一种炔基偶联的二氟苯氨基吡啶酮HIV整合酶抑制剂、制备方法及用途与流程

一种炔基偶联的二氟苯氨基吡啶酮hiv整合酶抑制剂、制备方法及用途
技术领域
1.本发明涉及抗hiv病毒的药物领域。具体地讲，具体涉及一种重要酪氨酸激酶抑制剂药物中间体4-氨基-3-氯-2-氟苯酚的制备方法。具体而言，本发明涉及一种通过sonogashira偶联的含2，4-二氟苯和氨基吡啶酮结构的hiv整合酶抑制剂、其制备方法及其在受试化合物体外hiv假病毒的抗病毒活性。


背景技术：

2.人类免疫缺陷病毒又称艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，aids)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种逆转录病毒。这一病毒会攻击并逐渐破坏人类的免疫系统，致使宿主在被感染时得不到保护。感染人类免疫缺陷病毒并且去世的人，往往死于继发感染或者癌症。而艾滋病是人类免疫缺陷病毒感染的最后阶段。该病患者的免疫功能部份或完全丧失，cd4 细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高，且现无法治愈，引起了各国政府和社会的关注。
3.hiv在病毒分类学上属逆转录病毒科(retroviridae)慢病毒属(lentivirus)，截止2020年已发现两种hiv，分别为hiv-1和hiv-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。hiv-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到。其毒力和传播力都低于hiv-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。hiv-1广泛分布于世界各地，是引起全世界aids流行的病原，hiv的研究也是以hiv-1为主进行的。
4.hiv的流行呈世界性分布，非洲为hiv的发源地和重灾区，欧洲和美洲也为主要流行区，近年hiv在亚洲的流行呈高速增长的趋势。我国自1985年首次发现hiv感染者，已有60～80万人发生了感染，专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按现年平均30％的增长速度，到2010年，我国的hiv感染者将超过1000万。在非洲的有些国家，hiv的感染率达总人口30％以上。因此，预防和治疗艾滋病，已不仅仅是挽救个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。
5.目前用于aids的治疗剂主要选自一组逆转录酶抑制剂(如，azt、3tc)和蛋白酶抑制剂(如，茚地那韦)，但它们被证实伴有副作用如肾病和出现抗药性病毒。因此，渴望开发具有其它作用机制的抗hiv药物。
6.整合酶抑制剂是指抑制整合酶的药物，即抑制逆转录病毒复制过程，阻断催化病毒dna与宿主染色体dna的整合。研究发现一大批hiv-1整合酶抑制剂被鉴定出来，其中一些化合物显示选择性的抑制hiv-1整合酶和阻断病毒复制的活性，而最有影响的两类抑制剂是含邻苯二酚的多羟基芳环化合物和最近报道的芳基β-二酮酸类化合物。
7.hiv整合酶抑制剂(integrase inhibitors)是一种全新作用机制的抗hiv/aids药物，可与其他抗逆转录病毒药物联合用药有效治疗hiv感染，且临床不易产生耐药性；且hiv整合酶是逆转录病毒复制的必需酶，人体中并未含有任何的整合酶蛋白或相关基因片段，因此以病毒整合酶为靶点的抗病毒药物具有非常高的临床安全性。
8.目前整合酶抑制剂主要分为五类：dna结合物、核苷类化合物、肽类化合物、多羟基芳环化合物和二酮酸类化合物。
9.hiv整合酶抑制剂抑制剂药物研发的重要趋势是与其他抗艾滋病药物组成复合剂型，如gilead公司开发的两种复合制剂，即(1)整合酶抑制剂elvitegravir 细胞色素p450cyp3a4抑制剂gs-9350 核苷类逆转录酶抑制剂替诺福韦(tenofovir) 核苷类逆转录酶抑制剂恩曲他滨(emtricitabine)；(2)整合酶抑制剂elvitegravir 细胞色素p450cyp3a4抑制剂gs-9350 核苷类逆转录酶抑制剂替诺福韦前药gs-7340 核苷类逆转录酶抑制剂恩曲他滨(emtricitabine)。葛兰素史克公司研发的整合酶抑制剂gsk-1349572 核苷类逆转录酶抑制剂阿巴卡韦(abacavir) 核苷类逆转录酶抑制剂拉米夫定(lamivudine)等。现今，仍然需要发现一些较之现有的hiv整合酶抑制剂具有更好的体内活性和/或改良的药理学特性的全新化合物、因此开发新的改进的或更高效，更长效的hiv整合酶抑制剂，更深入地了解该类药物与已知靶蛋白之间的关系以及其发挥抗hiv病毒的机理对临床治疗具有重要的意义。
10.本发明公开了一种通过sonogashira偶联的含2,4-二氟苯和氨基吡啶酮结构的hiv整合酶抑制剂、其制备方法，其在受试化合物体外hiv假病毒测试中展现出优良的抗病毒活性。


