一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子标记引物及其应用

一种与冬瓜果实大小紧密连锁的indel分子标记引物及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与冬瓜果实大小紧密连锁的indel分子标记引物及其应用。


背景技术：

2.果实大小是冬瓜重要的农艺性状，直接决定冬瓜的产量。果实大小是果实完全成熟后的农艺性状，且易受环境影响，是性状改良中的难点。常规育种需要在果实成熟后对果实大小进行鉴定，耗时长、成本高。通过构建遗传群体，bsa-seq初定位，进一步利用大群体对标记进行加密，进行精细定位并获得与果实大小共分离的分子标记，通过标记辅助选择技术可显著提高果实大小的选择效率、在苗期即对果实大小进行选择，节省育种用地，加快育种进程。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种与冬瓜果实大小紧密连锁的indel分子标记引物，该引物能产生168bp的大果特异性标记bhfs
168
和173bp的小果特异性标记bhfs
173
，且重复性好、特异性强。
4.本发明的目的还在于提供上述indel分子标记引物在苗期鉴定冬瓜果实大小表型方面的应用，利用所述indel分子标记引物，能准确、快速、有效的鉴定冬瓜果实大小。
5.本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种与冬瓜果实大小紧密连锁的indel分子标记引物，所述indel分子标记引物包括上游引物bhfs-f和下游引物bhfs-r，其中所述上游引物bhfs-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物bhfs-r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6.具体的，该indel分子标记引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如下：
7.bhfs-f：5
’‑
aaacatcaagacgaacaacc’(seq id no.1所示)；
8.bhfs-r：5
’‑
gaacgacatactcccaacat’(seq id no.2所示)。
9.采用该indel分子标记引物进行pcr扩增，带型清晰、重复性好，经特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收dna—pcr扩增—琼脂糖胶回收—ta克隆测序后，分析结果可知：该indel分子标记引物能产生168bp的大果亲本b227特异性标记fs
168
和173bp的小果亲本hf3特异性标记fs
173
。
10.优选的，所述indel分子标记引物根据位于冬瓜第10号染色体16809996-16906354的96.358kb区间内的控制冬瓜果实大小的基因设计获得。
11.本发明以大果型冬瓜b227与小果型冬瓜hf3为亲本构建4世代分离群体，研究果实大小的遗传规律，结果显示在该群体中，果实大小为一对核基因控制的质量性状，大果对小果为显性。随后，通过f2群体中的极端大小果实单株构建基因池，进行bsa-seq，将果实大小基因初步定位于第10号染色体。进一步构建包含1486个单株的f2群体进行标记加密，将果
实大小基因定位到第10号染色体约96.36kb(16809996-16906354)区间内。在区间内获得了一个indel分子标记引物，该分子标记引物不仅在分离群体中与果实大小性状共分离，在不同育种材料中，其扩增带型也与果实大小表型一致。利用该分子标记引物可以在苗期开展冬瓜果实大小基因筛选，能够缩小育种群体，加速育种进程，提高育种效率，具有重要的应用价值。
12.本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述indel分子标记引物在苗期鉴定冬瓜果实大小表型方面的应用。
13.优选的，将indel分子标记引物在苗期鉴定冬瓜果实大小表型方面的应用时，包括以下步骤：
14.(1)提取冬瓜新鲜叶片的基因组dna；
15.(2)以冬瓜基因组dna为模板，使用权利要求1中的indel分子标记引物进行pcr扩增；
16.(3)将pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
17.(4)对电泳结果进行分析，该indel分子标记引物能产生如seq id no.3所示的大小为168bp的大果型亲本b227特异性标记fs
168
以及如seq id no.4所示的大小为173bp的小果型亲本hf3特异性标记fs
173
，其中大果对小果为显性，同时具有两个亲本特异性标记fs
168
和fs
173
的单株或单独具有大果型亲本b227特异性标记fs
168
的单株，其表型与大果亲本一致为大果，单独具有小果型亲本hf3特异性标记fs
173
