检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的方法、引物探针组合物、应用、试剂盒及使用方法与流程

1.本技术涉及突变检测的技术领域，更具体地说，它涉及检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的方法、引物探针组合物、应用、试剂盒及使用方法。


背景技术：

2.幽门螺杆菌（helicobacter pylori，hp）是一种革兰氏阴性菌，主要分布在胃粘膜组织中，是目前所致能够在人胃中生存的唯一微生物种类。幽门螺杆菌与胃、十二指肠等多种疾病密切相关，特别其感染与上消化道疾病有关，包括胃炎、消化性溃疡疾病、粘膜相关淋巴组织(malt)淋巴瘤和胃癌。根除hp可促进溃疡愈合、减少溃疡复发、减少胃癌发生的概率，因此根除幽门螺杆菌治疗被认为是治疗幽门螺杆菌相关疾病的有效方法。
3.目前，对幽门螺杆菌的治疗主要采用三联或四联的含有抗生素的治疗方法，其中常用抗生素药物包括克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林和左氧氟沙星。左氧氟沙星是临床上根除幽门螺杆菌常用的抗生素之一，但由于该药曾经的广泛应用，导致幽门螺杆菌的耐药率逐年上升，幽门螺旋杆菌的根除率逐年下降。目前已经明确幽门螺杆菌对喹诺酮类耐药是在喹诺酮耐药决定区（qrdr）的gyra基因突变导致的，以第87、91位氨基酸变化最为常见。这些点突变导致了细菌的dna回旋酶和拓扑异构酶构象的破坏并抑制左氧氟沙星与其之间结合，不能阻止细菌dna的复制，最终产生耐药现象。
4.在制定根除幽门螺杆菌的个体化用药方案之前，有必要了解个体内幽门螺杆菌的耐药性，从而选择敏感抗生素进行治疗，提高根除率。本试剂盒基于qpcr技术平台可快速灵敏地分析出核酸样本中是否存在已知点突变，为喹诺酮类耐药情况提供依据。
5.目前对于幽门螺杆菌耐药的检测方法主要包括药敏检测法、直接测序法、荧光pcr法等。药敏检测法为幽门螺杆菌耐药检测的金标准，幽门螺杆菌培养需要微需氧条件，并选择不同的抗生素对于这些培养后的细菌做杀菌实验，由此判断哪一种药物对幽门螺旋杆菌具有敏感性。但由于hp对培养条件要求苛刻、检出率低、培养时间较长，不利于高灵敏度的快速诊断，限制了临床的推广和应用。测序法为基因检测的“金标准”，但由于检测周期长，约需要一周，且过程复杂，操作繁琐，成本高，所以限制了其在临床上的应用。荧光pcr溶解曲线法需要先进行pcr扩增，扩增后进行熔解曲线分析；但是该方法耗时长，单探针tm值变化较小，且需要高分辨率仪器，对仪器要求苛刻。荧光taqman探针法对探针的需求量大，并且检测价格昂贵。普通arms-pcr法需要多管操作，通量低，操作繁琐，检测费用高，不适于临床检测。


技术实现要素：

6.为了实现一管即可完成多个位点突变的检测，本技术提供一种检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的方法、引物探针组合物、应用、试剂盒及使用方法。
7.第一方面，本技术提供一种检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的方法，包括以
下步骤：设计其它序列的特异性引物探针组合物以及用于扩增和检测多个靶标突变位点的目标引物探针组合物，其它序列是靶标突变位点所在序列的保守区序列或者是不同于靶标突变位点所在序列的其它基因的保守区序列；将所述目标引物探针组合物以及其它序列特异性引物探针组合物与待检测样本的模板dna混合，进行arms-pcr，并通过计算目标突变基因与其它序列的ct值的差值判断幽门螺杆菌耐药基因突变结果。
8.通过采用上述技术方案，本技术在引物探针设计时，设计了目标引物探针组合物的同时，还至少设计一组其它序列特异性引物探针组合物。这样设计的目的在于，在将本技术的引物探针组合物结合arms-pcr法进行基因检测并判断基因突变时，是可以实现将多种靶标突变位点所在序列和其它序列同时扩增；在进行判读时，通过对不同荧光素标记的目标突变基因与其它序列的ct值差值的判读，得到多种靶标突变位点的突变结果。因此采用本技术的引物探针组合物进行相关靶标位点的突变检测时，能够实现一管即可完成多个位点突变的检测，具有高效、高通量的优势。
9.可选的，其它序列是靶标突变位点所在序列的保守区序列时，靶标突变位点和其他序列分别所在的区域相隔500bp以上。
