用于肺癌筛查的组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于肺癌筛查的组合物及其应用。


背景技术：

2.肺癌是全球发病率最高、死亡率最高的癌症之一。在我国，肺癌发病率、死亡率也居首位。常规的筛查肺癌的手段除了低剂量螺旋ct(ldct)，还有一些蛋白标志物，例如：癌胚抗原(cea)、鳞状细胞癌抗原(scc)、神经元特异性烯醇化酶(nse)等。但这些手段在灵敏性和特异性方面各参差不齐。目前，dna甲基化已被证明具有组织特异性,可用于癌症检测，并可根据循环肿瘤dna(ctdna)甲基化特征追踪到肿瘤原发部位。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供了一种肺癌筛查的组合物，所述组合物包括用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸，所述组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，以及癌症患者的预后检测，降低了侵入性检测造成的危害，并且具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
4.本发明具体技术方案如下：
5.1.一种用于肺癌筛查的组合物，所述组合物包括用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸。
6.2.根据项1所述的组合物，其中，所述mir657基因的靶序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.3.根据项1或2所述的组合物，其中，所述用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸包括探针组合物，所述探针组合物用于与所述mir657基因的靶序列杂交。
8.4.根据项3所述的组合物，其中，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的cg高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的cg低甲基化的区域杂交。
9.5.根据项4所述的组合物，其中，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的cg高甲基化的区域的正义链和反义链的每个核苷酸杂交。
10.6.根据项4所述的组合物，其中，所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的cg低甲基化的区域的正义链和反义链的每个核苷酸杂交。
11.7.根据项5或6所述的组合物，其中，n和m均是1-10中的任意整数。
12.8.根据项7所述的组合物，其中，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选的，x1为0-100中的任意整数；
13.优选的，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选的，x2为0-100中的任意整数。
14.9.根据项4-8中任一项所述的组合物，其中，所述第一探针组合物包括如seq id no:2-3所示的核苷酸序列；所述第二探针组合物包括如seq id no:4-5所示的核苷酸序列。
15.10.根据项1或2所述的组合物，其中，所述用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸包括：
16.引物，所述引物为所述mir657基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列。
17.11.根据项1-2以及10中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸包括：
18.探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述mir657基因的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列。
19.12.根据项1-2以及10-11中任一项所述的组合物，所述组合物还包括将mir657基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。
20.13.根据项1-2以及10-12中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸还包括：
21.优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
22.14.mir657基因在制备用于肺癌筛查的试剂盒中的用途。
23.15.一种试剂盒，其包含项1-13中任一项所述的组合物。
24.16.项1-13中任一项所述的组合物在制备用于肺癌筛查的试剂盒中的用途。
25.17.一种芯片，其包含项1-9中任一项所述的组合物。
26.18.一种肺癌筛查的方法，其包括：
27.检测mir657基因的靶序列甲基化水平，以及
28.基于所述甲基化水平来判断受试者罹患肺癌的风险。
29.发明的效果
30.本发明的发明人利用表观基因组和生物信息学技术，通过分析肺癌的全基因组甲基化数据，寻找到了一个与肺癌相关的甲基化基因，并确定了肺癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且，通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离dna的检测。