的单株，其表型为小果。
18.优选的，步骤(2)中pcr扩增时采用的20μl反应体系包括：浓度为100ng
·
μl-1
的基因组dna 1μl，含mg
2
的10
×
pcr buffer 2μl，浓度为2.5mm的dntps 1.5μl，浓度为0.25mmol
·
l-1
的上游引物bhfs-f 1μl，浓度为0.25mmol
·
l-1
的下游引物bhfs-r 1μl，taq酶1u，12.5μl ddh2o。
19.优选的，步骤(2)中pcr扩增时采用的扩增程序包括：94℃预变性3min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。
20.优选的，步骤(3)中聚丙烯酰胺凝胶电泳时采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
21.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
22.(1)本发明中的indel分子标记引物能同时产生大果亲本b227特异性标记和小果亲本hf3特异性标记，且特异性强；
23.(2)本发明中的indel分子标记引物可在苗期快速鉴定冬瓜的果实大小表型；
24.(3)本发明中的indel分子标记引物应用于苗期鉴定冬瓜的果实大小表型时，具有准确、快速、成本低、鉴定周期短操作简便等优点，能够辅助冬瓜新品种选育，具有广阔的应用前景；
25.(4)本发明中的indel分子标记引物是根据冬瓜果实大小基因精细定位结果而开发的，标记与果实大小性状共分离，可直接用于冬瓜果实大小分子标记辅助选择，本发明中的indel分子标记引物可以简便、快速、高通量地应用于冬瓜育种实践中，能够提高育种效率和促进产量性状改良。
附图说明
26.图1是实施例2中冬瓜果实大小基因indel标记的pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱(m：100bp ladderⅰ分子量标准、b227：大果亲本，hf3：小果亲本；
27.图2为实施例3中该标记在第1-96号f2群体单株中的扩增结果；
28.图3为实施例3中该标记在第97-178号f2群体单株的扩增结果；
29.图4为实施例3中该标记在不同果实大小育种材料中的扩增结果。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
31.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
32.实施例1
33.本实施例以大果型冬瓜b227(三水黑皮冬瓜经常规多代选择获得)与小果型冬瓜hf3(黛宝冬瓜经常规多代选择获得)为亲本构建4世代分离群体，研究果实大小的遗传规律，结果显示在该群体中，果实大小为一对核基因控制的质量性状，大果对小果为显性。随后，通过f2群体中的极端大小果实单株构建基因池，进行bsa-seq，将果实大小基因初步定位于第10号染色体。进一步构建包含1486个单株的f2群体进行标记加密，将果实大小基因定位到第10号染色体约96.36kb(16809996-16906354)区间内。
34.实际上，除了大果型冬瓜b227与小果型冬瓜hf3之外，也可以采用市面上的大瓜品种比如黑优1号冬瓜，黑优2号冬瓜、铁柱冬瓜、铁柱2号冬瓜与小瓜品种比如黛宝冬瓜、墨宝冬瓜、金宝冬瓜等为亲本，进而获得位于第10号染色体96.36kb(16809996-16906354)区间内的控制冬瓜果实大小的基因。
35.根据冬瓜果实大小基因定位区间，开发14对indel分子标记引物在大果亲本b227和小果亲本hf3中进行扩增，筛选多态性标记(图1)。
36.结果发现，根据第10号染色体构建的第10对indel分子标记引物10im10分子标记引物与果实大小表型共分离，且带型清晰、重复性好，将其命名为bhfs，序列如下所示：
37.bhfs-f：5
’‑
aaacatcaagacgaacaacc’(seq id no.1)；
38.bhfs-r：5
’‑
gaacgacatactcccaacat’(seq id no.2)。
39.因此，在第10号染色体约96.36kb(16809996-16906354)区间内内获得了一个indel分子标记引物，该分子标记引物不仅在分离群体中与果实大小性状共分离，在不同育种材料中，其扩增带型也与果实大小表型一致。利用该分子标记引物可以在苗期开展冬瓜果实大小基因筛选，能够缩小育种群体，加速育种进程，提高育种效率，具有重要的应用价值。
40.实施例2
41.将实施例1中获得的多态性标记在178个f2群体单株中扩增验证(图2、图3)，包括以下步骤：
42.(1)冬瓜dna的提取
43.实验材料为大果型冬瓜b227和小果型冬瓜hf3以及f2群体单株的新鲜叶片，提取基因组dna步骤如下：
44.①
取少量新鲜叶片放入2ml离心管中，加入钢珠，在磨样机上研磨，每秒震荡30次，震荡2min，加入800μl 2％ctab提取液，混匀后置于65℃水浴1h(每隔10min摇匀一次)；
