆(组1-组4)，其scfv全长序列分别如seqidnos:83、84、85、86所示，其可变区及cdr序列如下表所示。324.表1：4个克隆(组1-组4)的可变区及cdr序列[0325][0326][0327](2)sec的结果如表2所示，组1、组3、组4样品显示的主峰面积百分比高，纯度较好，组2主峰面积百分比少，纯度较低。[0328]表2：抗cd33scfv-fcsec数据[0329][0330](3)cd33细胞结合试验[0331]为鉴定cd33scfv-fc蛋白结合亲和力，将表达cd33抗原的293t稳定细胞系用于细胞结合测定，野生型293t细胞为阴性对照。从400nm浓度开始，通过连续3次稀释产生一系列抗cd33scfv-fc。流式检测抗cd33scfv-fc与细胞结合情况。图1、图2、表3显示了用于car-t构建的4种scfv-fc的细胞结合结果。4组cd33scfv-fc都能与cd33 细胞结合，组1、组2、组4细胞亲和力优于组3。[0332]表3：抗cd33scfv-fc与表达cd33细胞结合的kd值[0333]组别组1组2组3组4阴性对照kd(nm)4.451.647.36*1033.37不结合[0334]4)octet动力学试验[0335]首先将生物素化的cd33(5μg/ml)加载到抗链霉亲和素生物传感器(streptavidinbiosensor18-5019)上。从10ug/ml的浓度开始将scfv-fc在动力学缓冲液中连续稀释2次。记录不同浓度结合scfv-fc与cd33的反应曲线，并分析结合常数。其中，对标序列来源于gemtuzumab‑ꢀozogamicin的scfv序列。结果图3和表4所示，cd33亲和力组2优于组1。[0336]表4：octet试验结果[0337]组别kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fullr^2组14.55e-095.79e 042.64e-040.9953组28.58e-115.45e 054.67e-050.9734对标《1.0e-126.78e 05《1.0e-070.9769[0338]以上获得的组1～组4scfv也可称为组1～组4scfv(vh-vl)。[0339]基于上述组1～组3scfv序列，进一步构建了三种scfv，命名为组1‑ꢀscfv(vl-vh)、组2-scfv(vl-vh)、组3-scfv(vl-vh)，其全长序列分别如seqidnos:95、97、99所示，并具有vl-linker2-vh所示的结构，其中linker2如seqidno:91所示。[0340]实施例2：慢病毒质粒的构建及病毒包装[0341]1)慢病毒质粒的构建概述：scfv序列经密码子优化后合成并构建到lenti-ef1a-at-free(苏州爱康得有限公司制备)载体，挑取单克隆进行培养及保种，提取质粒进行测序，将测序正确的菌液用于制备慢病毒质粒。[0342]详细地：基于上述实施例中获得的scfv序列，进一步构建car慢病毒表达载体。以cd137的胞内结构域和cd3ζ的itam区作为激活信号，与上述scfv进行融合，同时加上信号肽，cd8铰链区，cd8跨膜区，构建嵌合抗原受体表达载体，并亚克隆至lenti-ef1a-at-free(苏州爱康得有限公司制备)载体中，挑取单克隆进行培养及保种，提取质粒进行测序，将测序正确的菌液用于制备慢病毒质粒。[0343]所构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中从n端到c端各元件氨基酸序列分别如下表5所示。同时，以辉瑞cd33adc药物gemtuzumab‑ꢀozogamicinscfv序列构建car，作为对标car。[0344]表5：嵌合抗原受体中从n端到c端各元件的氨基酸序列[0345][0346]2)病毒包装：[0347]将以上构建的car慢病毒质粒与转染试剂混合液逐滴加入到293t(atcc)细胞中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱；培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。收集连续培养48小时、72小时后的含有病毒的培养基上清，加入peg后4℃过夜沉淀，4000×g4℃离心1小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入300μl病毒冻存液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。[0348]实施例3：car-t细胞制备[0349]3.1原代t细胞分离、激活：[0350](1)采用淋巴细胞分离液分离得到人的pbmc细胞，按细胞液：全能核酸酶＝10ml:1ul的比例加入全能核酸酶，置于37℃，5％co2的培养箱中培养3小时；[0351](2)按pbmc：磁珠＝3:1的比例吸取cd3/cd28磁珠，用hdpbs(含2％人血白蛋白的dpbs)洗涤后用100ulhdpbs重悬于冻存管。[0352](3)收集悬浮细胞于冻存管中，500g离心5min后加入1mlhdpbs重悬细胞，并将细胞悬液转入100ul磁珠中，轻轻混匀，室温下翻转孵育30分钟；[0353](4)将孵育后的混合液插入磁极中，室温静置2分钟，保持冻存管继续留在磁极中，轻轻倒置，将管内的细胞倒出。[0354](5)将细胞重悬于x-vivo15培养基中，并添加300u/mlil-2,5ng/mlil-15和10ng/mlil-7。