31.本发明所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
具体实施方式
32.下面对本发明做以详细说明。虽然显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
33.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
34.本发明提供了一种用于肺癌筛查的组合物，所述组合物包括用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸。
35.所述甲基化指的是发生在cpg二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种对稳定的修饰状态，在dna甲基转移酶的作用下，可随dna的复制过程遗传给新生的子代dna，是一种重要的表观遗传机制，dna甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肿瘤的发生关系密切。异常甲基化包括抑癌基因和dna修复基因的高甲基化、重复序列dna的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。
36.本发明所述的检测靶序列甲基化可以为检测靶序列的甲基化水平、甲基化程度或甲基化状态，当分析这样的靶序列的甲基化水平、程度或状态时，本领域技术人员可以使用定量测定方法来确定甲基化。
37.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述mir657基因的靶序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。
38.其核苷酸序列为：
39.gcaccaggatattgttggagaggacagccgtgcggcgtctggggctgacggggccacg
40.该序列是未经重亚硫酸盐转化的序列。
41.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸包括探针组合物，所述探针组合物用于与所述mir657基因的靶序列杂交。
42.所述探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链dna，其可利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链dna或rna以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。在本技术中，与探针互补结合或杂交的区域为特异性靶区域，多个探针组合成探针组合物。
43.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的cg高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的cg低甲基化的区域杂交。
44.所述高甲基化指的是经重亚硫酸盐转化后，碱基c变成碱基t，但是如果是碱基cg，则碱基c保持不变；
45.所述低甲基化指的是经重亚硫酸盐转化后，所有的碱基cg都没有发生甲基化，碱基c均变成碱基t。
46.由于每个人的甲基化状态不同，经重亚硫酸盐转化得到的序列也不同，如seq id no:6所示的核苷酸序列是一种极端的情况，即该区段所有的cg都处于高甲基化状态，其互补链的高甲基化状态序列如seq id no:7所示。
47.seq id no:6的核苷酸序列为：
48.gtattaggatattgttggagaggatagtcgtgcggcgtttggggttgacggggttacg
49.seq id no:7的核苷酸序列为：
50.cgtggtttcgttagttttagacgtcgtacggttgttttttttaataatattttggtgt
51.同理，由于每个人的甲基化状态不同，如seq id no:8所示的核苷酸序列是一种极端的情况，即所有的cg都处于低甲基化状态，其互补链的低甲基化状态序列如seq id no:9
所示。
52.seq id no:8的核苷酸序列为：
53.gtattaggatattgttggagaggatagttgtgtggtgtttggggttgatggggttatg
54.seq id no:9的核苷酸序列为：
55.tgtggttttgttagttttagatgttgtatggttgttttttttaataatattttggtgt
56.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的cg高甲基化的区域的正义链和反义链的每个核苷酸杂交。
57.所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的cg低甲基化的区域的正义链和反义链的每个核苷酸杂交。
58.对于第一探针组合物和第二探针组合物中探针的个数，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行确定，例如，m和n可以为1-10中的任意整数，m和n既可以相同，也可以不同。
59.例如，m和n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
60.在本发明优选的一种具体实施方式中，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选的，x1为0-100中的任意整数；
61.优选的，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选的，x2为0-100中的任意整数。
