一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质hsaf的方法
技术领域：
：1.本发明属于微生物天然产物分离纯化
技术领域：
：，具体涉及一种从产酶溶杆菌发酵液中选择性分离纯化抗真菌活性物质hsaf的方法。
背景技术：
：：2.热稳定抗真菌因子(heatstableantifungalfactor,简称hsaf)是产酶溶杆菌产生的一种小分子抗真菌物质，具有热稳定性高、抗菌谱广及毒性低等特点。其对病原真菌的作用方式与目前已报道的商用杀真菌剂截然不同，主要通过抑制病原菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长。因此，hsaf具有被开发为一种新型杀菌剂的潜力。3.作为一种新型的抗真菌活性物质，hsaf的研究一直受到全球关注，也取得了一些重要进展。但这些主要集中在生物合成基因及途径解析、调控因子鉴定、拮抗机理探究和发酵产量提升等方面，而关于hsaf的分离提取研究却少有进展。目前hsaf从发酵液中的分离纯化仍采用传统的乙酸乙酯萃取法，步骤繁多、消耗大量时间、劳力，大量使用毒性较大的有机溶剂(乙酸乙酯)，容易造成操作工人的身体健康危害和环境污染。而且atb也是产酶溶杆菌产生代谢产物，与hsaf共存于oh11发酵液中，含量高达258.81mg/l，是hsaf发酵生产过程中的主要副产物，且由于具有与hsaf相似的结构和化学性质，极难通过常规的方法去除，严重影响最终hsaf的分离纯度(仅为8％左右)，根本无法满足研究要求。这也是限制其产业化生产的一个重要因素。因此有必要发展一种简单、经济、高效的提取方法来分离纯化发酵液中hsaf，加速推动hsaf后续的产业化工作。技术实现要素：4.针对现有技术的不足，本发明的目的提供一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质hsaf的方法，是一种安全无污染、资源利用率高，生产成本低，又有利于环境保护的提取hsaf的方法。5.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：6.一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质hsaf的方法，首先通过光照降解oh11发酵液中副产物atb，然后利用大孔树脂对发酵液中的hsaf进行静态吸附或动态吸附，解吸后的解吸液蒸发浓缩干燥后得hsaf粗提物。7.本发明所述的产酶溶杆菌发酵液可以通过本领域的常规方法获得，例如但不限于：将活化好的产酶溶杆菌oh11菌株接入lb种子液中，过夜培养后，按照2～5％接种量转接发酵培养基中，置于摇床中发酵培养，得到hsaf发酵液；所用的发酵培养基可以为本领域常用的发酵培养基，例如：黄豆粉6.00～10.00g/l、葡萄糖7～8g/l，cacl20.65～0.80g/l；发酵培养基条件为25～30℃、160～200rpm、55～60h。8.本发明所述的产酶溶杆菌发酵液没有特别要求，在一些实施例中，发酵液ph范围为6-8，hsaf的浓度为200-500mg/l。9.在一些实施例中，本发明利用光照降解oh11发酵液中副产物atb具体为：将产酶溶杆菌发酵液置于光照条件下照射1-5天，光照强度1000-20000lx。本发明所述的光可以通过现有技术常规方法获得，例如直接太阳光照或者通过日光灯产生；本发明通过光照提前降解发酵液中的atb，可以达到提高hsaf纯度的目的。10.在本发明一种具体的实施例中，本发明大孔树脂选用孔径为20～22nm的nka型大孔树脂。11.在一些实施例中，本发明所述方法中的大孔树脂在用于吸附之前先进行预处理，本发明提供一种具体的预处理方法：将大孔树脂采用无水乙醇浸泡，除去上浮的树脂碎片，反复浸泡3-5次，至无白色浑浊为止，最后用去离子水清洗直至无乙醇气味，烘干后备用。12.在一些实施例中，利用大孔树脂对发酵液中的hsaf进行静态吸附的具体方法为：将大孔树脂和发酵液一起加入容器中，密封后置于摇床上进行吸附，过滤分离树脂和滤液。13.在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，发酵液和大孔树脂的体积质量比为30-60ml：0.62g在一种具体的实施例中，为50ml：0.62g。14.在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，吸附条件为120-200rpm、27-37℃、4-8h，在一种具体的实施例中，为180rpm、37℃、6h。