10.通过采用上述技术方案，当其它序列是靶标突变位点所在序列的保守区序列，令“靶标突变位点和所述其他序列分别所在的区域相隔500bp以上”，是为了在进行靶标突变位点所在序列和其它序列的同时扩增时，二者的扩增不会相互影响。这里，只要实现使得靶标突变位点所在序列的扩增和其它序列的扩增不会相互影响即可，申请人也可以根据实际情况适当调整“靶标突变位点和其它序列分别所在区域”之间的距离。而当其它序列是不同于靶标突变位点所在序列的其它基因的保守区序列时，则可以没有该距离限制。
11.第二方面，本技术提供一种实施上述方法的检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物，采用如下的技术方案：一种实施上述方法的检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物，所述耐药基因为幽门螺杆菌gyra耐药基因，所述目标引物探针组合物为arms引物探针组合物；所述arms引物探针组合物用于结合靶标突变位点，所述其它序列特异性引物探针组合物用于结合其它序列。
12.相关技术中设计的突变检测用引物探针组，仅仅是针对待检测的突变位点设计相关的引物探针以进行相关的突变检测。以此引物探针组结合arms-pcr法进行基因检测并判断基因突变时，由于其方法是通过检测突变管与野生型管的ct值差值来进行判读的，因此会带来检测通量小、成本高等问题。
13.通过采用上述技术方案，将本技术的引物探针组合物结合arms-pcr法进行基因检测并判断基因突变时，是可以实现将多个靶标突变位点和其它序列同时扩增。在进行判读时，通过对不同荧光素标记的目标突变基因与其它序列的ct值差值的判读，得到多种靶标突变位点突变结果。因此本技术能够通过一管即可完成多个位点的突变检测，具有高效、高通量的优势。
14.可选的，所述幽门螺杆菌gyra耐药基因的突变位点为喹诺酮类asn87-lys/ile、asp91-gly/asn/tyr。
15.可选的，所述其它序列为16s rrna基因序列；所述其他序列特异性引物探针组合
物为16s rrna基因引物探针组合物。
16.在该方案中，其它序列选择的是16s rrna基因序列，这一序列是“不同于靶标突变位点所在序列的其它基因的保守区序列”；申请人也可以根据实际情况选择将“靶标突变位点所在序列的保守区序列”作为其它序列。
17.可选的，arms引物的3’末端位于突变区域处，且所述arms引物的3’末端第2个、3个、4个或其他位置可引入至少一个错配碱基。
18.通过采用上述技术方案，能够增加引物的特异性，减少引物与靶dna有错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的引入另外一个或者多个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。
19.可选的，幽门螺杆菌gyra耐药基因的突变位点至少包括a260t、t261g、t261a、g271a、g271t和a272g中的一个。
20.可选的，所述arms引物探针组合物包括通用下游引物gyra-r、探针gyra-p和上游引物组合物，所述上游引物组合物包括a260t位点的上游引物f1、t261g位点的上游引物f2、t261a位点的上游引物f3、g271a位点的上游引物f4和上游引物f5、g271t位点的上游引物f6和上游引物f7和a272g位点的上游引物f8和上游引物f9中的至少两种；其中，a260t位点的上游引物f1，其基因序列如seq id no 1所示；t261g位点的上游引物f2，其基因序列如seq id no 2所示；t261a位点的上游引物f3，其基因序列如seq id no 3所示；g271a位点的上游引物f4和上游引物f5，上游引物f4的基因序列如seq id no 4所示，上游引物f5的基因序列如seq id no 5所示；g271t位点的上游引物f6和f7，上游引物f6的基因序列如seq id no 6所示，上游引物f7的基因序列如seq id no 7所示；a272g位点的上游引物f8和f9，上游引物f8的基因序列如seq id no 8所示，上游引物f9的基因序列如seq id no 9所示；通用下游引物gyra-r，其基因序列如seq id no 10所示；探针gyra-p，其基因序列如seq id no 11所示。