62.其中，x1和x2可以相同，也可以不同，例如，当x1为0时，表明第n-1探针的尾部与第n个探针的首部相连接，同理，当x2为0时，表明第m-1探针的尾部与第m个探针的首部相连接。
63.本发明通过将探针组合物与经过重亚硫酸盐转化的靶序列进行杂交，其中，高甲基化的第一探针组合物与cg高甲基化的区域杂交，低甲基化的第二探针组合物与cg低甲基化的区域杂交，从而能够高效准确地检测靶序列的甲基化水平，进而能够用于肺癌筛查。
64.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述高甲基化的第一探针组合物包括如seq id no:2和seq id no:3所示的核苷酸序列。
65.seq id no:2所示的核苷酸序列为：
66.ctaaaaaaaataacgaaaaacacgtaaccccgtcaaccccaaacgccgcacgactatcctctccaacaatatcctaatactaaataataactcaaacgactccaacatcaataattttat
67.seq id no:3所示的核苷酸序列为：
68.acaaaatcactaatactaaaatcgcctaaatcatcactcaacaccaaaatattattaaaaaaaacaaccgtacgacgtctaaaactaacgaaaccacgtatccttcgccacttcttccaa
69.所述低甲基化的第二探针组合物包括如seq id no:4和seq id no:5所示的核苷酸序列。
70.seq id no:4所示的核苷酸序列为：
71.ctaaaaaaaataacaaaaaacacataaccccatcaaccccaaacaccacacaactatcctctccaacaatatcctaatactaaataataactcaaacaactccaacatcaataattttat
72.seq id no:5所示的核苷酸序列为：
73.acaaaatcactaatactaaaatcacctaaatcatcactcaacaccaaaatattattaaaaaaaacaaccatacaacatctaaaactaacaaaaccacatatccttcaccacttcttccaa
74.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述用于检测mir657基因的靶序列甲基化
的核酸包括：
75.引物，所述引物为所述mir657基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列。
76.其中，如果使用亚硫酸氢盐对待测样本nda进行转化，则用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸包括对mir657基因的靶序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列。
77.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸包括：
78.探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述mir657基因的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列。
79.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述组合物还包括将mir657基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂，例如试剂可以为亚硫酸氢盐等。
80.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述用于检测mir657基因的靶序列甲基化的核酸还包括：
81.优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
82.所述阻断剂是为了提高pcr扩增引物的扩增特异性，阻断剂核苷酸序列的5’端与正向或反向引物的3’端核苷酸序列有大于或等于5个核苷酸的重叠区域，阻断剂与正向或反向引物互补与目标基因靶序列dna的同一条链，阻断剂的解链温度高于正向或者反向引物超过(包括)5℃，阻断剂的核苷酸序列包含至少一个cpg二核苷酸序列，并与亚硫酸氢盐转化后的未发生甲基化的目标基因靶序列dna的序列互补。因此，当所要检测的生物样本的基因组dna是处于甲基化和非甲基化状态的混合物时，尤其是处于甲基化状态的dna远远少于处于非甲基化状态的dna的情况下，处于非甲基化状态的dna经亚硫酸氢盐转化后，会优先与阻断剂相结合，从而以及dna模板与pcr义务结合，因而不发生pcr扩增，而处于甲基化状态的dna不与阻断剂相结合，因而与引物集合，发生pcr扩增，之后直接或间接地检测通过扩增获得的片段。
83.本发明提供了mir657基因在制备用于肺癌筛查的试剂盒中的用途。
84.本发明提供了一种试剂盒，其包括上述所述的组合物。
85.在本发明优选的一种具体实施方式中，所述试剂盒还包含用于容纳受试者生物样品的容器，优选的，所述试剂盒还包括使用和解释检测结果的说明。
86.所述生物样品例如可以为外周血全血、血浆或血清。
87.本发明对于使用上述所述的试剂盒检测靶序列甲基化水平的方法，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如本发明提供了一种使用上述所述的试剂盒检测靶序列甲基化水平的方法，其包括下述步骤：
88.采集受试者样品；
89.提取纯化所述样品中的dna；
90.针对纯化的dna样品构建用于测序的dna文库；
91.用重亚硫酸盐转化所述构建的dna文库；
92.预pcr扩增所述经重亚硫酸盐转化的dna文库；