15.在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，吸附公式为：[0016][0017][0018]式中：qe—吸附容量，mg/g；e—吸附率，％；c0—起始浓度，mg/l；ce—平衡浓度，mg/l；v—发酵液体积，ml；w—干树脂重量，g。[0019]当采用静态吸附时，在本发明的一种实施例中，本发明还提供静态吸附的解吸过程：对过滤收集的树脂用去离子水清洗，至表面无样品液残留，再用滤纸吸干水分，重新置于容器中，加入无水乙醇，密封后置于摇床中进行解吸。[0020]在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸时加入无水乙醇和大孔树脂的体积质量比为30-50ml：0.62g，优选50ml：0.62g。[0021]在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸条件为120-200rpm、27-37℃、0.5-3h，在一种具体的实施例中，为180rpm、37℃、2h。[0022]在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸公式：[0023][0024][0025]式中：qd—解吸容量，mg/g；d—解吸率，％；cd—解吸液中hsaf浓度，mg/l；vd—解吸溶液体积，ml。[0026]在一些实施例中，利用大孔树脂对发酵液中的hsaf进行动态吸附的具体方法为：将大孔树脂湿法装入层析柱中，用去离子水平衡后，将发酵液样品匀速上样，每隔一个柱体积(bv)收集流出液，待流出液中hsaf浓度达到初始上样浓度的6～15％时，停止上样。[0027]本发明大孔树脂湿法装入层析柱中，用去离子水平衡可以采用本领域常规的方法。[0028]在本发明一些实施例中，当进行动态吸附时，大孔树脂对发酵液中的hsaf进行吸附时发酵液的流速为1-2bv/h；在一种具体的实施例中，流速为2bv/h。[0029]在本发明一些实施例中，当进行动态吸附时，上样量为15-28bv，优选20-22bv。[0030]在本发明一些实施例中，当进行动态吸附时，大孔树脂对发酵液中的hsaf进行吸附的吸附容量为20mg/g～25mg/g。[0031]当采用动态吸附时，在本发明的一种实施例中，本发明还提供动态吸附的解吸过程：已吸附饱和的树脂用去离子水洗至无样品液残留，采用两阶段洗脱程序进行解吸；第一阶段：用低浓度乙醇水溶液进行洗脱，去除吸附在树脂上的极性或中等极性化合物；第二阶段：用高浓度乙醇水溶液对hsaf进行解吸，按照柱体积收集洗脱液。[0032]在一些实施例中，本发明所述低浓度乙醇水溶液浓度为20-40％，洗脱体积为2-5bv，洗脱流速为1-4bv/h；在一种具体的实施例中，乙醇水溶液浓度为40％，洗脱体积为4bv，洗脱流速为2bv/h。[0033]在一些实施例中，本发明所述高浓度乙醇水溶液浓度为80-100％，洗脱体积为8-15bv，洗脱流速为1-4bv/h；在一种具体的实施例中，乙醇水溶液浓度为80％，洗脱体积为10bv，洗脱流速为2bv/h。发明人发现在这样的洗脱浓度和条件下，洗脱液中hsaf浓度达到最高。[0034]在本发明的一些实施例中，当进行动态吸附时，解吸采用两阶段洗脱程序，用1～3bv的去离子水清洗后，先用洗脱体积为2-5bv，洗脱流速为1-4bv/h的体积百分比为20％～40％的乙醇水溶液冲洗，再用洗脱体积为8-15bv，洗脱流速为1-4bv/h的体积百分比为80％～100％乙醇水溶液洗脱；在一种具体的实施例中，先用洗脱体积为4bv，洗脱流速为2bv/h的体积百分比为40％的乙醇水溶液冲洗，再用洗脱体积为10bv，洗脱流速为2bv/h的体积百分比为80％乙醇水溶液洗脱。[0035]本发明解吸后的解吸液蒸发浓缩干燥后得hsaf粗提物，蒸发浓缩干燥可以采用本领域的常规方法，例如通过旋转蒸发浓缩和冷冻干燥，得到hsaf粗提物。在本发明的一些实施例中，解吸液蒸发温度为30-60℃。[0036]本发明还提供静态吸附后计算吸附容量和吸附率的方法：过滤分离树脂和滤液后，对滤液中hsaf进行乙酸乙酯提取、hplc检测，按照公式计算吸附容量和吸附率；在一种实施例中，hplc检测条件：intersustainswiftc185μm,250×4.6mm。