一种叶斑菌病原菌LAMP检测引物、试剂盒及LAMP快速检测方法

一种叶斑菌病原菌lamp检测引物、试剂盒及lamp快速检测方法
技术领域
1.本发明涉及植物病原菌检测的技术领域，具体而言，涉及一种叶斑病病原菌的lamp检测引物、试剂盒及lamp快速检测方法。


背景技术：

2.黄花菜(hemerocallis citrina baroni)，又称为金针菜、安神菜、忘忧草，学名为萱草,属百合科多年生宿根草本植物。其食用部分为含苞末放的花蕾，营养丰富,含多种糖类、蛋白质、维生素、无机盐及多种人体必需的氨基酸，是我国传统特色蔬菜之一。该植物广泛种植于中国、朝鲜韩国和日本等地，具有观赏和蔬菜价值。此外，黄花菜的花蕾合成代谢物含有丰富的芦丁、橙皮苷、秋水仙碱等，对治疗焦虑、浮肿、抑郁等症状有效，具有抗菌消炎、清热利湿、明目安神、美容养颜等功效，可作为中药材和现代药用植物。随着黄花菜栽培的兴起和特色蔬菜产业的发展，种植面积逐渐扩大，其病害发生情况也日趋严重，对产业造成了巨大的经济损失。
3.黄花菜上常发生多种叶部及花薹病害，包括叶枯病、叶斑病、褐斑病、茎枯病、黄叶病、炭疽病、红腐病等，其病原多为炭疽菌(colletotrichum sp.)、镰刀菌(fusarium sp.)、轮斑病菌(pestallozzia sp.)、大茎点霉(macrophoma sp.)、茎点霉(phoma sp.)和盘长孢菌(gloeosporium sp.)等。
4.目前对病原菌的检测常见采用pcr技术，但是该技术检测的效率低，不利于对植物的防护。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种叶斑病病原菌的lamp检测引物、试剂盒及lamp快速检测方法，用以实现快速对叶斑病病原菌的检测，提高检测效率。
6.本发明通过以下技术方案实现：所述引物包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip，所述引物系列如下：
7.f3：5
’‑
accagtgcggtggtatcg-3’；
8.b3：5
’‑
caagagcgcctgtcactc-3’；
9.fip： 5
’‑
ggatcgatgggaagaagggcgcaagcgaaccatcgagaagt-3’；
10.bip： 5
’‑
catacgacgactcgacaagcgcccaccacccaaaaaaacgac-3’。
11.提供一种叶斑病病原菌的lamp检测试剂盒，包括上述引物。
12.为了更好的实现本发明，进一步的，所述试剂盒还包括dntps、8u/μlbst dna聚合酶、10
×
isothermal amplificationbuffer和mgso4。
13.提供一种叶斑病病原菌的lamp检测反应体系，反应体系包括：10 um的fip和bip引物各4μl，10um f3和b3引物0.5μl，10mm dntps2.5μl，8u/μlbst dna聚合酶1μl，50mm mgso44μl，10
×
isothermalamplificationbuffer 2.5μl，用灭菌超纯水补平至25μl。
14.提供一种叶斑病病原菌的lamp检测方法，包括以下步骤：
15.s1：获取叶斑菌病原菌的ef-1α基因保守区利用primer explore v5 在线设计引物；
16.s2：制备25μl的检测反应体系；
17.s3：将待测样品总dna于s2所述的检测反应体系中进行lamp扩增，反应结束后，取反应产物；
18.s4：将反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，或/和用sybr green i染料观察lamp反应液变化；
19.s5：lamp反应产物在琼脂糖凝胶电泳出现连续呈弥散状条带为阳性，存在叶斑病病原菌；和/或反应液呈现翠绿色为阳性，存在叶斑病病原菌，淡橙色为阴性，不存在叶斑菌病原菌。
20.为了更好的实现本发明，进一步的，所述检测反应体系中的反应条件为：温度为60℃、反应时间为60min。