93.利用探针组合物对经预pcr扩增的样品进行杂交捕获；
94.利用pcr扩增经杂交捕获后的产物；
95.对pcr扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；
96.对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；
97.基于所述样本的平均甲基化水平判读所述患者的患病情况，如果小于阈值0.83为癌症样本，如果大于0.83为健康人样本。
98.还例如，本发明提供了一种使用上述所述的试剂盒检测靶序列甲基化水平的方法，其包括下述步骤：
99.(1)抽取受试者外周血，分离血浆或血清；
100.(2)抽取血浆或血清中的游离dna；
101.(3)使用试剂处理步骤(2)所得到的游离dna，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转为为尿嘧啶或其他碱基，即mir657基因的靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；
102.(4)将经步骤(3)处理过的游离dna与dna聚合酶和所述mir657基因的靶序列的引物接触，使得所述经处理的mir657基因的靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的mir657基因的靶序列如果发生dna聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的mir657基因的靶序列如果不发生dna聚合反应，则不被扩增；
103.(5)用探针检测扩增产物；
104.(6)基于所述扩增产物是否存在，确定所述mir657基因的靶序列的至少一个cpg二核苷酸的甲基化状态，从而确定mir657基因的靶序列的甲基化水平。
105.本发明提供了上述所述的组合物在制备用于肺癌筛查的试剂盒中的用途。
106.本发明提供了一种芯片，其包含上述所述的组合物。
107.所述芯片又称为基因芯片，其测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。
108.所述芯片的制备主要是以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cdna作为探针按顺序排列在载体上。
109.本发明所述芯片是基于亚硫酸盐处理后的dna序列杂交的信号探测，亚硫酸盐处理是将非甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，然后再将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，最后进行芯片杂交；最后根据荧光颜色判断加入碱基的类型，进而确定该位点是否被甲基化。
110.本发明提供了癌筛查的方法，其包括：
111.检测mir657基因的靶序列甲基化水平，以及
112.基于所述甲基化水平来判断受试者罹患肺癌的风险。
113.实施例
114.本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
115.实施例1筛选用于检测mir657基因的靶序列
116.利用tcga公共数据库中的450k甲基化芯片数据，筛选肺癌组织(case，729个)和癌旁组织(control，320个)中差异甲基化位点。利用champ(一个专门用于甲基化450k数据分析的r包)选择case-control中均值或中位数的差值大于0.25且p《0.01的位点，结合基因的功能说明，最终确定了用于肺癌筛查的mir657基因的靶序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示，核苷酸序列为：
117.gcaccaggatattgttggagaggacagccgtgcggcgtctggggctgacggggccacg
118.然后利用随机森林模型，确定其阈值为0.83，其灵敏性和特异性分别为91.1％和92.1％。根据所得到的靶序列区域，定制探针组合物(panel)，其包括高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，其中，第一探针组合物包括如seq id no:2-3所示的核苷酸序列，第二探针组合物包括如seq id no:4-5所示的核苷酸序列，其中
119.seq id no:2所示的核苷酸序列为：
120.ctaaaaaaaataacgaaaaacacgtaaccccgtcaaccccaaacgccgcacgactatcctctccaacaatatcctaatactaaataataactcaaacgactccaacatcaataattttat
121.seq id no:3所示的核苷酸序列为：
122.acaaaatcactaatactaaaatcgcctaaatcatcactcaacaccaaaatattattaaaaaaaacaaccgtacgacgtctaaaactaacgaaaccacgtatccttcgccacttcttccaa
123.seq id no:4所示的核苷酸序列为：
124.ctaaaaaaaataacaaaaaacacataaccccatcaaccccaaacaccacacaactatcctctccaacaatatcctaatactaaataataactcaaacaactccaacatcaataattttat
125.seq id no:5所示的核苷酸序列为：
126.acaaaatcactaatactaaaatcacctaaatcatcactcaacaccaaaatattattaaaaaaaacaaccatacaacatctaaaactaacaaaaccacatatccttcaccacttcttccaa