[0355]3.2病毒感染：[0356](1)按照1×106cells加入200ul病毒液的比例从-80℃冰箱取出病毒，于室温下融化；[0357](2)在六孔板中加入上述病毒液，添加终浓度为5μg/ml的deae，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800g离心1.5小时。[0358](3)离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃5％co2的培养箱中，继续培养24小时。[0359](4)250g离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3-6天备用。[0360](5)制备得到：组1-car(vh-vl)t细胞(简称为组1(vh-vl))、组2-car(vh-vl)t细胞(简称为组2(vh-vl))、组3-car(vh-vl)t细胞(简称为组3(vh-vl))、组4-car(vh-vl)t细胞(简称为组4(vh-vl))、组1-car(vl-vh)t细胞(简称为组1(vl-vh))、组2‑ꢀcar(vl-vh)t细胞(简称为组2(vl-vh))、组3-car(vl-vh)t细胞(简称为组3(vl-vh))。[0361]实施例4：car-t细胞的阳性率检测[0362]编码car的核酸序列在启动子的驱动下表达，使用生物素化cd33抗原对慢病毒转染的t细胞进行标记并通过流式进行测定，反映car在t细胞表面的表达水平。通过如上方法检测实施例3获得的car-t细胞的car阳性率，facs检测结果如下表6所示。结果显示，组1(vh-vl)、组2(vh-vl)、组3(vh-vl)、组4(vh-vl)的car阳性率均大于30％，表明慢病毒转染效应细胞后，成功表达了car，成功构建了表达cd33‑ꢀcar的嵌合抗原受体t细胞。[0363]表6：car的阳性率检测结果[0364]嵌合抗原受体cd33-car阳性率cd33-car组1(vh vl)38.19％cd33-car组2(vh vl)60.07％cd33-car组3(vh vl)35.13％cd33-car组4(vh vl)44.9％[0365]实施例5：car-t细胞对靶细胞的杀伤活性评价[0366]通过测定car-t细胞对靶细胞的裂解能力来评价car-t细胞的杀伤活性，具体步骤如下：[0367]分别使用含20％fbs的imdm培养基、1640培养基将hl60-luc细胞(爱康得生物医学技术(苏州)有限公司)、u937-luc(爱康得生物医学技术(苏州)有限公司)和molm-13-luc(南京科佰生物科技有限公司)细胞密度调整至1×105个/ml，按照100μl/孔的量接种靶细胞至96孔板中，5％co237℃培养箱静置30min。收集car-t，离心收集并用imdm、1640培养基重悬car-t细胞，组1～组4car阳性t细胞、对标car阳性t细胞和未转染病毒的空白t细胞作为效应细胞，按照3:1、1:1、0.33:1的e/t(效应细胞/靶细胞)比例分别加入到含有hl60-luc和molm-13-luc的96孔板中。按照10:1、5:1、2.5:1、1:1的e/t(效应细胞/靶细胞)比例加入到含有u937-luc的96孔板中。100μl/孔，最终体积为200μl/孔，使用空白t细胞调整并使各组t细胞总数保持一致。将96孔板放入5％co237℃培养箱中培养18～24h。培养结束后，将孔板从培养箱中取出，加入20ul荧光检测试剂，使用酶标仪检测荧光读值。将上述处理后的数据使用graphpad进行作图。[0368]基于组1～组4scfv(vh-vl)构建的car-t的杀伤活性检测结果如图4～图6。图4的结果显示，组2(vh-vl)、组3(vh-vl)、组4(vh-vl)对molm-13细胞均有较强的杀伤作用，组2(vh-vl)杀伤最强。图5的结果显示，组1(vh-vl)、组2(vh-vl)、组3(vh-vl)、组4(vh-vl)对hl60细胞均有较强的杀伤作用，组1(vh-vl)杀伤最强。图6的结果显示，组1(vh-vl)对u937细胞有较强的杀伤作用，组2(vh-vl)对u937有较弱杀伤。[0369]实施例6：car-t细胞细胞因子释放[0370]收集u937-luc细胞，分别使用培养基调整细胞密度至1×105个/ml，按照100μl/孔的量接种靶细胞于96孔板中，并用培养基重悬car-t细胞，组1～组4car阳性t细胞、对标car阳性t细胞和未转染病毒的空白t细胞作为效应细胞，按照3:1、1:1、0.33:1的e/t(效应细胞/靶细胞)比例分别加入到含有hl60-luc、u937-luc和molm-13-luc的96孔板中，100μl/孔，最终体积为200μl/孔，使用空白t细胞调整并使各组t细胞总数保持一致。5％co237℃培养箱中培养过夜。培养结束后，将孔板从培养箱中取出，离心，取上清，使用htrf(il2和ifn-γ)检测细胞因子释放。检测结果如图7、图8所示，组1(vh-vl)、组3(vh-vl)均能分泌ifn-γ和il2，组1(vh-vl)分泌量较高，且优于对标。[0371]实施例7：体内模型评估car-t细胞对靶细胞的杀伤能力[0372]将体重、大小均一的健康nsg小鼠(购自百奥赛图)随机分为5组，组1(vh-vl)、组2(vh-vl)、组3(vh-vl)及空白t组各5只，对标组2只。尾静脉注射接种u937细胞1×106cells/只。3天后，将制备好的car-t细胞复苏，用pbs重悬后，按5×106car阳性t细胞/只接种小鼠，使用空白t细胞调整细胞数，保证各组注射总t细胞数一致，注射细胞液体积一致。结果如下图9所示，组1(vh-vl)、组2(vh-vl)处理后小鼠生存期显著延长(组1＞60天，组256天，对标17天，空白t16天)。[0373]尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