21.可选的，所述16s rrna基因引物探针组合物包括上游引物16s-f，其基因序列如seq id no 12所示；下游引物16s-r，其基因序列如seq id no 13所示；和探针16s-p，其基因序列如seq id no 14所示。
22.可选的，引物探针组合物还包括内标基因引物探针组，所述内标基因为人看家基因rnp基因。
23.可选的，所述内标基因引物探针组包括上游引物rnp-f，其基因序列如seq id no 15所示；下游引物rnp-r，基因序列如seq id no 16所示；探针rnp-p，基因序列如seq id no 17所示。
24.可选的，探针5’端标记荧光基团，探针3’端标记荧光淬灭基团。
25.可选的，所述荧光基团选自fam、tet、vic、hex、rox、cy3、cy5和cy5.5中的任意一种；所述荧光淬灭基团选自nfq-bhq、bhq1、bhq2、bhq3和tamra中的任意一种。
26.可选的，所述探针gyra-p的5’端标记fam基团作为荧光基团，3’端使用bhq1作为淬
灭基团；所述探针16s-p的5’端标记vic基团作为荧光基团，3’端使用bhq1作为淬灭基团；所述探针rnp-p的5’端标记cy5基团作为荧光基团，3’端使用bhq3作为淬灭基团。
27.第三方面，本技术提供一种上述的方法和或上述引物探针组合物在制备检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的产品中的应用，采用如下的技术方案：一种上述的方法和/或上述引物探针组合物在制备检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的产品中的应用，所述产品为检测试剂、检测试剂盒或检测芯片。
28.第四方面，本技术提供一种检测幽门螺杆菌gyra耐药基因突变检测的试剂盒，采用如下的技术方案：一种检测幽门螺杆菌gyra耐药基因突变检测的试剂盒，含有上述的引物探针组合物。
29.可选的，所述试剂盒还包括用于荧光pcr反应的pcr反应液、酶混合液、阴性对照品和阳性对照品，所述pcr反应液中含有所述引物探针组合物且溶剂为pcr缓冲液，所述酶混合液中含有1~5u/反应的taq酶和1~5u/反应的ung酶。
30.可选的，所述pcr反应液中，各引物浓度为100~800nm；各探针浓度为100~300nm。
31.通过采用上述技术方案，有效提高试剂的特异性和检测方法的灵敏度。
32.可选的，所述pcr反应液中还包括2~8mm的dntps。
33.可选的，所述阳性对照中含有gyra基因各位点的突变质粒、内标基因质粒和其它基因质粒；所述gyra基因各位点的突变质粒为多个，分别含有gyra基因的某一突变位点；所述内标基因质粒内含有内标基因，能够作为模板dna和内标基因引物探针组结合；所述其它基因质粒内含有其它基因，能够作为模板dna和所述其它序列特异性引物探针组合物结合。
34.第五方面，本技术提供一种上述试剂盒的使用方法，采用如下的技术方案：一种上述试剂盒的使用方法，引物探针组合物还包括内标基因引物探针组，所述内标基因为人看家基因rnp基因；使得引物探针组合物和所述待检测样本的模板dna混合，进行arms-pcr，使得靶标突变位点所在序列和其它序列同时进行荧光定量pcr反应；其中，arms引物探针组合物和模板dna上靶标突变位点所在的区域结合，其它序列特异性引物探针组合物和模板dna上其它序列所在的区域结合，并在检测时分别得出ct值，并通过ct值差判定待检测样本的基因突变。
35.可选的，通过ct值差判定待检测样本的基因突变时的判定方法为：s1、是否有幽门螺杆菌感染的判读内标基因的扩增ct值《38时，可进行后续判读：若hex(vic)通道无明显扩增信号或ct
hex(vic)
》37，则说明样本无幽门螺杆菌感染；若ct
hex(vic)
≤37,则说明该样本存在幽门螺杆菌感染，则进行后续突变结果过的判断；s2、突变结果判读待检测样本的fam通道有明显扩增信号且ct
fam
值≤37时，则计算fam通道的ct
fam
值与hex(vic)通道的ct
hex(vic)
值的差值δct，其中，δct=ct
fam
值-ct
hex(vic)
值，通过δct值来判定结果：δct＜9，则判定gyra基因的检测位点为突变型，δct≥9，则判定gyra基因的检测位点为野生型；
待检测样本的fam通道无明显扩增信号或ct
fam
值》37时，则判定gyra基因的检测位点为野生型或低于检测限。