127.然后在血浆样本中验证，其实验检测方法如下：
128.1.1.cfdna提取纯化
129.1.1.1.血浆样本制备：
130.4℃、2000g离心血液样本10min，将血浆转移到一个新的离心管中。4℃、16000g离心血浆样本10min,根据使用的收集管类型，执行下一步,本实验中使用的收集管类型为其他。
131.表1
[0132][0133]
1.1.2.裂解和结合
[0134]
1.1.2.1.按照下表准备结合溶液/珠子混合物，然后彻底混匀。
[0135]
表2
[0136][0137]
加入适量体积的血浆样品。
[0138]
1.1.2.2.彻底混匀血浆样品和结合溶液/珠子混合物。
[0139]
1.1.2.3.在旋转混匀仪上充分的结合10min，使cfdna结合到磁珠上。
[0140]
1.1.2.4.将结合管放在磁力架上5min，直到溶液变得澄清，磁珠完全吸附在磁力架上。
[0141]
1.1.2.5.用移液管小心的弃去上清，继续保持管子在磁力架上几分钟，用移液管移去残留上清。
[0142]
1.1.3.洗涤
[0143]
1.1.3.1.将珠子重悬在1ml洗涤溶液中。
[0144]
1.1.3.2.将重悬液转移到新的无吸附1.5ml离心管中。保留结合管。
[0145]
1.1.3.3.将含有珠子重悬液的离心管置于磁力架上，20s。
[0146]
1.1.3.4.将分离得到的上清，吸出洗涤结合管，将清洗后的残留珠子再次收集到重悬液中，弃掉裂解/结合管。
[0147]
1.1.3.5.管子置于磁力架上2min，直到溶液变得澄清，珠子聚集在磁力架，用1ml移液器移除上清。
[0148]
1.1.3.6.管子留在磁力架上，用200μl移液器尽可能移除残留的液体。
[0149]
1.1.3.7.将管子从磁力架取下来，加入1ml洗涤溶液，涡旋30s。
[0150]
1.1.3.8.置于磁力架2min，直到溶液澄清，珠子聚集在磁力架上，用1ml移液管移除上清。
[0151]
1.1.3.9.管子留在磁力架上，用200μl移液器彻底移除残留液体。
[0152]
1.1.3.10.将管子从磁力架取下，加入1ml 80％乙醇，涡旋30s。
[0153]
1.1.3.11.置于磁力架上2min，溶液变得澄清，用1ml移液器移去上清。
[0154]
1.1.3.12.管子留在磁力架上，用200μl移液器移去残留液体。
[0155]
1.1.3.13.用80％乙醇重复上述1.1.3.10.-1.1.3.12.步骤一次，尽可能除去上清。
[0156]
1.1.3.14.管子留在磁力架上，空气中干燥珠子3～5分钟。
[0157]
1.1.4.洗脱cfdna
[0158]
1.1.4.1.按照下表加入洗脱液。
[0159]
表3
[0160][0161]
1.1.4.2.涡旋5min，置于磁力架上2min，溶液变得澄清，吸取上清液中的cfdna。
[0162]
1.1.4.3.纯化的cfdna立即使用，或者将上清转移至新的离心管中，-20℃保存。
[0163]
1.2.gdna打断与纯化：
[0164]
1.2.1.按照qubit浓度，取2μg gdna，加水补至125μl，加入到covaris130μl打断管中，设置程序：50w，20％，200个循环，250s。
[0165]
1.2.2.打断结束后取1μl样品使用agilent2100进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。
[0166]
对于cfdna样品，agilent2100进行片段检测，直接qubit用于后续的实验。
[0167]
1.3.末端修复、3’端加“a”：
[0168]
1.3.1.取20ng打断后的gdna或cfdna至pcr管中，用无核酸酶水补至50μl，加入以下试剂，涡旋混匀：
[0169]
表4
[0170]
组分体积gdna/cfdna50μl终止修复和a加尾缓冲液7μl终止修复和a加尾酶混合物3μl总体积60μl
[0171]
1.3.2.设置以下程序在pcr仪上进行反应：热盖温度85℃。
[0172]
表5
[0173]
温度时间20℃30min65℃30min4℃∞
[0174]
1.4.接头连接及纯化：
[0175]
1.4.1.参照下表将接头提前稀释成合适的浓度：
[0176]
表6
[0177]
每50μl er和at反应的片段化的dna接头浓度1μg10μm500ng10μm250ng10μm100ng10μm50ng10μm25ng10μm10ng3μm5ng5μm2.5ng2.5μm1ng625nm
[0178]
1.4.2.按下表配制以下试剂，轻轻吸打混匀，短暂离心：
[0179]
表7
[0180]
组分体积
末端修复、加“a”反应产物60μl接头5μl无核酸酶水5μl连接缓冲液30μldna连接酶10μl总体积110μl
[0181]
1.4.3.设置以下程序在pcr仪上进行反应：无热盖。
[0182]
表8
[0183]
温度时间20℃30min4℃∞
[0184]
1.4.4.按照以下体系，加入纯化磁珠进行实验(agencourt ampure xp磁珠提前拿至室温震荡混合均匀备用)：
[0185]
表9
[0186]
组分体积接头连接产物110μlagencourt ampure xp珠子110μl总体积220μl
[0187]
1.4.4.1.轻轻吸打混匀6次。
[0188]
1.4.4.2.室温静置孵育5-15min，将pcr管置于磁力架上3min使溶液澄清。
[0189]
1.4.4.3.移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向pcr管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。