流动相：溶液a(0.025％tfa水溶液)和溶液b(0.025％tfa乙腈溶液)，流速：1ml/min；进样量为20μl，紫外吸收值：318nm；进样程序：0-10min，将溶液b从5％至25％；25min，增长到80％b；26min，增长到100％；30min返回到5％，溶液a和b总比例为100％；记录峰面积，通过制定的hsaf浓度与峰面积间的线性方程为y＝4e-05x 12.46，r2＝0.9996来计算乙酸乙酯中hsaf的含量。[0037]本发明还提供一种hsaf提取物纯度检测，称取一定量的提取物，配制成甲醇溶液(cm)，并通过hplc检测实际含量(ch)，则提取物中hsaf纯度(％)＝ch/cm×100％。[0038]本发明还提供一种去除hsaf中atb的方法，其特征在于，通过光照降解hsaf中atb。[0039]在本发明的一种实施例中，通过光照降解hsaf中atb具体为将含有atb的hsaf液体置于光照条件下照射1-5天，光照强度1000-20000lx。[0040]本发明所述的含有atb的hsaf液体可以为任何含有atb杂质的hsaf液体，例如产酶溶杆菌oh11菌株的发酵液。[0041]本发明的有益效果：[0042](1)避免传统工艺中采用乙酸乙酯等环境污染有机溶剂的缺点，选择常规的水和乙醇作为洗脱剂，生产过程安全无污染、资源利用率高，生产成本低，又有利于环境保护，是一种绿色环保提取hsaf的方法；[0043](2)该技术操作过程简单方便，使用nka型树脂物理化学性质稳定、可以再生简便、重复循环使用、使用周期长等优点，比较适合hsaf的大规模工业化提取；[0044](3)本发明通过光提前降解发酵液中的atb，可以达到提高hsaf纯度，分离提取后得到的hsaf含量在31％左右，这是传统分离方法的3.58倍。附图说明[0045]图1光照后发酵液的hplc色谱图对比；[0046]图2不同树脂对发酵液中hsaf的吸附/解吸情况；[0047]图3nka树脂对hsaf的静态吸附/解吸动力学；[0048]图4不同上样流速下的泄露曲线；[0049]图5不同洗脱浓度下的洗脱曲线；[0050]图6不同提取方法得到的hsaf外观、hplc色谱图及纯度对比；(a)hsaf纯品；(b)nka吸附-80％乙醇洗脱；(c)nka吸附-两阶段洗脱；(d)乙酸乙酯萃取；(e)未经过光照的发酵液通过nka吸附-两阶段洗脱。具体实施方式[0051]以下结合具体实施例对本发明进行说明，若无特别说明，实施例所用到的试剂为常规购买的试剂，所用的方法为本领域的常规方法。[0052]以下实施例所用的发酵液具体为：将活化好的产酶溶杆菌oh11菌株接入lb种子液中，过夜培养后，按照2.5％接种量转接发酵培养基中，置于摇床中发酵培养，得到hsaf发酵液，ph范围为6-8，hsaf的浓度约为300mg/l；所用的发酵培养基：黄豆粉8g/l、葡萄糖7.89g/l，cacl20.72g/l；发酵培养基条件为28℃、180rpm、58h。[0053]实施例1：光降解去除发酵液中的atb[0054]将800ml发酵液(hsaf浓度为300mg/l)装于1l血清瓶中，置于光照强度为15000lx的光照培养箱中，照射2天。通过提取检测，我们可以从图1中可以看出，经过光照处理后，发酵液中atb逐渐发生降解，在2天后完全消失。而发酵液中hsaf含量一直保持不变。因此，通过光照降解来去除发酵液中atb是可行的，而且简单方便。[0055]实施例2：大孔吸附树脂型号的对比[0056]分别称取0.62g(干重)预处理好的不同性质的大孔树脂(强极性树脂s-8和非极性树脂nka)，置于250ml具塞三角瓶中，在室温下分别加入经光降解去除发酵液中的atb的hsaf发酵液50ml(浓度为300mg/l)，置于摇床中，37℃、180rpm、振荡6h，使其达到充分吸附。利用3层纱布分离树脂和滤液，对滤液进行hsaf的提取检测。对吸附的树脂进行解吸实验：用去离子水清洗3次，滤纸吸干水分，重新转移树脂置三角瓶中，加入无水乙醇50ml，置于摇床中，37℃、180rpm、解吸2h。将洗脱液经过0.22μm滤膜过滤后hplc检测其中hsaf浓度。最后按照公式计算树脂吸附/解吸容量、吸附率和解吸率。[0057]由图2可见，强极性树脂s-8和非极性树脂nka对发酵液中hsaf都具有比较高的吸附容量，而对于解吸过程来说，s-8的解吸容量(1.91mg/g)和解吸率(12.81％)都非常低，吸附在s-8上的hsaf较难洗脱下来。而本发明所用的nka型大孔树脂对发酵液中hsaf的吸附容量和解吸容量都比较高，分别为19.59mg/g、15.86mg/g，此时吸附率和解吸率为80.99％和80.92％。