抗klk7抗体、抗klk5抗体、多特异性抗klk5/klk7抗体及使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月18日提出的美国临时专利申请第62/901,990号的优先权权益，其通过引用以其全文并出于所有目的并入本文。
技术领域
3.本发明涉及抗klk7抗体、抗klk5抗体、抗klk5/klk7多特异性抗体及其使用方法。
背景技术：
4.人激肽释放酶(kallikrein)相关肽酶(klk)是胰(凝乳)蛋白酶样丝氨酸蛋白酶((chymo)-trypsin-like serine protease)，其在诸如前列腺、卵巢、乳房、睪丸、脑和皮肤的各种组织中表达。klk属于pa(s)超家族(clan pa(s))的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族s1a的亚群。15个人klk基因位于染色体19q13.4上，并且构成了人基因组中最大的邻接丝氨酸蛋白酶簇。这些基因通常由五个编码外显子和某些情况下的一个或二个5’非编码外显子组成，编码激肽释放酶相关肽酶klk1至klk15。所有klk基因都编码单链前蛋白质原(pre-pro-protein)，其含有224至237个残基的胰凝乳蛋白酶样或胰蛋白酶样催化结构域，其中klk4至klk15之间的氨基酸序列同一性为大约40％。klk1及其近亲同源物klk2和klk3自成一支，klk4、5和7属于另一亚群，而klk6与klk13和klk14有较多的相似性。参见例如debela等人，biol chem 389,623-632(2008)。
5.klk5是一种分泌的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，在人皮肤中似乎表达得最多，特别是在皮肤的上棘层和颗粒层中，其中角质细胞经历终末分化且转化为扁平的砖状结构，形成角质层，其是最外层的表皮层，也是与外界环境之间的屏障。参见debela等人，j mol biol,373,1017-1031(2007)；和tan等人，j med chem.2015jan 22；58(2):598-612(2014)。klk7是一种胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，也在皮肤中表达。据描述，klk5在诸如netherton综合征的皮肤病中扮演病理性角色。参见furio等人，plos genet 11(9),e1005389(2015)。netherton综合征是由编码丝氨酸蛋白酶抑制剂kazal第5型(spink5)的spink5基因的功能丧失型突变所造成。参见descargues等人，nat genet.2005jan；37(1):56-65(2004)。spink5已显示能抑制klk丝氨酸蛋白酶家族的几个成员(例如klk5和klk7)。参见wang等人，exp dermatol.jul；23(7):524-6(2014)。在netherton综合征中，spink5的缺失导致klk的活性不受抗衡。klk5的高活性被认为是netherton综合征病理生理学的关键要素，因为klk5是表皮中蛋白质水解作用的调节因子。klk5和klk7的消融针对类netherton综合征表型的致死性起到挽救作用。参见briot等人，j exp med.may 11；206(5):1135-47(2009)；furio等人，j exp med.mar 10；211(3):499-513(2014)；及kasparek等人，plos genet.2017jan 17；13(1):e1006566(2017)。netherton综合征是一种复杂的全身性疾病，具有多种影响，目前尚无满意的治疗。
6.哮喘是一种临床上的异质性病症，与遗传和环境风险因子有关。哮喘双胞胎研究
估计的遗传率从35％到80％不等，表明遗传风险的重要角色。参见例如ullemar等人，allergy 71,230-238(2016)。已经针对哮喘和哮喘相关表型进行了多项大规模的gwas分析，发现的许多基因座诸如ormdl3、il13、il1rl1和tslp基因附近的基因座已经在多个受研究人群中得到证实。参见例如bonnelykke等人，nat genet 46,51-55(2014)。最近的研究在klk4/5基因座处鉴定出snp，它针对有关骨膜蛋白水平低、或2型低炎症哮喘的风险提供保护。在同一研究中，发现重度哮喘患者支气管肺泡灌洗液中klk5水平升高，支持klk5在支气管阻塞和哮喘发病机制中扮演角色的假说。
7.尽管在诸如netherton综合征和哮喘等疾病领域取得了进展，但仍然需要鉴定靶标并且开发能够补充或增强现有疗法疗效的手段。
技术实现要素：
8.本发明提供抗klk7抗体、抗klk5抗体、抗klk5/klk7多特异性抗体和其使用方法。
9.实施例1：一种结合人激肽释放酶相关肽酶7(klk7)的分离抗体，其中该抗体：
10.a)抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸；
11.b)其中如通过表面等离子体共振测量，以小于10pm或小于9pm或小于8pm或小于7pm或小于6pm或小于5pm的kd结合人klk7；
12.c)结合klk7(seq id no:4)的氨基酸r71-n82、k152-s158和/或q211-k222内的表位；和/或
13.d)结合包含klk7(seq id no:4)的氨基酸h72、p73、g74、s76、q78、n82、n157、k211和/或t213中的一者或多者的表位，或包含klk7的氨基酸h91、p92、g93、s95、q97、n101、n178、k233和/或t235中的一者或多者的表位，通过胰凝乳蛋白酶编号。
14.实施例2：一种结合人klk7的抗体，其中该抗体包含重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。
15.实施例3：根据实施例1所述的抗体，其包含重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。
16.实施例4：根据实施例1至3中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。
17.实施例5：根据实施例1至4中任一项所述的抗体，其为人源化、或嵌合抗体。
18.实施例6：根据实施例1至5中任一项所述的抗体，其为结合人klk7的抗体片段。
19.实施例7：根据实施例1至6中任一项所述的抗体，其中如通过表面等离子体共振测量，该抗体以小于10pm、或小于9pm、或小于8pm、或小于7pm、或小于6pm或小于5pm的kd结合人klk7；和/或其中如通过表面等离子体共振测量，以小于10pm、或小于9pm、或小于8pm、或小于7pm、或小于6pm或小于5pm的kd结合食蟹猴klk7。
20.实施例8：根据实施例1至7中任一项所述的抗体，其中该重链可变区包含fr1，其包含选自seq id no:123-128的氨基酸序列；fr2，其包含选自seq id no:130-133的氨基酸序列；fr3，其包含seq id no:135-143的氨基酸序列；和/或fr4，其包含选自seq id no:144-145的氨基酸序列。