36.可选的，荧光定量pcr反应的程序包括：1）37℃ 5min；2）95℃ 5min；3）95℃ 15s；4）60℃ 1min；其中，3）和4）共进行45个循环，并在每个循环的退火阶段采集荧光信号。
37.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、本技术提供了一种检测幽门螺杆菌gyra耐药基因突变的引物探针组合物，其在设计了arms引物探针组合物的同时，还至少设计一组其它序列特异性引物探针组合物；因此，在将本技术的引物探针组合物结合arms-pcr法进行基因检测并判断基因突变时，是可以实现将多个靶标突变位点所在序列和其它序列的同时扩增；并且在进行判读时，通过对不同荧光素标记的目标突变基因与其它序列的ct值差值的判读，得到多个靶标突变位点的突变结果，进而能够实现一管即可完成多个位点突变的检测，具有高效、高通量的优势。
38.2、本技术提供的幽门螺杆菌gyra耐药基因突变检测试剂盒，能够实现多个位点突变类型的同时检测，甚至是可同时完成对4个位点的6种突变类型的准确检测，pcr反应结束后可通过ct值计算的方式进行判读，检测成本低，结果精确可靠、直观，具有较好的实用性。
39.3、本技术克服了某些技术，例如溶解曲线法中对仪器的要求苛刻的问题，其仅仅使用通用仪器即可实现检测，并且检测方法方便高效。
40.4、本技术采用闭管操作方式，无需在pcr后进行特殊处理，减少了pcr产物污染的可能性，进一步保证检测结果的准确性。
41.5、本技术提供的试剂盒内包含ung酶，以降低pcr产物污染的可能性。
42.6、本技术的试剂盒内的探针上可以仅仅连接三种荧光基团，在单管中实现6种靶标突变位点和1个内控基因的同时检测，不仅增大了检测通量，并且降低了成本。
附图说明
43.图1所示为实施例3中胃黏膜石蜡样本中gyra基因271g》t突变阳性荧光结果图；图2所示为实施例3中胃黏膜石蜡样本中gyra基因271g》t突变阳性测序图；图3所示为实施例3中gyra基因261t》a突变阳性测序图；图4所示为实施例3中gyra基因271g》a突变阳性测序图；图5所示为实施例3中gyra基因272a》g突变阳性测序图；图6所示为实施例3中gyra基因260a》t突变阳性测序图；图7所示为实施例4中粪便样本的gyra基因261t》g突变阳性荧光结果图；图8所示为实施例4中粪便样本的gyra基因261t》g突变阳性测序图。
具体实施方式
44.以下结合附图和实施例对本技术作进一步详细说明。
实施例
45.实施例1 引物探针组合物根据ncbi上下载幽门螺杆菌gyra基因序列，找到该基因待检耐药位点，设计引物探针。其中检测位点处上游arms引物的3'末端位于突变位点处，并于突变型基因相一致，为了提高该引物特异性，在3'末端第2个、3个、4个或其他位置可再引入一个错配碱基。且引物tm值保持在60℃左右，探针tm值保持在70℃左右。
46.所设计的arms引物探针组合物为：a260t位点上游引物f1：5
’‑
ataccacccccatggcgctat-3’（seq id no 1），t261g位点上游引物f2：5
’‑
accacccccatggcgagaag-3’（seq id no 2）,t261a位点上游引物f3：5
’‑
cacccccatggcgatata-3’（seq id no 3）,g271a位点上游引物f4：5
’‑
catggcgataatgcggtttata-3’（seq id no 4）和f5:5
’‑
catggcgataacgcggtttata-3’（seq id no 5）,g271t位点上游引物f6：5
’‑
atggcgataatgcggtttgtt-3’（seq id no 6）和f7:5
’‑
atggcgataacgcggtttatt-3’（seq id no 7）,a272g位点上游引物f8：5
’‑
tggcgataatgcggtatatgg-3’（seq id no 8）和f9:5
’‑
tggcgataacgcggttaatgg-3’（seq id no 9）。其中，各上游引物中以小写字母表示的碱基是在引物设计时人为引入的错配碱基，根据实际情况选择错配碱基的位置和数量。
47.通用下游引物gyra-r：5
’‑
gctgcagcgttatcgccatcaat-3’（seq id no 10）。探针gyra-p：5
’‑