[0058]实施例3：nka静态吸附与解吸动力学研究[0059]称取0.62g干树脂nka于250ml三角瓶中，并加入50ml经光降解去除发酵液中的atb的hsaf发酵液，置于摇床中37℃、180rpm振荡，每隔20min取样一次，并进行hsaf提取检测，绘制hsaf静态吸附动力学曲线；同时将吸附过的nka树脂，去离子水清洗3次、滤纸吸干水分之后，加入50ml无水乙醇，置于摇床中，37℃、180rpm振荡，每隔10min取样进行hplc检测，绘制nka静态解吸动力学曲线。[0060]由图3可见，hsaf在nka树脂上前20min吸附较为迅速，随后进入缓慢的过程，直到240min达到吸附平衡。而解吸过程发生比较快速，在60min，hsaf解吸到达平衡。[0061]实施例4：不同上样流速对nka型树脂动态吸附发酵液中hsaf的对比[0062]称取nka干树脂1.55g装入玻璃层析柱(10mm×300mm)中，填充柱体积为7.2ml。将经光降解去除发酵液中的atb的发酵液以不同的流速(0.5、1.0、2.0、4.0bv/h)穿过层析柱，按照柱体积(bv)收集流出液，并进行hsaf提取检测。[0063]由图4可见，当流出液中hsaf浓度达到达初始浓度的10％，即为泄露点，停止上样，因此确定不同流速下，发酵液上样体积分别为28、22、20、15bv，此时nka对hsaf的吸附容量分别为33.37、25.53、24.14、17.52mg/g。结果表明：上样流速过大时，吸附容量会减小；当流速过慢时，需要消耗大量的时间。而本发明所采用的流速1bv/h-2bv/h，吸附容量减小不大，特别是上样流速为2bv/h时，此时上样体积为20bv，即144ml，吸附容量为24.14mg/g。[0064]实施例5：不同浓度乙醇水溶液对nka型树脂动态解吸发酵液中hsaf的对比[0065]当实施例4中完成吸附之后，先用2bv的去离子水清洗树脂，接着用不同浓度的甲醇水溶液洗脱(0％、20％、40％、60％、80％、100％)，总体积为10bv。按照柱体积收集洗脱液并进行hsaf浓度检测，绘制洗脱曲线如图5所示。当乙醇水溶液浓度≤40％时，几乎不能将nka树脂上的hsaf洗脱下来；本发明所述的浓度范围，可以将hsaf很好的洗脱，特别是在80％浓度时，洗脱液中hasf浓度达到最高，解吸率达到最好。[0066]实施例6：两阶段洗脱程序对nka型树脂动态解吸发酵液中hsaf的影响[0067]当实施例4中完成吸附之后，先用2bv的去离子水清洗树脂，接着用4bv40％乙醇水溶液以洗脱流速为2bv/h进行冲洗，以去除吸附在nka树脂的极性化合物，最后用10bv的80％乙醇水溶液洗脱流速为2bv/h洗脱吸附在nka树脂上的hsaf，收集洗脱液。将收集的洗脱液在40℃下旋转蒸发，去除乙醇洗脱剂，置于冷冻干燥机中除去水分，得到hsaf提取物并进行纯度检测：称取1mghsaf提取物，配制成甲醇溶液1000mg/l，通过hplc检测实际含量(ch)，则提取物中hsaf纯度(％)＝ch/1000×100％。并与实施例5的80％乙醇浓度洗脱下进行比较。[0068]由图5可知：采用两阶段洗脱程序(40％-80％)，hsaf的洗脱曲线与80％乙醇几乎一致，但是两阶段洗脱下hsaf粗提物颜色更浅一点，而且hsaf纯度达到31.07％，比80％乙醇(20.16)下提高了54.12％(图6b、c)。[0069]对比例1：传统乙酸乙酯法提取[0070]吸取发酵液3ml至15ml离心管中，滴加浓hcl至ph为3.0，向混合液中添加0.45gcacl2和3ml乙酸乙酯，置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使有机溶剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使发酵液与有机溶剂分成两相，上清即为hsaf有机溶剂层，吸取1ml吹干加入500μl甲醇溶解后通过hplc对其含量进行检测。[0071]对比例与实施例5和实施例6的结果对比如图6所示：①通过实施例5和实施例6nka树脂吸附获得的hsaf提取物外观呈浅黄色，而乙酸乙酯提取物为深褐色，说明乙酸乙酯萃取将更多的色素同hsaf一起提取出来；②实施例6nka吸附法提取的hsaf纯度能达到31.07％，这是乙酸乙酯方法(8.67％)的3.58倍，说明nka树脂吸附能明显提高最终的hsaf含量。[0072]对比例2：[0073]同实施例4和实施例6的操作方法，区别仅在发酵液在动态吸附之前不经过过光降解去除发酵液中的atb的，而是直接用于动态吸附。结果可如图6(c)和(e)所示，未通过光照处理，得到的hsaf产物外观为深黄色，而且hsaf纯度只有18.38％，远低于经过光照处理的。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明属于微生物天然产物分离纯化