21.实施例9：根据实施例1至8中任一项所述的抗体，其中该轻链可变区包含fr1，其包含选自seq id no:147-150的氨基酸序列；fr2，其包含选自seq id no:152-154的氨基酸序列；fr3，其包含选自seq id no:156-158的氨基酸序列；和/或fr4，其包含选自seq id no:160的氨基酸序列。
22.实施例10：根据实施例1至9中任一项所述的抗体，其包含选自下列的序列：
23.(a)vh序列，其与选自seq id no:15-30的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
24.(b)vl序列，其与选自seq id no:31-38的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
25.(c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列。
26.实施例11：根据实施例1至10中任一项所述的抗体，其包含选自下列的序列：
27.(a)vh序列，其包含选自seq id no:15-30的氨基酸序列；
28.(b)vl序列，其包含选自seq id no:31-38的氨基酸序列；及
29.(c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列。
30.实施例12：根据实施例1至11中任一项所述的抗体，其包含seq id no:29的vh序列以及seq id no:32的vl序列。
31.实施例13：根据实施例1至11中任一项所述的抗体，其包含seq id no:30的vh序列以及seq id no:38的vl序列。
32.实施例14：一种特异性结合人klk7的抗体，其包含seq id no:29的vh序列以及seq id no:32的vl序列。
33.实施例15：一种特异性结合人klk7的抗体，其包含seq id no:30的vh序列以及seq id no:38的vl序列。
34.实施例16：根据实施例1至15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链恒定区和轻链恒定区，其中该重链恒定区包含s183k取代(eu编号)和/或s183e取代(eu编号)；和/或该轻链恒定区包含v133k取代(eu编号)和/或v133e取代(eu编号)。
35.实施例17：根据实施例1至16中任一项所述的抗体，其为全长igg1抗体。
36.实施例18：根据实施例17所述的抗体，其中该抗体包含n297g取代(eu编号)。
37.实施例19：根据实施例16至18中任一项所述的抗体，其中该抗体包含m428l取代(eu编号)和/或n434s取代(eu编号)。
38.实施例20：根据实施例1至19中任一项所述的抗体，其中如通过表面等离子体共振测量，该抗体以小于20pm、或小于15pm、或小于10pm、小于5pm、或小于3pm、或小于2pm、或小于1pm的kd结合人klk7。
39.实施例21：根据实施例1至20中任一项所述的抗体，其中该抗体以小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm的ic50抑制人klk7蛋白酶活性。
40.实施例22：根据实施例1至21中任一项所述的抗体，其中如通过表面等离子体共振
测量，该抗体以小于20pm、或小于15pm、或小于10pm、小于5pm、或小于3pm、或小于2pm、或小于1pm的kd结合人klk7；并且其中该抗体以小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm的ic50抑制人klk7蛋白酶活性。。
41.实施例23：根据实施例21或实施例22所述的抗体，其中抑制人klk7蛋白酶活性是抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸。
42.实施例24：根据实施例1至23中任一项所述的抗体，其中该抗体是多特异性抗体。
43.实施例25：根据实施例24所述的抗体，其是双特异性抗体。
44.实施例26：一种特异性结合人klk7的抗体，其与根据实施例1至25中任一项所述的抗体竞争结合人klk7。
45.实施例27：根据实施例26所述的抗体，其中该抗体：
46.a)抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸，ic50小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm；和/或
47.b)其中如通过表面等离子体共振测量，以小于10pm、或小于9pm、或小于8pm、或小于7pm、或小于6pm、或小于5pm的kd结合人klk7。
48.实施例28：一种经分离的核酸，其编码根据实施例1至27中任一项所述的抗体。
49.实施例29：一种经分离的宿主细胞，其包含根据实施例28所述的核酸。
50.实施例30：一种经分离的宿主细胞，其表达根据实施例1至27中任一项所述的抗体。
51.实施例31：一种生产结合人klk7的抗体的方法，其包含在适合于表达抗体的条件下培养根据实施例29或根据实施例30所述的宿主细胞。
52.实施例32：根据实施例31所述的方法，其进一步包含自该宿主细胞回收该抗体。
53.实施例33：一种抗体，其通过根据实施例32所述的方法来生产。
54.实施例34：一种结合人klk5的抗体，其中该抗体包含：
55.a)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:107、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40及41的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43及44的氨基酸序列、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；或
56.b)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39及107的氨基酸序列、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43及44的氨基酸序列、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；或
57.c)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39及107的氨基酸序列、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40及41的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:44、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；或
58.d)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39及107的氨基酸序列、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40及41的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43及44的氨基酸序列、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:47-49的氨基酸序列；或