45.②
静置至室温后，加入800μl的氯仿：异戊醇(体积比24：1)，轻柔混匀10min后离心，12000rpm，15min，取上清(约600μl)转移至新的1.5ml离心管；
46.③
加入上清液2/3体积的异丙醇，轻柔混匀后置于-20℃，30min～1h；
47.④
12000rmp，离心10min，弃上清；
48.⑤
向离心管中加入无水乙醇洗涤dna沉淀1次，再用75％(体积百分含量)乙醇乙醇洗1次，放在超净工作台上吹干；
49.⑥
加入50μl te(或ddh2o)溶解，作为冬瓜基因组dna备用。
50.(2)以冬瓜基因组dna为模板，采用实施例1中筛选出的分子indel标记引物进行pcr扩增。
51.pcr扩增时采用的20μl反应体系包括：浓度为100ng
·
μl-1
的基因组dna 1μl，含mg
2
的10
×
pcr buffer 2μl，浓度为2.5mm的dntps 1.5μl，浓度为0.25mmol
·
l-1
的上游引物bhfs-f 1μl，浓度为0.25mmol
·
l-1
的下游引物bhfs-r1μl，taq酶1u，余量为ddh2o。
52.pcr扩增的程序为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃终延伸7min，置于4℃保存。
53.(3)对pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)检测
54.①
将pcr产物加入4μl 6
×
loading buffer，涡旋混匀；
55.②
取1μl扩增产物用8％(质量百分含量)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v稳压60min；
56.③
将page胶拆下，先用蒸馏水洗一遍，再用0.1％agno3溶液染色10min；
57.④
用蒸馏水洗2遍，再用2％naoh、0.04％na2co3、0.4％甲醛显色10min，显色后用自来水洗两遍，然后在灯箱上拍照分析。
58.(4)扩增结果
59.该indel分子标记引物在f2群体中的大果单株中扩增出单独168bp的条带或同时扩增出168bp和173bp的条带，在小果单株中扩增出单独的173bp的条带(图2，3)。
60.回收特异条带，送生工公司测序。168bp、173bp条带的序列如seq id no:3和seq id no:4所示，分别与b227和hf3扩增产物的序列相符。
61.具体的，168bp条带的序列如下：
62.aaacatcaagacgaacaaccttaaattaaaattacaaacattagaactaacaaccttcagctaaaatttaaaagttaaacaaaatatacaaaataaaaaaaataaaaaataaataaataagtgagcattagattgggaaatgacataaatgttgggagtatgtcgttc。
63.具体的，173bp条带的序列如下：
64.aaacatcaagacgaacaaccttaaattaaaattacaaacattagaactaacaaccttcagctaaaatttaaaagttaaacaaaatatacaaaataaaataaaataaaataaaaataaataaataagtgagcattagattgggaaatgacataaatgttgggagtatgtcgttc。
65.以冬瓜基因组dna为模板，使用上述indel标记进行pcr扩增—对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳—特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收dna—pcr扩增—琼脂糖胶回收—ta克隆测序后，分析结果得知：该标记能产生168bp的大果亲本b227特异性标记fs
168
和
173bp的小果亲本hf3特异性标记fs
173
。
66.其中大果对小果为显性，同时具有两个亲本特异性标记fs
168
和fs
173
的单株或单独具有大果型亲本b227特异性标记fs
168
的单株，其表型与大果亲本一致为大果，单独具有小果型亲本hf3特异性标记fs
173
的单株，其表型为小果。
67.实施例3
68.采用实施例1中的indel分子标记引物以及实施例2中的方法对130份育种材料单株进行验证，提取单株dna进行检测，结果如图4所示，从图4中可以看出，在材料1-114中，只有113为大果(同时具有fs
168
和fs
173
)，其余材料均为小果(只具有fs
173
)，材料115-130中，均为大果(只具有fs
168
)。同时对果实大小表型进行鉴定，结果显示标记检测结果与田间表型一致。
69.以上实施例表明，本发明的方法可将大果与小果材料进行有效区分，准确并快速检测出材料的果实大小表型。
70.以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。