技术领域：
：，具体涉及一种从产酶溶杆菌发酵液中选择性分离纯化抗真菌活性物质hsaf的方法。
背景技术：
：：2.热稳定抗真菌因子(heatstableantifungalfactor,简称hsaf)是产酶溶杆菌产生的一种小分子抗真菌物质，具有热稳定性高、抗菌谱广及毒性低等特点。其对病原真菌的作用方式与目前已报道的商用杀真菌剂截然不同，主要通过抑制病原菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长。因此，hsaf具有被开发为一种新型杀菌剂的潜力。3.作为一种新型的抗真菌活性物质，hsaf的研究一直受到全球关注，也取得了一些重要进展。但这些主要集中在生物合成基因及途径解析、调控因子鉴定、拮抗机理探究和发酵产量提升等方面，而关于hsaf的分离提取研究却少有进展。目前hsaf从发酵液中的分离纯化仍采用传统的乙酸乙酯萃取法，步骤繁多、消耗大量时间、劳力，大量使用毒性较大的有机溶剂(乙酸乙酯)，容易造成操作工人的身体健康危害和环境污染。而且atb也是产酶溶杆菌产生代谢产物，与hsaf共存于oh11发酵液中，含量高达258.81mg/l，是hsaf发酵生产过程中的主要副产物，且由于具有与hsaf相似的结构和化学性质，极难通过常规的方法去除，严重影响最终hsaf的分离纯度(仅为8％左右)，根本无法满足研究要求。这也是限制其产业化生产的一个重要因素。因此有必要发展一种简单、经济、高效的提取方法来分离纯化发酵液中hsaf，加速推动hsaf后续的产业化工作。技术实现要素：4.针对现有技术的不足，本发明的目的提供一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质hsaf的方法，是一种安全无污染、资源利用率高，生产成本低，又有利于环境保护的提取hsaf的方法。5.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：6.一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质hsaf的方法，首先通过光照降解oh11发酵液中副产物atb，然后利用大孔树脂对发酵液中的hsaf进行静态吸附或动态吸附，解吸后的解吸液蒸发浓缩干燥后得hsaf粗提物。7.本发明所述的产酶溶杆菌发酵液可以通过本领域的常规方法获得，例如但不限于：将活化好的产酶溶杆菌oh11菌株接入lb种子液中，过夜培养后，按照2～5％接种量转接发酵培养基中，置于摇床中发酵培养，得到hsaf发酵液；所用的发酵培养基可以为本领域常用的发酵培养基，例如：黄豆粉6.00～10.00g/l、葡萄糖7～8g/l，cacl20.65～0.80g/l；发酵培养基条件为25～30℃、160～200rpm、55～60h。8.本发明所述的产酶溶杆菌发酵液没有特别要求，在一些实施例中，发酵液ph范围为6-8，hsaf的浓度为200-500mg/l。9.在一些实施例中，本发明利用光照降解oh11发酵液中副产物atb具体为：将产酶溶杆菌发酵液置于光照条件下照射1-5天，光照强度1000-20000lx。本发明所述的光可以通过现有技术常规方法获得，例如直接太阳光照或者通过日光灯产生；本发明通过光照提前降解发酵液中的atb，可以达到提高hsaf纯度的目的。10.在本发明一种具体的实施例中，本发明大孔树脂选用孔径为20～22nm的nka型大孔树脂。11.在一些实施例中，本发明所述方法中的大孔树脂在用于吸附之前先进行预处理，本发明提供一种具体的预处理方法：将大孔树脂采用无水乙醇浸泡，除去上浮的树脂碎片，反复浸泡3-5次，至无白色浑浊为止，最后用去离子水清洗直至无乙醇气味，烘干后备用。12.在一些实施例中，利用大孔树脂对发酵液中的hsaf进行静态吸附的具体方法为：将大孔树脂和发酵液一起加入容器中，密封后置于摇床上进行吸附，过滤分离树脂和滤液。13.在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，发酵液和大孔树脂的体积质量比为30-60ml：0.62g在一种具体的实施例中，为50ml：0.62g。14.在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，吸附条件为120-200rpm、27-37℃、4-8h，在一种具体的实施例中，为180rpm、37℃、6h。15.