59.e)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:70、和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71及72的氨基酸序列，和轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seqid no:74、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列；或
60.f)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69及70的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:72，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列；或
61.g)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69及70的氨基酸序列、和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71及72的氨基酸序列，和轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:76-78的氨基酸序列。
62.实施例35：根据实施例34所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:47。
63.实施例36：根据实施例34所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:70和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:72，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:76。
64.实施例37：根据实施例34至36中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。
65.实施例38：根据实施例34至37中任一项所述的抗体，其为人源化、或嵌合抗体。
66.实施例39：根据实施例34至38中任一项所述的抗体，其为结合人klk5的抗体片段。
67.实施例40：根据实施例34至39中任一项所述的抗体，其中如通过表面等离子体共振测量，该抗体以小于1nm、或小于500pm、或小于300pm、或小于200pm、或小于100pm、或小于50pm的kd结合人klk5；和/或其中如通过表面等离子体共振测量，以小于1nm、或小于500pm、或小于300pm、或小于200pm、或小于100pm、或小于50pm的kd结合食蟹猴klk5。
68.实施例41：根据实施例34至40中任一项所述的抗体，其中该重链可变区包含：
69.a)fr1，其包含选择seq id no:161的氨基酸序列；fr2，其包含seq id no:162-163
的氨基酸序列；fr3，其包含seq id no:164的氨基酸序列；和/或fr4，其包含seq id no:165的氨基酸序列；或
70.b)fr1，其包含seq id no:171的氨基酸序列；fr2，其包含选自seq id no:172-173的氨基酸序列；fr3，其包含seq id no:174的氨基酸序列；和/或fr4，其包含seq id no:175的氨基酸序列。
71.实施例42：根据实施例34至41中任一项所述的抗体，其中该轻链可变区包含：
72.a)fr1，其包含seq id no:166的氨基酸序列；fr2，其包含选自seq id no:167-168的氨基酸序列；fr3，其包含seq id no:169的氨基酸序列；和/或fr4，其包含seq id no:170的氨基酸序列；或
73.b)fr1，其包含seq id no:176的氨基酸序列；fr2，其包含选自seq id no:177-178的氨基酸序列；fr3，其包含seq id no:179的氨基酸序列；和/或fr4，其包含seq id no:180的氨基酸序列。
74.实施例43：根据实施例34至42中任一项所述的抗体，其包含选自下列的序列：
75.a)vh序列，其与选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
76.b)vl序列，其与选自seq id no:51及54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
77.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
78.d)vh序列，其与选自seq id no:79及81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
79.e)vl序列，其与选自seq id no:80及88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
80.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
81.实施例44：根据实施例34至43中任一项所述的抗体，其包含选自下列的序列：
82.a)vh序列，其包含选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列；
83.b)vl序列，其包含选自seq id no:51及54-67的氨基酸序列；和
84.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
85.d)vh序列，其包含选自seq id no:79及81-87的氨基酸序列；
86.e)vl序列，其包含选自seq id no:80及88-94的氨基酸序列；和
87.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
88.实施例45：根据实施例34至44中任一项所述的抗体，其包含seq id no:52的vh序列以及seq id no:55的vl序列。
89.实施例46：根据实施例34至44中任一项所述的抗体，其包含seq id no:53的vh序列以及seq id no:62的vl序列。
90.实施例47：一种特异性结合人klk5的抗体，其包含seq id no:52的vh序列以及seq id no:55的vl序列。
91.实施例48：一种特异性结合人klk5的抗体，其包含seq id no:53的vh序列以及seq id no:62的vl序列。
92.实施例49：根据实施例34至44中任一项所述的抗体，其包含seq id no:83的vh序
列以及seq id no:88的vl序列。
93.实施例50：根据实施例34至44中任一项所述的抗体，其包含seq id no:87的vh序列以及seq id no:92的vl序列。
94.实施例51：一种特异性结合人klk5的抗体，其包含seq id no:83的vh序列以及seq id no:88的vl序列。
95.实施例52：一种特异性结合人klk5的抗体，其包含seq id no:87的vh序列以及seq id no:92的vl序列。