[0190]
1.4.4.4.移除上清，再向pcr管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
[0191]
1.4.4.5.室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发。
[0192]
1.4.4.6.加入22μl的无核酸酶水，把pcr管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min。
[0193]
1.4.4.7.将pcr管置于磁力架上2min使溶液澄清。
[0194]
1.4.4.8.用移液器吸取20μl上清液，转移到新的pcr管。
[0195]
1.5重亚硫酸盐处理及纯化：
[0196]
1.5.1.预先拿出所需要的试剂，并溶解。根据下表加入各试剂：
[0197]
表10
[0198]
组分高浓度样品(1ng-2μg)体积低浓度样品(1-500ng)体积接头连接纯化产物20μl40μl重亚硫酸盐溶液85μl85μldna保护缓冲液35μl15μl总体积140μl140μl
[0199]
1.5.2.dna保护缓冲液加入液体变成蓝色。轻轻吸打混匀，然后分成两管至于pcr
仪上。
[0200]
1.5.3.设置以下程序，并运行：热盖105℃。
[0201]
表11
[0202]
温度时间95℃5min60℃10min95℃5min60℃10min4℃∞
[0203]
1.5.4.简短离心将两管相同样本合并至同一个干净的1.5ml离心管中。
[0204]
1.5.5.每个样本中加入310μl缓冲液bl(样本量少于100ng加入1μl的载体rna(1μg/μl))，涡旋混匀，简短离心。
[0205]
1.5.6.加入250μl无水乙醇到每个样本中，涡旋混匀15s，简短离心，将混合液加入到准备好的对应的离心柱中。
[0206]
1.5.7.静置1min，离心1min，将收集管中的液体重新转移到离心柱中，离心1min，弃去离心管的液体。
[0207]
1.5.8.加入500μl缓冲液bw(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去废液。
[0208]
1.5.9.加入500μl缓冲液bd(注意是否加入无水乙醇)，盖好管盖，室温放置15min。离心1min，弃去离心下的液体。
[0209]
1.5.10.加入500μl缓冲液bw(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去离下来的液体，在重复一次，共2次。
[0210]
1.5.11.加入250μl无水乙醇，离心1min，将离心柱放置到新的2ml收集管中，弃掉全部剩余液体。
[0211]
1.5.12.将离心柱放置到干净的1.5ml离心管中，加入20μl无核酸酶水到离心柱膜中心，轻轻盖上管盖，室温放置1min，离心1min。
[0212]
1.5.13.将收集管中的液体重新转移至离心柱中，室温放置1min，离心1min。
[0213]
1.6.杂交前预扩增及纯化：
[0214]
1.6.1.按下列表格配制反应体系，吹打混匀，短暂离心：
[0215]
表12
[0216][0217][0218]
1.6.2.设置以下程序并启动pcr程序：热盖105℃
[0219]
表13
[0220][0221]
1.6.3.pcr循环数根据投入dna的量不同进行调整，参考数据如下所示：
[0222]
表14
[0223][0224]
1.6.4.向反应结束后的pcr管中加入50μl agencourt ampure xp磁珠，用移液器吹打混匀，避免产生气泡(agencourt ampure xp提前室温混匀并平衡)。
[0225]
1.6.5.室温孵育5-15min，把pcr管置于磁力架上3min使溶液澄清。
[0226]
1.6.6.移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向pcr管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。
[0227]
1.6.7.移除上清，再向pcr管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
[0228]
1.6.8.室温静置5min，使残留乙醇彻底挥发。
[0229]
1.6.9.加入30μl的无核酸酶水，将离心管从磁力架取下，使用移液器，轻轻吸打重悬磁珠。
[0230]
1.6.10.室温静置2min，将200μl pcr管置于磁力架上2min使溶液澄清。
[0231]
1.6.11.用移液器将上清液转移到新的200μl pcr管中(置于冰盒上)，在反应管上标记好样本号，准备下一步反应。
[0232]
1.6.12.取1μl样品使用qubit进行文库浓度测定，记录文库浓度。
[0233]
1.6.13.取1μl样品使用安捷伦2100进行文库片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp间。
[0234]
1.7.样品与探针杂交：
[0235]
1.7.1.按照以下体系将样品文库与各种hyb阻断物混匀，标记为b：
[0236]
表15
[0237]
组分体积
预扩增产物750ng对应体积hyb人阻断物5μl接头阻断物6μl增强剂5μl
[0238]
1.7.2.将准备好的样品和hyb阻断物混合物放入真空浓缩离心机，打开pcr管盖，启动离心机，打开真空泵开关，开始浓缩。
[0239]
1.7.3.将抽干的样品重新溶在约9μl无核酸酶水中,总体积10μl，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为b。