在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，吸附公式为：[0016][0017][0018]式中：qe—吸附容量，mg/g；e—吸附率，％；c0—起始浓度，mg/l；ce—平衡浓度，mg/l；v—发酵液体积，ml；w—干树脂重量，g。[0019]当采用静态吸附时，在本发明的一种实施例中，本发明还提供静态吸附的解吸过程：对过滤收集的树脂用去离子水清洗，至表面无样品液残留，再用滤纸吸干水分，重新置于容器中，加入无水乙醇，密封后置于摇床中进行解吸。[0020]在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸时加入无水乙醇和大孔树脂的体积质量比为30-50ml：0.62g，优选50ml：0.62g。[0021]在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸条件为120-200rpm、27-37℃、0.5-3h，在一种具体的实施例中，为180rpm、37℃、2h。[0022]在本发明一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸公式：[0023][0024][0025]式中：qd—解吸容量，mg/g；d—解吸率，％；cd—解吸液中hsaf浓度，mg/l；vd—解吸溶液体积，ml。[0026]在一些实施例中，利用大孔树脂对发酵液中的hsaf进行动态吸附的具体方法为：将大孔树脂湿法装入层析柱中，用去离子水平衡后，将发酵液样品匀速上样，每隔一个柱体积(bv)收集流出液，待流出液中hsaf浓度达到初始上样浓度的6～15％时，停止上样。[0027]本发明大孔树脂湿法装入层析柱中，用去离子水平衡可以采用本领域常规的方法。[0028]在本发明一些实施例中，当进行动态吸附时，大孔树脂对发酵液中的hsaf进行吸附时发酵液的流速为1-2bv/h；在一种具体的实施例中，流速为2bv/h。[0029]在本发明一些实施例中，当进行动态吸附时，上样量为15-28bv，优选20-22bv。[0030]在本发明一些实施例中，当进行动态吸附时，大孔树脂对发酵液中的hsaf进行吸附的吸附容量为20mg/g～25mg/g。[0031]当采用动态吸附时，在本发明的一种实施例中，本发明还提供动态吸附的解吸过程：已吸附饱和的树脂用去离子水洗至无样品液残留，采用两阶段洗脱程序进行解吸；第一阶段：用低浓度乙醇水溶液进行洗脱，去除吸附在树脂上的极性或中等极性化合物；第二阶段：用高浓度乙醇水溶液对hsaf进行解吸，按照柱体积收集洗脱液。[0032]在一些实施例中，本发明所述低浓度乙醇水溶液浓度为20-40％，洗脱体积为2-5bv，洗脱流速为1-4bv/h；在一种具体的实施例中，乙醇水溶液浓度为40％，洗脱体积为4bv，洗脱流速为2bv/h。[0033]在一些实施例中，本发明所述高浓度乙醇水溶液浓度为80-100％，洗脱体积为8-15bv，洗脱流速为1-4bv/h；在一种具体的实施例中，乙醇水溶液浓度为80％，洗脱体积为10bv，洗脱流速为2bv/h。发明人发现在这样的洗脱浓度和条件下，洗脱液中hsaf浓度达到最高。[0034]在本发明的一些实施例中，当进行动态吸附时，解吸采用两阶段洗脱程序，用1～3bv的去离子水清洗后，先用洗脱体积为2-5bv，洗脱流速为1-4bv/h的体积百分比为20％～40％的乙醇水溶液冲洗，再用洗脱体积为8-15bv，洗脱流速为1-4bv/h的体积百分比为80％～100％乙醇水溶液洗脱；在一种具体的实施例中，先用洗脱体积为4bv，洗脱流速为2bv/h的体积百分比为40％的乙醇水溶液冲洗，再用洗脱体积为10bv，洗脱流速为2bv/h的体积百分比为80％乙醇水溶液洗脱。[0035]本发明解吸后的解吸液蒸发浓缩干燥后得hsaf粗提物，蒸发浓缩干燥可以采用本领域的常规方法，例如通过旋转蒸发浓缩和冷冻干燥，得到hsaf粗提物。在本发明的一些实施例中，解吸液蒸发温度为30-60℃。[0036]本发明还提供静态吸附后计算吸附容量和吸附率的方法：过滤分离树脂和滤液后，对滤液中hsaf进行乙酸乙酯提取、hplc检测，按照公式计算吸附容量和吸附率；在一种实施例中，hplc检测条件：intersustainswiftc185μm,250×4.6mm。流动相：溶液a(0.025％tfa水溶液)和溶液b(0.025％tfa乙腈溶液)，流速：1ml/min；进样量为20μl，紫外吸收值：318nm；进样程序：0-10min，将溶液b从5％至25％；25min，增长到80％b；26min，增长到100％；30min返回到5％，溶液a和b总比例为100％；记录峰面积，通过制定的hsaf浓度与峰面积间的线性方程为y＝4e-05x 12.46，r2＝0.9996来计算乙酸乙酯中hsaf的含量。