96.实施例53：根据实施例34至52中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链恒定区和轻链恒定区，其中该重链恒定区包含s183k取代(eu编号)和/或s183e取代(eu编号)；和/或该轻链恒定区包含v133k取代(eu编号)和/或v133e取代(eu编号)。
97.实施例54：根据实施例34至53中任一项所述的抗体，其为全长igg1抗体。
98.实施例55：根据实施例54所述的抗体，其中该抗体包含n297g取代(eu编号)。
99.实施例56：根据实施例53至55中任一项所述的抗体，其中该抗体包含m428l取代(eu编号)和/或n434s取代(eu编号)。
100.实施例57：根据实施例34至56中任一项所述的抗体，其中如通过表面等离子体共振测量，该抗体以小于60pm、小于30pm、小于20pm、小于10pm、或小于5pm的kd结合人klk5。
101.实施例58：根据实施例34至57中任一项所述的抗体，其中该抗体以小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm的ic50抑制人klk5蛋白酶活性。。
102.实施例59：根据实施例34至58中任一项所述的抗体，其中如通过表面等离子体共振测量，该抗体以小于60pm、小于30pm、小于20pm、小于10pm、或小于5pm的kd结合人klk5；并且其中该抗体以小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm的ic50抑制人klk5蛋白酶活性。
103.实施例60：根据实施例58或实施例59所述的抗体，其中抑制人klk5蛋白酶活性是抑制人klk5介导的底物boc-val-pro-arg-amc的裂解。
104.实施例61：根据实施例34至60中任一项所述的抗体，其中该抗体是多特异性抗体。
105.实施例62：根据实施例61所述的抗体，其中该抗体是双特异性抗体。
106.实施例63：一种经分离的核酸，其编码根据实施例34至62中任一项所述的抗体。
107.实施例64：一种经分离的宿主细胞，其包含根据实施例63所述的核酸。
108.实施例65：一种经分离的宿主细胞，其表达根据实施例34至62中任一项所述的抗体。
109.实施例66：一种生产结合人klk5的抗体的方法，其包含在适合于表达抗体的条件下培养根据实施例64或根据实施例65所述的宿主细胞。
110.实施例67：根据实施例66所述的方法，其进一步包含自该宿主细胞回收该抗体。
111.实施例68：一种抗体，其通过根据实施例67所述的方法来生产。
112.实施例69：一种双特异性抗体，其包含第一结合结构域及第二结合结构域，其中该第一结合结构域结合人klk7结合并且该第二结合结构域结合人klk5，其中该第一结合结构域包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10、(e)cdr-l2，其包
含氨基酸序列seq id no:11和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。
113.实施例70：根据实施例69所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域是人源化的。
114.实施例71：根据实施例69或实施例70所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域包含选自下列的序列：
115.(a)vh序列，其与选自seq id no:15-30的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
116.(b)vl序列，其与选自seq id no:31-38的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
117.(c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列。
118.实施例72：根据实施例69至71中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域包含选自下列的序列：
119.(a)vh序列，其包含选自seq id no:15-30的氨基酸序列；
120.(b)vl序列，其包含选自seq id no:31-38的氨基酸序列；及
121.(c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列。
122.实施例73：根据实施例69至72中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域包含seq id no:29的vh序列以及seq id no:32的vl序列。
123.实施例74：根据实施例69至72中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域包含seq id no:30的vh序列以及seq id no:38的vl序列。
124.实施例75：根据实施例69至74中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含：
125.a)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39及107的氨基酸序列、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40及41的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43及44的氨基酸序列、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；或
126.b)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69及70的氨基酸序列、和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71及72的氨基酸序列，和轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列。
127.实施例76：根据实施例69至75中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:47。
128.实施例77：根据实施例69至75中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:70和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:72，
以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:76。
129.实施例78：根据实施例69至77中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域是人源化的。
130.实施例79：根据实施例第75项至78中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含选自下列的序列：
131.a)vh序列，其与选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