技术实现要素：

11.本发明的目的一是提供一种具有式i的全新化合物结构的hiv整合酶抑制剂。
12.本发明的目的二在于提供具有式i的化合物的合成制备方法。
13.本发明的目的三是提供含有式i的化合物作为有效成分，以及其在抗hiv病毒活性药物方面的应用。
14.本发明具有式i的化合物具有下述结构式：
[0015][0016]
本发明所述i化合物可以通过以下路线合成：
[0017][0018]
本发明所述式i化合物具有hiv整合酶抑制作用，可作为有效成分用于制备抗hiv的活性治疗药物。本发明所述式i通过测定化合物的半数有效浓度(ec
50
)值来评价化合物对hiv假病毒的抗病毒活性。hiv假病毒报告基因实验被广泛用于早期筛选，替代hiv病毒实验来评价化合物的抗hiv病毒活性。具体实施形式
[0019]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。需要说明的是，下述实施例仅是用于说明，而并非用于限制本发明。本领域技术人员根据本发明的教导所做出的各种变化均应在本技术权利要求所要求的保护范围之内。
[0020]
实施例式i化合物的合成
[0021][0022]
步骤1.化合物iii的合成
[0023]
在干燥的三口瓶中加入化合物ii(5.53g,17.53mmol,1eq)和mecn(50ml)，开起搅拌，随后依次加入醋酸(5.16g,85.88mmol,4.91ml,4.9eq)和甲磺酸(505.30mg,5.26mmol,
374.30ul,0.3eq)，氮气置换3次。将反应缓慢升温至内温65度(70度外温)，继续搅拌19小时。tlc(dcm:meoh＝10:1,rf＝0.25)显示原料点消失，有极性较小的新点生成。化合物iii反应液直接用于下一步，按照理论量投料
[0024]
步骤2.化合物iv的合成
[0025]
将2-氨基丁醇(1.84g,24.44mmol,1.90ml,1.4eq)溶于mecn(4ml)中，在65度下缓慢滴加至化合物iii反应液，反应体系保持内温至65度，继续搅拌18小时。lcms检测到目标产物ms 1，原料微量剩余。将反应液旋干，向其中加入1m hcl(80ml)，有大量棕色粘稠状固体出现，水相用二氯甲烷(80ml*2)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，向粗产品中加入甲醇(40ml)，升温至65度搅拌4hr，而后将温至20度，固体析出。过滤得到淡黄色固体化合物iv；1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ＝15.35-14.48(m,1h),8.46(s,1h),5.42(dd,j＝3.7,9.9hz,1h),4.59(dd,j＝3.7,12.5hz,1h),4.51-4.34(m,2h),4.10(s,3h),3.99(dd,j＝10.0,12.4hz,1h),3.78-3.67(m,1h),1.45(d,j＝6.1hz,3h)
[0026]
步骤3.化合物v的合成
[0027]
在预先干燥过的三口烧瓶中加入bh3.thf(1m,67.97ml ml,2eq)氮气抽换气三次，控制温度0-5℃，加入化合物iv(10g,3.40mmol,1eq)和四氢呋喃(100ml)的混合溶液，加料完毕，混合物在15度，继续搅拌2小时。lcms检测到目标产物，tlc(dcm:meoh＝7:1,rf＝0.12)显示原料点消失，检测到极性较大的新点。氮气流保护下，控制温度-20-0℃，缓慢加入甲醇(》20ml)淬灭反应，充分搅拌均匀30min。后升至室温。减压浓缩得到粗产品。粗产品通过自动过柱机combi-flash分离(梯度淋洗：dcm:meoh＝1:0-10:1)，纯化得到化合物v。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ＝7.24(s,1h),5.31(br d,j＝5.3hz,1h),4.53(br d,j＝6.8hz,1h),4.46-4.31(m,2h),4.20(br d,j＝11.8hz,1h),4.01(s,3h),3.86(br t,j＝10.6hz,1h),3.73-3.63(m,2h),1.41(d,j＝5.9hz,3h)
[0028]
步骤4.化合物vi的合成
[0029]
在干燥的三口瓶中加入化合物v(2.6g,9.28mmol,1eq)和dcm(16ml)，开起搅拌，随后加入戴斯马丁试剂(5.90g,13.91mmol,4.31ml,1.5eq)，氮气置换3次，将反应置于15度，搅拌小时。tlc(dcm:meoh＝10:1,rf＝0.27)显示原料点消失，检测到极性较小的新点。加入硫代硫酸钠20ml淬灭反应，水相用二氯甲烷50ml*5萃取，合并有机相无水硫酸钠干燥。过滤减压浓缩得到粗产品。粗产品通过自动过柱机combi-flash分离(梯度淋洗：dcm:meoh＝100％至97％)，纯化得到化合物vi。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ＝10.20-10.03(m,1h),8.29(s,1h),5.37(dd,j＝3.6,9.9hz,1h),4.71(dd,j＝3.6,12.3hz,1h),4.32(dd,j＝6.6,8.4hz,1h),4.28-4.21(m,1h),3.96(dd,j＝10.0,11.9hz,1h),3.86(s,3h),3.63(dd,j＝6.9,8.4hz,1h),1.28(d,j＝6.3hz,3h)
[0030]
步骤5.化合物vii的合成.
[0031]
取干燥的三口瓶，将化合物vi(500mg,1.80mmol,1eq)溶入甲醇(5ml)，开起搅拌，随后加入碳酸钾(496.68mg,3.59mmol,2eq)，氮气置换3次，冷却至0度。控制反应温度0-5度，缓慢加入ohira-bestmann试剂(414.24mg,2.16mmol,1.2eq)。加毕，将反应置于15度搅拌12小时。反应先变绿随反应进行逐渐转变为深棕色。lcms检测到目标产物。减压浓缩反应液，粗品加入二氯甲烷10ml和水10ml，水相用dcm 10ml*3萃取，合并有机相无水硫酸钠干燥，减压浓缩。根据tlc(dcm:meoh＝10:1,rf＝0.38)粗产品通过自动过柱机combi-flash分
离(梯度淋洗：dcm:meoh＝100％-97％)，纯化得到化合物vii。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ＝8.08(s,1h),5.36(dd,j＝3.6,9.8hz,1h),4.50(dd,j＝3.8,12.1hz,1h),4.36-4.28(m,1h),4.26-4.18(m,2h),3.92(dd,j＝10.3,11.6hz,1h),3.78(s,3h),3.65-3.60(m,1h),1.28(d,j＝6.2hz,3h)
[0032]
步骤6.化合物viii的合成.
[0033]
取干燥的茄型史莱克瓶烤瓶子氮气置换三次，将化合物vii(500mg,1.82mmol,1eq)溶入无水四氢呋喃中(25ml),开启搅拌，随后加入碳酸铯(1187mg,3.59mmol,2eq),氮气置换3次，冷却至0℃。控制反应温度0-5℃，缓慢加入xphos(43.4mg,0.091mmol,0.05eq)以及pd(mecn)2cl2(2.36mg,0.0091,0.005eq)。加毕，将反应在氮气保护下10-15℃下搅拌聚合72小时。lcms检测到目标产物。加反应液反滴加到甲醇溶剂中析出固体产物，过滤，产物透析除盐，干燥得到化合物viii。lcms:m/z 401[m h]