[0037]本发明还提供一种hsaf提取物纯度检测，称取一定量的提取物，配制成甲醇溶液(cm)，并通过hplc检测实际含量(ch)，则提取物中hsaf纯度(％)＝ch/cm×100％。[0038]本发明还提供一种去除hsaf中atb的方法，其特征在于，通过光照降解hsaf中atb。[0039]在本发明的一种实施例中，通过光照降解hsaf中atb具体为将含有atb的hsaf液体置于光照条件下照射1-5天，光照强度1000-20000lx。[0040]本发明所述的含有atb的hsaf液体可以为任何含有atb杂质的hsaf液体，例如产酶溶杆菌oh11菌株的发酵液。[0041]本发明的有益效果：[0042](1)避免传统工艺中采用乙酸乙酯等环境污染有机溶剂的缺点，选择常规的水和乙醇作为洗脱剂，生产过程安全无污染、资源利用率高，生产成本低，又有利于环境保护，是一种绿色环保提取hsaf的方法；[0043](2)该技术操作过程简单方便，使用nka型树脂物理化学性质稳定、可以再生简便、重复循环使用、使用周期长等优点，比较适合hsaf的大规模工业化提取；[0044](3)本发明通过光提前降解发酵液中的atb，可以达到提高hsaf纯度，分离提取后得到的hsaf含量在31％左右，这是传统分离方法的3.58倍。附图说明[0045]图1光照后发酵液的hplc色谱图对比；[0046]图2不同树脂对发酵液中hsaf的吸附/解吸情况；[0047]图3nka树脂对hsaf的静态吸附/解吸动力学；[0048]图4不同上样流速下的泄露曲线；[0049]图5不同洗脱浓度下的洗脱曲线；[0050]图6不同提取方法得到的hsaf外观、hplc色谱图及纯度对比；(a)hsaf纯品；(b)nka吸附-80％乙醇洗脱；(c)nka吸附-两阶段洗脱；(d)乙酸乙酯萃取；(e)未经过光照的发酵液通过nka吸附-两阶段洗脱。具体实施方式[0051]以下结合具体实施例对本发明进行说明，若无特别说明，实施例所用到的试剂为常规购买的试剂，所用的方法为本领域的常规方法。[0052]以下实施例所用的发酵液具体为：将活化好的产酶溶杆菌oh11菌株接入lb种子液中，过夜培养后，按照2.5％接种量转接发酵培养基中，置于摇床中发酵培养，得到hsaf发酵液，ph范围为6-8，hsaf的浓度约为300mg/l；所用的发酵培养基：黄豆粉8g/l、葡萄糖7.89g/l，cacl20.72g/l；发酵培养基条件为28℃、180rpm、58h。[0053]实施例1：光降解去除发酵液中的atb[0054]将800ml发酵液(hsaf浓度为300mg/l)装于1l血清瓶中，置于光照强度为15000lx的光照培养箱中，照射2天。通过提取检测，我们可以从图1中可以看出，经过光照处理后，发酵液中atb逐渐发生降解，在2天后完全消失。而发酵液中hsaf含量一直保持不变。因此，通过光照降解来去除发酵液中atb是可行的，而且简单方便。[0055]实施例2：大孔吸附树脂型号的对比[0056]分别称取0.62g(干重)预处理好的不同性质的大孔树脂(强极性树脂s-8和非极性树脂nka)，置于250ml具塞三角瓶中，在室温下分别加入经光降解去除发酵液中的atb的hsaf发酵液50ml(浓度为300mg/l)，置于摇床中，37℃、180rpm、振荡6h，使其达到充分吸附。利用3层纱布分离树脂和滤液，对滤液进行hsaf的提取检测。对吸附的树脂进行解吸实验：用去离子水清洗3次，滤纸吸干水分，重新转移树脂置三角瓶中，加入无水乙醇50ml，置于摇床中，37℃、180rpm、解吸2h。将洗脱液经过0.22μm滤膜过滤后hplc检测其中hsaf浓度。最后按照公式计算树脂吸附/解吸容量、吸附率和解吸率。[0057]由图2可见，强极性树脂s-8和非极性树脂nka对发酵液中hsaf都具有比较高的吸附容量，而对于解吸过程来说，s-8的解吸容量(1.91mg/g)和解吸率(12.81％)都非常低，吸附在s-8上的hsaf较难洗脱下来。而本发明所用的nka型大孔树脂对发酵液中hsaf的吸附容量和解吸容量都比较高，分别为19.59mg/g、15.86mg/g，此时吸附率和解吸率为80.99％和80.92％。