132.b)vl序列，其与选自seq id no:51及54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
133.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
134.d)vh序列，其与选自seq id no:79及81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
135.e)vl序列，其与选自seq id no:80及88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
136.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
137.实施例80：根据实施例第75项至78中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含选自下列的序列：
138.a)vh序列，其与选自seq id no:52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
139.b)vl序列，其与选自seq id no:54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
140.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
141.d)vh序列，其与选自seq id no:81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
142.e)vl序列，其与选自seq id no:88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
143.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
144.实施例81：根据实施例第69项至78中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含选自下列的序列：
145.a)vh序列，其包含选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列；
146.b)vl序列，其包含选自seq id no:51及54-67的氨基酸序列；和
147.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
148.d)vh序列，其包含选自seq id no:79及81-87的氨基酸序列；
149.e)vl序列，其包含选自seq id no:80及88-94的氨基酸序列；和
150.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
151.实施例82：根据实施例第69项至78中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含选自下列的序列：
152.a)vh序列，其包含选自seq id no:52、53、105和106的氨基酸序列；
153.b)vl序列，其包含选自seq id no:54-67的氨基酸序列；及
154.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
155.d)vh序列，其包含选自seq id no:81-87的氨基酸序列；
156.e)vl序列，其包含选自seq id no:88-94的氨基酸序列；及
157.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
158.实施例83：根据实施例69至79中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域包含seq id no:29或seq id no:30的vh氨基酸序列以及seq id no:32或seq id no:38的vl氨基酸序列，及该第二结合结构域包含seq id no:52或seq id no:53的vh氨基酸序列以及seq id no:55或seq id no:62的vl氨基酸序列。
159.实施例84：根据实施例83所述的双特异性抗体，其中(i)该第一结合结构域包含seq id no:29的vh氨基酸序列以及seq id no:32的vl氨基酸序列，或seq id no:30的vh氨基酸序列以及seq id no:38的vl氨基酸序列；及(ii)该第二结合结构域包含seq id no:52的vh序列以及seq id no:55的vl氨基酸序列；或seq id no:53的vh序列以及seq id no:62的vl氨基酸序列。
160.实施例85：根据实施例69至79中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域包含seq id no:30的vh序列以及seq id no:38的vl序列，及该第二结合结构域包含seq id no:53的vh序列以及seq id no:62的vl序列。
161.实施例86：一种双特异性抗体，其包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中该第一结合结构域结合人klk7并且该第二结合结构域结合人klk5，其中该第一结合结构域包含seq id no:30的重链可变结构域(vh)氨基酸序列和seq id no:38的轻链可变结构域(vl)氨基酸序列，及该第二结合结构域包含seq id no:53的vh氨基酸序列以及seq id no:62的vl氨基酸序列。
162.实施例87：根据实施例69至86中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域包含第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域，其中该第一重链可变结构域是与第一重链恒定区连接，并且该第一轻链可变结构域是与第一轻链恒定区连接；并且该第二结合结构域包含第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域，其中该第二重链可变结构域是与第二重链恒定区连接，并且该第二轻链可变结构域是与第二轻链恒定区连接。
163.实施例88：根据实施例87所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区包含杵(knob)突变，并且该第二重链恒定区包含臼(hole)突变；或其中该第一重链恒定区包含臼突变，并且该第二重链恒定区包含杵突变。
164.实施例89：根据实施例88所述的双特异性抗体，其中该抗体是igg1抗体且其中该杵突变包含t366w取代。
165.实施例90：根据实施例88或实施例89所述的双特异性抗体，其中该抗体是igg1抗体并且其中该臼突变包含选自t366s、l368a和y407v中的至少一个、至少两个或三个突变。
166.实施例91：根据实施例90所述的双特异性抗体，其中该抗体是igg1抗体并且其中该臼突变包含t366s、l368a和y407v取代。