[0240]
1.7.4.将hyb缓冲液置于室温融化，融解之后会有沉淀出现，混匀后置于65℃水浴锅内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μl hyb缓冲液置于新的200μl pcr管内，盖好管盖,标记为a,继续置于65℃水浴锅内孵育待用。
[0241]
1.7.5.通过艾吉泰康生物科技(北京)有限公司合成之前所述的甲基化探针序列：
[0242]
1.7.6.取5μl rna酶阻断物与2μl探针组合物置于200μl pcr管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为c。
[0243]
1.7.7.设置pcr仪参数，热盖100℃，95℃，5min；65℃，保持。
[0244]
1.7.8.将pcr管b置于pcr仪上，运行以上程序。
[0245]
1.7.9.pcr仪温度降至65℃时，将pcr管a置于pcr仪上孵育，盖上pcr仪热盖。
[0246]
1.7.10. 5min后，将c置于pcr上孵育，盖上pcr仪热盖。
[0247]
1.7.11.将pcr管c放置入pcr仪2min后，把移液器调至13μl，从pcr管a中吸取13μl hyb缓冲液移至pcr管c中，吸取全部pcr管b中样品移至pcr管c中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，密封管盖，盖上pcr仪热盖,65℃孵育过夜(16-24h)。
[0248]
1.8.捕获目标区域dna文库：
[0249]
1.8.1.捕获磁珠的准备
[0250]
1.8.1.1.将磁珠(dynabeads myone streptavidin t1磁珠)从4℃取出，涡旋震荡重悬。
[0251]
1.8.1.2.取50μl磁珠置于新的pcr管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清。
[0252]
1.8.1.3.从磁力架上取下pcr管，加入200μl结合缓冲液轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠。
[0253]
1.8.1.4.置磁力架上1min，移除上清。
[0254]
1.8.1.5.重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次。
[0255]
1.8.1.6.从磁力架上取下pcr管，加入200μl结合缓冲液轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
[0256]
1.8.2.捕获目标dna文库
[0257]
1.8.2.1.保持杂交产物pcr管c在pcr仪上，将准备好的200μl捕获磁珠加入到杂交后的产物pcr管c中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min(转速最好不要超过10转/min)。
[0258]
1.8.2.2.将pcr管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液。
[0259]
1.8.2.3.向pcr管c内加入200μl的洗涤缓冲液1(23.5ml无核酸酶水，1.25ml 20
×
ssc，250μl 10％sds)，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min(转速最好不要超过10转/min)，然后短暂离心，将pcr管放于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清。
[0260]
1.8.2.4.加入200μl的65℃预热后的洗涤缓冲液2(24.6ml无核酸酶水，125μl 20
×
ssc，250μl 10％sds)，轻轻吸打6次混匀，置于混匀仪上65℃孵育10min，转速800转/min进行清洗。
[0261]
1.8.2.5.短暂离心，将pcr管放于磁力架上2min，移除上清。使用洗涤缓冲液2再重复2次清洗，共计3次。最后一次彻底移除洗涤缓冲液2。
[0262]
1.8.2.6.pcr管继续置于磁力架上，向pcr管内加入200μl 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液，室温晾干2min。
[0263]
1.8.2.7.向pcr管加入30μl无核酸酶水，从磁力架上取下pcr管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
[0264]
1.9.捕获后扩增及纯化
[0265]
1.9.1.根据下表配制反应体系进行捕获文库的富集，轻轻吹打混匀后，短暂离心：
[0266]
表16
[0267][0268]
1.9.2.设置以下程序，将样品置于pcr仪中，运行程序：热盖105℃。
[0269]
表17
[0270][0271]
1.9.3.pcr结束后向样品加入55μl agencourt ampure xp磁珠，用移液器轻轻吸打混匀。
[0272]
1.9.4.室温孵育5min，把pcr管置于磁力架上3min使溶液澄清。
[0273]
1.9.5.移除上清，pcr管继续置于磁力架上，加入200μl 80％无水乙醇，静置30s。
[0274]
1.9.6.移除上清，再向pcr管内加入200μl 80％无水乙醇，静置30s后彻底移除上清。
[0275]
1.9.7.室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发。
[0276]