21.为了更好的实现本发明，进一步的，所述s1中获取叶斑病病原菌的操作步骤如下：
22.步骤一：剪取罹病叶片病健交界部分的组织进行消毒，再用无菌水漂洗，用无菌滤纸吸干水分后将其放置于含有链霉素的pda平板上，26℃黑暗培养；
23.步骤二：将长出的菌落转接至pda培养基，通过单孢分离进行纯化后用pda斜面保存于4℃备用，得到分离纯化的菌株。
24.为了更好的实现本发明，进一步的，还包括对叶斑病病原菌的鉴定，包括以下步骤：
25.sa：将分离纯化的菌株接种与pda培养基中，26℃黑暗培养7天后刮取菌丝利用ctab法提取真菌dna；
26.sb：通过引物its4/its5和ef1-728f/ef1-986r扩增核糖体转录间区和翻译延长因子基因部分序列；
27.sc：构建pcr反应体系，该pcr反应体系为2
×
es taq master mix 25 μl、总dna模板2μl、10μm上下游引物各2μl、ddh2o 19μl，扩展反应取反应产物；
28.sd：反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，进行序列测定，获序列在 ncbi数据库进行blastn比对分析，利用mega6软件中邻接法构建系统发育树，采用自举法进行1000次重复检验。
29.为了更好的实现本发明，进一步的，pcr反应条件94℃预变性5min； 94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
30.一种试剂盒在植物叶斑病病原菌鉴定中的应用，所述植物为黄花菜。
31.本发明的有益效果是：
32.本发明基于叶斑病病原菌的ef-1α序列设计了一组可以特异性检测叶斑病病原菌的lamp检测引物，该叶斑病病原菌为f.armeniacum，通过该检测引物能够快速检测出病原菌，提高检测的工作效率。
33.本发明通过设置lamp检测引物，并通过lamp检测引物和lamp 检测技术的结合快速检测叶斑病病原菌，lamp检测技术的检测特异性强、检测时间短、灵敏度高、对仪器设备的要求低，结果可视化易判断。
andiyazi)、柑橘炭疽病菌(colletotrichum gloeosporioides)、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、高粱附球菌(epicoccum nigrum)按实施例 lamp检测方法进行检测，通过加入sybr green i染料染色和1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，来判断lamp引物特异性，检测结果如图1所示，图中所显示的a为：sybr green i检测lamp产物，b为凝胶电泳检测lamp产物，m为dl2000 marker；另外数字1～3为黄花菜叶斑病原菌； 4为茭白鞘腐病菌；5为胶孢炭疽菌；6为立枯丝核菌；7为高粱附球菌； 8为无菌水阴性对照。
58.测试结果为：黄花菜叶斑病病原菌dna为模板的lamp产物电泳条带呈弥散状，颜色变为绿色，说明发生了阳性反应，存在叶斑菌病原菌，而以其他病原真菌dna为模板的lamp检测产物电泳无条带，颜色仍为橙色，表明其为阴性反应，从而表明该lamp检测体系可以特异性地检测出黄花菜叶斑病病原菌。
59.实验例-lamp及常规pcr检测的灵敏度检测
60.将1000ng/μl的标准的黄花菜叶斑病病原菌的dna按照10倍浓度梯度稀释至1fg/μl，分别作为反应模板，用常规pcr检测体系及lamp 体系进行检测，根据扩增产物的颜色变化和琼脂糖凝胶电泳观察结果显示，如图2所示，图中a为sybr green i检测lamp产物，b为凝胶电泳检测lamp产物，c为凝胶电泳检测pcr产物，m为dl 2000marker；其中1～7为1000ng/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、 1pg/μl浓度梯度的黄花菜叶斑病菌dna。