167.实施例92：根据实施例87至91中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和/或该第二重链恒定区包含n297g取代(eu编号)。
168.实施例93：根据实施例92所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和该第二重链恒定区各包含n297g取代(eu编号)。
169.实施例94：根据实施例87至93中任一项所述的双特异性抗体，其中：
170.a)该第一重链恒定区进一步包含s183k取代(eu编号)并且该第一轻链恒定区包含v133e取代(eu编号)，并且该第二重链恒定区进一步包含s183e取代(eu编号)并且该第二轻链恒定区包含v133k取代(eu编号)；或
171.b)该第一重链恒定区进一步包含s183e取代(eu编号)并且该第一轻链恒定区包含v133k取代(eu编号)，并且该第二重链恒定区进一步包含s183k取代(eu编号)并且该第二轻链恒定区包含v133e取代(eu编号)。
172.实施例95：根据实施例87至94中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和/或该第二重链恒定区进一步包含至少一个选自m428l及n434s(eu编号)的取代。
173.实施例96：根据实施例95所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和该第二重链恒定区各进一步包含至少一个选自m428l及n434s(eu编号)的取代。
174.实施例97：根据实施例96所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和该第二重链恒定区各进一步包含m428l及n434s取代(eu编号)。
175.实施例98：根据实施例87至97中任一项所述的双特异性抗体，其中：
176.a)该第一重链恒定区包含选自seq id no:96、184、98、186、117、188、119和190的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列；并且该第二重链恒定区包含选自seq id no:97、185、99、187、118、189、120和191的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
177.b)该第二重链恒定区包含选自seq id no:96、184、98、186、117、188、119和190的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列；并且该第一重链恒定区包含选自seq id no:97、185、99、187、118、189、120和191的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列。
178.实施例99：根据实施例98所述的双特异性抗体，其中：
179.a)该第一重链恒定区包含seq id no:96或184的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第二重链恒定区包含seq id no:97或185的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
180.b)该第一重链恒定区包含seq id no:98或186的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第二重链恒定区包含seq id no:99或187的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
181.c)该第二重链恒定区包含seq id no:96或184的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第一重链恒定区包含seq id no:97或185的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
182.d)该第二重链恒定区包含选自seq id no:98或186的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第一重链恒定区包含选自seq id no:99或187的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
183.e)该第一重链恒定区包含seq id no:118或189的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第二重链恒定区包含seq id no:117或188的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
184.f)该第一重链恒定区包含seq id no:120或191的氨基酸序列，并且该第一轻链恒
定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第二重链恒定区包含seq id no:119或190的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
185.g)该第二重链恒定区包含seq id no:118或189的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第一重链恒定区包含seq id no:117或188的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
186.h)该第二重链恒定区包含选自seq id no:120或191的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第一重链恒定区包含选自seq id no:119或190的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列。
187.实施例100：一种双特异性抗体，其包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中该第一结合结构域结合人klk7并且该第二结合结构域结合人klk5，其中该第一结合结构域包含seq id no:108或192的重链氨基酸序列以及seq id no:109的轻链氨基酸序列，并且该第二结合结构域包含seq id no:110或193的重链氨基酸序列以及seq id no:111的轻链氨基酸序列。
188.实施例101：一种双特异性抗体，其包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中该第一结合结构域结合人klk7并且该第二结合结构域结合人klk5，其中该第一结合结构域包含seq id no:112或194的重链氨基酸序列以及seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且该第二结合结构域包含seq id no:114或195的重链氨基酸序列以及seq id no:115的轻链氨基酸序列。