[0058]实施例3：nka静态吸附与解吸动力学研究[0059]称取0.62g干树脂nka于250ml三角瓶中，并加入50ml经光降解去除发酵液中的atb的hsaf发酵液，置于摇床中37℃、180rpm振荡，每隔20min取样一次，并进行hsaf提取检测，绘制hsaf静态吸附动力学曲线；同时将吸附过的nka树脂，去离子水清洗3次、滤纸吸干水分之后，加入50ml无水乙醇，置于摇床中，37℃、180rpm振荡，每隔10min取样进行hplc检测，绘制nka静态解吸动力学曲线。[0060]由图3可见，hsaf在nka树脂上前20min吸附较为迅速，随后进入缓慢的过程，直到240min达到吸附平衡。而解吸过程发生比较快速，在60min，hsaf解吸到达平衡。[0061]实施例4：不同上样流速对nka型树脂动态吸附发酵液中hsaf的对比[0062]称取nka干树脂1.55g装入玻璃层析柱(10mm×300mm)中，填充柱体积为7.2ml。将经光降解去除发酵液中的atb的发酵液以不同的流速(0.5、1.0、2.0、4.0bv/h)穿过层析柱，按照柱体积(bv)收集流出液，并进行hsaf提取检测。[0063]由图4可见，当流出液中hsaf浓度达到达初始浓度的10％，即为泄露点，停止上样，因此确定不同流速下，发酵液上样体积分别为28、22、20、15bv，此时nka对hsaf的吸附容量分别为33.37、25.53、24.14、17.52mg/g。结果表明：上样流速过大时，吸附容量会减小；当流速过慢时，需要消耗大量的时间。而本发明所采用的流速1bv/h-2bv/h，吸附容量减小不大，特别是上样流速为2bv/h时，此时上样体积为20bv，即144ml，吸附容量为24.14mg/g。[0064]实施例5：不同浓度乙醇水溶液对nka型树脂动态解吸发酵液中hsaf的对比[0065]当实施例4中完成吸附之后，先用2bv的去离子水清洗树脂，接着用不同浓度的甲醇水溶液洗脱(0％、20％、40％、60％、80％、100％)，总体积为10bv。按照柱体积收集洗脱液并进行hsaf浓度检测，绘制洗脱曲线如图5所示。当乙醇水溶液浓度≤40％时，几乎不能将nka树脂上的hsaf洗脱下来；本发明所述的浓度范围，可以将hsaf很好的洗脱，特别是在80％浓度时，洗脱液中hasf浓度达到最高，解吸率达到最好。[0066]实施例6：两阶段洗脱程序对nka型树脂动态解吸发酵液中hsaf的影响[0067]当实施例4中完成吸附之后，先用2bv的去离子水清洗树脂，接着用4bv40％乙醇水溶液以洗脱流速为2bv/h进行冲洗，以去除吸附在nka树脂的极性化合物，最后用10bv的80％乙醇水溶液洗脱流速为2bv/h洗脱吸附在nka树脂上的hsaf，收集洗脱液。将收集的洗脱液在40℃下旋转蒸发，去除乙醇洗脱剂，置于冷冻干燥机中除去水分，得到hsaf提取物并进行纯度检测：称取1mghsaf提取物，配制成甲醇溶液1000mg/l，通过hplc检测实际含量(ch)，则提取物中hsaf纯度(％)＝ch/1000×100％。并与实施例5的80％乙醇浓度洗脱下进行比较。[0068]由图5可知：采用两阶段洗脱程序(40％-80％)，hsaf的洗脱曲线与80％乙醇几乎一致，但是两阶段洗脱下hsaf粗提物颜色更浅一点，而且hsaf纯度达到31.07％，比80％乙醇(20.16)下提高了54.12％(图6b、c)。[0069]对比例1：传统乙酸乙酯法提取[0070]吸取发酵液3ml至15ml离心管中，滴加浓hcl至ph为3.0，向混合液中添加0.45gcacl2和3ml乙酸乙酯，置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使有机溶剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使发酵液与有机溶剂分成两相，上清即为hsaf有机溶剂层，吸取1ml吹干加入500μl甲醇溶解后通过hplc对其含量进行检测。[0071]对比例与实施例5和实施例6的结果对比如图6所示：①通过实施例5和实施例6nka树脂吸附获得的hsaf提取物外观呈浅黄色，而乙酸乙酯提取物为深褐色，说明乙酸乙酯萃取将更多的色素同hsaf一起提取出来；②实施例6nka吸附法提取的hsaf纯度能达到31.07％，这是乙酸乙酯方法(8.67％)的3.58倍，说明nka树脂吸附能明显提高最终的hsaf含量。[0072]对比例2：[0073]同实施例4和实施例6的操作方法，区别仅在发酵液在动态吸附之前不经过过光降解去除发酵液中的atb的，而是直接用于动态吸附。结果可如图6(c)和(e)所示，未通过光照处理，得到的hsaf产物外观为深黄色，而且hsaf纯度只有18.38％，远低于经过光照处理的。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