61.从lamp反应体系的最低检测限度为100pg/μl，而普通pcr反应的最低检测限度为1ng/μl，说明该lamp检测方法的灵敏度是常规pcr 检测方法的10倍，如图中所示。
62.实验例-实际样品中病原菌的检测
63.操作方法如下:
64.将人工接种黄花菜叶斑病病原菌的黄花菜叶片在接种4d后提取总dna，将其作为模板进行lamp扩增，结果显示，未接种叶斑病病原菌的黄花菜叶片没有检测到黄花菜叶斑病菌，而接种后的植株上都检测到了病原菌，如图3的a所述，图中3的a为人工接种黄花菜叶片lamp检测；m为dl 2000marker；另外1为阳性黄花菜叶斑病菌株；2和3为接种了黄花菜叶斑病病原菌的叶片；4和5为未接种病原菌的健康植株；6 为无菌水阴性对照。
65.另外对2株采集于浙江丽水市缙云县显示黄花菜叶斑病症状的叶片样品进行了组织分离，通过菌株形态学和分子生物学等的鉴定，确定2 株样品都分离得到了黄花菜叶斑病菌，而另外取2株健康植株叶片未分离到病原菌。同时用相同样品进行lamp检测，结果显示这2份病样均产生了阳性反应，与病原菌分离结果一致，而黄花菜健康组织中没有发生阳性反应。这说明可以用该lamp技术进行黄花菜叶斑病田间样品的快速诊断，如图3的b所示，图中b为田间采样发病植株叶片lamp检测； 1～3为田间发病植株叶片；4和5为田间健康植株叶片；6为无菌水阴性对照。
66.本发明还提供获取叶斑病病原菌的操作以及对叶斑病病原菌鉴定，分别是形态学鉴定和分子生物学鉴定，具体操作如下：
67.采集明显有叶斑病症状的叶片，摘取典型症状的叶片进行观察，记录发病症状。采用组织分离法分离病原菌，剪取罹病叶片病健交界部分大小为5
×
5mm的组织置于75％酒精中消毒30s，2％次氯酸钠消毒1min，再用无菌水漂洗3次，用无菌滤纸吸干水分后将其放置于含有链霉素(50 μg/ml)的pda平板上，26℃黑暗培养。将长出的菌落转接至新的pda 培养
基，通过单孢分离进行纯化后用pda斜面保存于4℃备用。
68.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，pda)培养基：葡萄糖20g、土豆200g、琼脂20g、蒸馏水1000ml；不加琼脂为马铃薯葡萄糖(potato dextrose，pd)液体培养基；康乃馨琼脂(carnationleaf-piece agar，cla)培养基：康乃馨叶片若干、琼脂粉20g、蒸馏水1 l。
69.对黄花菜叶斑病病原菌的致病性测定：
70.采用孢子液活体接种进行柯赫氏法则验证。选取代表性供试菌株在 pd培养基中26℃，180r/min震荡培养5d，用无菌纱布过滤后，收集孢子液。通过血球计数板计算，用无菌水配制浓度为1
×
106个/ml的分生孢子悬浮液，选取健康的40cm高的盆栽黄花菜植株进行致病力测定，将植株叶片用70％乙醇擦拭表面消毒后，用移液枪吸取孢子液滴于叶片上，每片叶片滴3～4个点，每个点10μl。用无菌水接种作为对照。将所有接种体置于25℃恒温、相对湿度80％～90％条件下培养，逐日观察发病情况。叶片发病后，对发病叶片再次进行病原菌分离鉴定。接种实验重复2次，每个处理3个盆栽重复。
71.致病性的测试结果：
72.接种4d后观察到叶片发病，黄花菜叶斑病主要为害叶片，在叶面或叶缘出现。最初为水浸状淡黄色斑点，后扩大成梭形病斑，边缘褐色，中央灰色，具有黄色晕圈，如图4所示。病害发生后期，病斑扩大，引起穿孔、叶片破裂。病斑也可扩展至茎部，在茎秆上也出现褐色、梭形病斑，后扩大环绕茎部，引起茎秆枯萎。通常，在田间高湿度条件下，侵染的叶片和茎秆病斑处可见白色或红色霉层。对采集的罹病叶片和茎秆进行组织分离，从20份病害样品中共分离纯化获得20株菌株。