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[0034]
步骤7.化合物i的合成.
[0035]
取干燥的三口烧瓶，加入化合物viii(200mg,0.5mmol,1eq)溶于二氯甲烷(25ml)溶液中,在氩气氛围下将反应液冷却至0℃，将三溴化硼(376mg,1.5mmol,3eq)的二氯乙烷溶液缓慢滴加至反应液中。将反应液温度升至室温，搅拌反应12h。反应完毕，在冰浴条件下滴加50ml纯化水淬灭反应，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得类白色固体粉末。粗产品通过自动过柱机combi-flash分离(梯度淋洗：dcm:meoh＝100％至97％)，纯化得到化合物i；lcms:m/z387[m h]

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[0036]
使用hiv假病毒(psv)系统评价受试化合物体外抗病毒的活性。
[0037]
通过测定化合物的半数有效浓度(ec50)值来评价化合物对hiv假病毒的抗病毒活性。hiv假病毒报告基因实验被广泛用于早期筛选，替代hiv病毒实验来评价化合物的抗hiv病毒活性。
[0038]
hiv假病毒报告基因实验：
[0039]
第一天，293t细胞以每孔55,000个细胞，每孔100μl的密度接种到96孔测试板中，并于5％co2、37℃培养箱中培养过夜。
[0040]
第二天，加入倍比稀释后的化合物(8个浓度点、双复孔)，50μl每孔。随后稀释好的病毒以每孔100tcid50加入细胞，50μl每孔。设置细胞对照(细胞，无化合物处理或病毒感染)，病毒对照(细胞感染病毒，无化合物处理)和培养液对照(只有培养液)。该实验培养液终体积为200μl，培养液中dmso的终浓度分别为0.5％。细胞于5％co2、37℃培养箱中培养3天。
[0041]
使用荧光素酶报告基因检测试剂britelite plus kit(perkinelmer)检测测试板中每孔荧光素酶活性，数据用于样品抗病毒活性分析。使用细胞活力检测试剂celltiter glo，用biotek酶标仪检测每孔细胞活力，数据用于样品细胞毒性分析。
[0042]
用graphpad prism软件绘制剂量-效应曲线。抗体的抗病毒活性(﹪inhibition)的计算公式如下：抗病毒活性(％)＝(ec50测试孔读值-病毒对照平均值)/(细胞对照平均值-病毒对照平均值)
×
100
[0043]
ec50值使用graphpad prism(version 5)软件，对抗体的抑制活性和细胞活率进行非线性拟合分析，拟合方法为"log(inhibitor)vs.response
‑‑
variable slope"。
[0044]
本发明化合物对hiv假病毒的抑制活性见表1。
[0045]
表1本发明化合物对hiv假病毒(psv)的抑制活性化合物编号ec
50
(nm)i67
[0046]
结论：本发明化合物在细胞水平抑制hiv假病毒基因复制试验中展示出积极效应。