agccaaagttgccttgcccatccacta-3’（seq id no 1）；探针gyra-p的5’端标记fam基团作为荧光基团，3’端使用bhq1作为淬灭基团。由于271和272位点处上游引物时，引物涉及261位点的同义突变t或c，因此此处涉及两种引物。
48.16s rrna基因引物探针组合物，其序列为：上游引物16s-f：5
’‑
cagccatgttgcggtgaa-3’（seq id no 12），下游引物16s-r：5
’‑
aaacacaactcccatggtgtga-3’（seq id no 13），探针16s-p：5
’‑
acgttcccgggtcttgtactcaccg-3’（seq id no 14）；探针16s-p的5’端标记vic基团作为荧光基团，3’端使用bhq1作为淬灭基团。
49.人看家基因rnp引物探针组合物（即内标基因引物探针组合物），其序列为：上游引物rnp-f：5
’‑
gacttcagcatggcggtgttt-3’（seq id no 15），下游引物rnp-r：5
’‑
tgtctccacaagtccgcgc-3’（seq id no 16），探针rnp-p：5
’‑
acctgaaggctctgcgcggac-3’（seq id no 17）；探针rnp-p的5’端标记cy5基团作为荧光基团，3’端使用bhq3作为淬灭基团。
50.实施例2检测幽门螺杆菌gyra耐药基因突变的试剂盒试剂盒包括用于荧光pcr反应的pcr反应液、酶混合液、阴性对照品和阳性对照品。其中，pcr反应液中含有实施例1中的引物探针组合物和dntps，且溶剂为pcr缓冲液。进一步的，pcr缓冲液为2
×
bufffer；pcr反应液中各引物浓度为400nm，各探针浓度为200nm；dntps的浓度为2.5mm。
51.酶混合液中含有2u/反应的taq酶和1u/反应的ung酶。
52.阳性对照中含有gyra基因各位点的突变质粒、内标基因质粒和其它基因质粒，其上述质粒均委托金唯智生物科技有公司合成。gyra基因各位点的突变质粒包括a260t位点突变的质粒、t261g位点突变的质粒、t261a突变的质粒、g271a位点突变的质粒、g271t位点
突变的质粒和a272g位点突变的质粒。内标基因质粒内含有内标基因：人看家基因rnp基因，能够作为模板dna和人看家基因rnp引物探针组合物结合；其它基因质粒内含有其它基因：16s基因，能够作为模板dna和16s rrna引物探针组合物结合。
53.实施例3 检测幽门螺杆菌gyra耐药基因突变的试剂盒的使用方法一种检测幽门螺杆菌gyra耐药基因突变的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：采用实施例2的试剂盒，令其中的引物探针组合物和待检测样本的模板dna混合，进行arms-pcr，使得目标突变基因和其它基因同时进行荧光定量pcr反应。
54.其中，arms引物探针组合物和模板dna上靶标突变位点所在的区域结合，16s rrna引物探针组合物和模板dna上16s基因所在的区域结合，并再检测时分别得出ct值，并通过ct值差判定待检测样本的a基因突变。
55.试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：i、待检测样本的核酸提取：将石蜡包埋的胃黏膜组织切片按要求取3-8片，使用商业化的石蜡样本核酸提取试剂盒进行提取，获得核酸，核酸提取试剂为磁珠法石蜡包埋组织基因组提取试剂盒（货号：nmg1411）。将基因组进行提取作为pcr扩增模板。
56.试剂配制：按照pcr反应液17μl和酶混合液3μl
×
待检样本个数进行pcr扩增反应液的配制。按照每管20μl体积平均分配至8连排管中。
57.ii、向上述试剂中加入10μl经核酸提取得到的pcr扩增模板，且阳性对照和阴性对照同时进行扩增，短暂离心后至扩增区，扩增程序见表1。
58.表1 pcr扩增程序iii、结果判读通过ct值差判定待检测样本的基因突变时的判定方法为：s1、是否有幽门螺杆菌感染的判读待测样品的内对照cy5信号均应有明显扩增信号且ct
cy5
《38，可进行后续判读：若hex(vic)通道无明显扩增信号或ct
hex(vic)
》37，则说明样本无幽门螺杆菌感染；若ct
hex(vic)
≤37,则说明该样本存在幽门螺杆菌感染，则进行后续突变结果过的判断；s2、突变结果判读待检测样本的fam通道有明显扩增信号且ct
fam
值≤37时，则计算fam通道的ct
fam
值与hex(vic)通道的ct