73.如图5所示，图5中a为盆栽活体接种6d后发病症状；b为接种叶片典型病斑；ck为对照，a中具体表现为水浸状到黄褐色的坏死梭形斑，并具有明显黄色晕圈，后期病斑扩展引起穿孔和叶片枯萎。该接种症状与田间自然发病症状相似，而对照接种叶片不表现出症状。从接种病斑处可镜检到病原菌分生孢子，且可再次从病斑处分离出病原菌，经形态学和分子鉴定为与接种所用一致的病原菌为f.armeniacum，由此说明f.armeniacum 为黄花菜叶斑病的病原菌。
74.另外还对病原菌进行形态学鉴定：
75.将分离纯化的菌株接种于pda平板上，将菌株接种于cla平板上 26℃黑暗培养，待其产生孢子后在光学显微镜下观察大小分生孢子和厚垣孢子形态特征，肾形或卵圆形，壁较厚，具有0～1个隔膜，大小为7.7～14.1
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2.7～5.0μm。在cla培养基上培养7d后或者在发病植株病斑处，易产生大型分生孢子，镰刀状，薄壁，有一个长而尖的顶端细胞和一个有凹口的基底细胞，3～5个隔膜，大小为20.5～38.5
×
2.8～5.1μm。厚垣孢子近圆形，壁光滑，常串生如图6-c～f，依据该病原菌的形态学特征可将该病原菌初步鉴定为fusarium armeniacum。如图6所示，其中a为pda平板上菌落正面；b为pda平板上菌落背面；c为大型分生孢子梗；d为大型分生孢子；e为小型分生孢子：f为厚垣孢子。
76.除此持外，还有对病原菌分子生物学鉴定，具体操作如下：
77.将分离纯化的菌株接种于pda培养基中，26℃黑暗培养7d后刮取菌丝利用ctab法提取真菌dna(lee and taylor,1990)。采用通用引物 its4/its5(white et al.,1990)和ef1-728f/ef1-986r(carbone et al.,1999)扩增核糖体转录间区(its)和翻译延长因子
(ef-1α)基因部分序列。
78.pcr反应体系为50μl：2
×
es taq mastermix 25μl、总dna模板2 μl、10μm上下游引物各2μl、ddh2o 19μl。
79.pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s， 72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
80.扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，委托上海生物工程有限公司进行序列测定。所获序列在ncbi数据库进行blastn比对分析。利用 mega 6软件中邻接法(neighbor-joining，nj)构建系统发育树，采用自举法(bootstrap)进行1000次重复检验(tamura et al.,2013)。
81.具体是以代表菌株hhcj-4的基因组dna为模板，扩增its和ef-1α部分基因序列，获得大小约为550bp和300bp的片段。将pcr产物纯化后测序，并将序列提交到至genbank(登录号分别为：mn647064和 mn650204)；blastn同源性比对显示，所测序列与ncbi中已知的 f.armeniacum菌株序列具有99.8％到100％的核苷酸相似性。如 f.armeniacum voucher rifa 180(登录号为kf624790)和f.armeniacummrc 2190(登录号为mh582288)等。
82.此外，hhcj-4的its和ef-1α序列同样与fusarium-id数据库中f. armeniacum菌株具有98.9％到99.8％的核苷酸相似性(geiser et al.,2004)。
83.利用hhcj-4以及镰刀菌属不同种菌株的ef-1α序列进行多序列比对及系统发育树构建。进化分析结果显示，hhcj-4与f.armeniacum菌株聚集于一个分支，如图7所示。因此，基于病原菌形态特征、ef-1α序列同源性比对和系统发育分析将该黄花菜叶斑病病原菌鉴定为f.armeniacum。
84.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。