1.9.8.加入25μl无核酸酶水，将pcr管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min。
[0277]
1.9.9.将pcr管置于磁力架上2min使溶液澄清。
[0278]
1.9.10.用移液器吸23μl上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息。
[0279]
1.9.11.取1μl文库使用qubit进行定量，记录文库浓度。
[0280]
1.9.12.取1μl样品使用agilent2100进行文库片段长度测定。
[0281]
1.9.13.使用illumina高通量测序平台进行测序。
[0282]
1.10.甲基化生信分析流程。大致如下：使用trimmomatic等质控软件查看测序质量，去除低质量的读段，然后采用bismarker等比对软件将质控后的干净的数据比对到参考基因组上，采用methykit等r包提取相应的甲基化位点。最后，计算出panel上的靶区域的平均的甲基化水平，该值结果如果低于0.83判读为癌症，如果超过0.83判读为正常。
[0283]
实施例2
[0284]
一例肺癌样本，采用本技术的panel进行检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个位点的甲基化水平，该panel中包含了5个cg甲基化位点，具体如下表：
[0285]
表18
[0286][0287]
对检测样本进行判读，由于该样本的甲基化平均水平为0.47，小于阈值0.83，因此，根据实施例1的甲基化生信分析流程，判读为癌症样本。
[0288]
实施例3
[0289]
一例肺癌样本，采用本技术的panel进行检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个位点的甲基化水平，该panel中包含了5个cg甲基化位点，具体如下表：
[0290]
表19
[0291][0292][0293]
对检测样本进行判读，由于该样本的甲基化平均水平为0.332，小于阈值0.83，因此，根据实施例1的甲基化生信分析流程，判读为癌症样本。
[0294]
实施例4
[0295]
一例肺癌样本，采用本技术的panel进行检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个位点的甲基化水平，该panel中包含了5个cg甲基化位点，具体如下表：
[0296]
表20
[0297][0298]
对检测样本进行判读，由于该样本的甲基化平均水平为0.528，小于阈值0.83，因
此，根据实施例1的甲基化生信分析流程，判读为癌症样本。
[0299]
实施例5
[0300]
一例肺癌样本，采用本技术的panel进行检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个位点的甲基化水平，该panel中包含了5个cg甲基化位点，具体如下表：
[0301]
表21
[0302][0303]
对检测样本进行判读，由于该样本的甲基化平均水平为0.406，小于阈值0.83，因此，根据实施例1的甲基化生信分析流程，判读为癌症样本。
[0304]
实施例6
[0305]
一例健康人样本，采用本技术的panel进行检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个位点的甲基化水平，该panel中包含了5个cg甲基化位点，具体如下表：
[0306]
表22
[0307][0308]
对检测样本进行判读，由于该样本的甲基化平均水平为0.878，大于阈值0.83，因此，根据实施例1的甲基化生信分析流程，判读为健康样本。
[0309]
实施例7
[0310]
一例健康人样本，采用本技术的panel进行检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个位点的甲基化水平，该panel中包含了5个cg甲基化位点，具体如下表：
[0311]
表23
[0312][0313]
对检测样本进行判读，由于该样本的甲基化平均水平为0.858，大于阈值0.83，因此，根据实施例1的甲基化生信分析流程，判读为健康样本。
[0314]
实施例8
[0315]
一例健康人样本，采用本技术的panel进行检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个位点的甲基化水平，该panel中包含了5个cg甲基化位点，具体如下表：
[0316]
表24
[0317][0318]
对检测样本进行判读，由于该样本的甲基化平均水平为0.906，大于阈值0.83，因此，根据实施例1的甲基化生信分析流程，判读为健康样本。
[0319]
实施例9
[0320]
一例健康人样本，采用本技术的panel进行检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个位点的甲基化水平，该panel中包含了5个cg甲基化位点，具体如下表：
[0321]
表25
[0322][0323]
对检测样本进行判读，由于该样本的甲基化平均水平为0.894，大于阈值0.83，因此，根据实施例1的甲基化生信分析流程，判读为健康样本。
[0324]
综上所述，本发明的发明人获得了与肺癌相关的甲基化基因，并确定了肺癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且，通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离dna的检测，并且本发明所述的组合物能够实现实时监测，具有更高的灵敏度和准确度。
[0325]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。