hex(vic)
值的差值δct，其中，δct=ct
fam
值-ct
hex(vic)
值，通过δct值来判定结果：δct＜9，则判定gyra基因的检测位点为突变型，δct≥9，则判定gyra基因的检
测位点为野生型；待检测样本的fam通道无明显扩增信号或ct
fam
值》37时，则判定gyra基因的检测位点为野生型或低于检测限。突变结果的判读见表2。
59.表2 突变结果的判读标准确认未选择校正荧光，可根据样本每个通道扩增的具体情况设置基线，优先考虑仪器自动选择，也可手动选择；以阳性对照的cy5通道扩增曲线升起的拐点处为阈值线，复制阈值，将fam和hex(vic)通道的阈值设置成与cy5通道一致即可。
60.当该样本gyra基因271位点为g》t，图1为石蜡样本扩增曲线，图2为该样本测序结果图；在众多样本检测中，因试剂不能进行分型检测，因此扩增图与图1类似，除了271g》t位点，剩余样本的测序图如图3-图6，临床样本中也会出现杂合型突变。
61.对比例1 测序（金标准）试剂盒的使用方法将本技术试剂盒与测序（金标准）结果进行一致性比较。
62.采集200例幽门螺杆菌感染且需要采用石蜡包埋的胃黏膜组织，利用实施例3中所提及的提取试剂盒将该石蜡组织进行核酸提取，并将使用本技术试剂盒与基因测序法（金标准）分别进行检测，通过比较使用本技术试剂盒对样本的gyra基因asn87-lys/ile、asp91-gly/asn/tyr突变位点的检测结果与使用基因测序法对样本相同突变位点的检测结果，来计算两种方法的符合率。与“金标准”比较符合率高代表两种方法有很高的一致性，该试剂盒检测位点精准度高。符合率低表明本技术试剂盒精准度低，不适用。
63.根据结果可知，使用本技术试剂盒的检测结果与基因测序法检测结果的符合率为100％，各突变位点类型样本统计结果详见表3。
64.表3 各突变位点类型多态性类型样本统计结果
临床灵敏度＝81/（81 3）
×
100％＝96.4％；临床特异性＝115/（1 115）
×
100％＝99.1％；阳性预测值＝81/（81 3）
×
100％＝96.4％；阴性预测值＝115/（1 115）
×
100％＝99.1％；总符合率＝（81 115）/200
×
100％＝98％。
65.实施例4 检测幽门螺杆菌gyra耐药基因突变的试剂盒的使用方法本实施例和实施例3的区别在于，选择的目标样本不同，本技术的检测样本为粪便。
66.试剂盒的使用方法：i、粪便样本：将粪便按要求冷冻或者保存在粪便保存液中，采用商业化的粪便提取试剂盒进行提取（货号：nmg1211）。将基因组进行提取作为pcr扩增模板。
67.试剂配制：同实施例3。
68.步骤ii和iii同实施例3。
69.当该样本gyra基因261位点为t》g，则图7为粪便样本扩增曲线，图8为该样本测序结果图。
70.对比例2 测序（金标准）试剂盒的使用方法本对比例和对比例1的区别在于，检测样本选择的是和实施例3相同的粪便样本。
71.采集200例幽门螺杆菌感染且需要检测该菌的耐药情况的粪便样本，采用纳磁粪便保存液进行保存，利用实施例2中所提及的提取试剂盒将该粪便样本进行核酸提取，使用本技术的试剂盒与基因测序法分别进行检测，通过比较使用本技术的试剂盒对样本的gyra基因asn87-lys/ile、asp91-gly/asn/tyr突变位点的检测结果与使用基因测序法对样本相同突变位点的检测结果，来计算两种方法的符合率。与“金标准”比较符合率高代表两种方法有很高的一致性，该试剂盒检测位点精准度高。符合率低则表明本技术试剂盒精准度低，不适用。
72.根据结果可知，使用本技术的试剂盒的检测结果与基因测序法检测结果的符合率为95％，各突变位点类型样本统计结果详见表4。
73.表4 各突变位点类型多态性类型样本统计结果临床灵敏度＝72/（72 5）
×
100％＝93.5％；临床特异性＝118/（5 118）
×
100％＝95.9％；阳性预测值＝72/（72 5）
×
100％＝93.5％；阴性预测值＝118/（5 118）
×
100％＝95.9％；
总符合率＝（72 118）/200
×
100％＝95％。
74.本技术试剂盒检测6种多态性位点与基因测序法的检测结果比较显示：总符合率高，该试剂盒特异性强，灵敏度高，检出率高。该方法通量相对较高，检测成本低，结果精确可靠、直观，具有较好的实用性。
75.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。