189.实施例102：一种双特异性抗体，其包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中该第一结合结构域结合人klk7并且该第二结合结构域结合人klk5，其中该第一结合结构域包含seq id no:108的重链氨基酸序列和seq id no:109的轻链氨基酸序列，并且该第二结合结构域包含seq id no:110的重链氨基酸序列和seq id no:111的轻链氨基酸序列。
190.实施例103：一种双特异性抗体，其包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中该第一结合结构域结合人klk7并且该第二结合结构域结合人klk5，其中该第一结合结构域包含seq id no:112的重链氨基酸序列和seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且该第二结合结构域包含seq id no:114的重链氨基酸序列和seq id no:115的轻链氨基酸序列。
191.实施例104：一种双特异性抗体，其包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中该第一结合结构域结合人klk7并且该第二结合结构域结合人klk5，其中该第二结合结构域包含
192.a)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:107、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40及41的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43或44、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；或
193.b)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39及107的氨基酸序列、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43及44的氨基酸序列、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；或
194.c)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39或107、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40及41的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:44、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；或
195.d)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39及107的氨基酸序列、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40及41的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43及44的氨基酸序列、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:47-49的氨基酸序列；或
196.e)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:70、和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71及72的氨基酸序列，和轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列；或
197.f)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69及70的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:72，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列；或
198.g)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69及70的氨基酸序列、和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71及72的氨基酸序列，和轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:76-78的氨基酸序列。
199.实施例105：根据实施例第104项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:47。
200.实施例106：根据实施例第104项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:70和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:72，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:76。
201.实施例107：根据实施例104至106中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域是人源化的。
202.实施例108：根据实施例第104项至107中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含选自下列的序列：
203.a)vh序列，其与选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
204.b)vl序列，其与选自seq id no:51及54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
205.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
206.d)vh序列，其与选自seq id no:79及81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
207.e)vl序列，其与选自seq id no:80及88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
208.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
209.实施例109：根据实施例第104项至107中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含选自下列的序列：
210.a)vh序列，其与选自seq id no:52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
211.b)vl序列，其与选自seq id no:54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
212.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
213.d)vh序列，其与选自seq id no:81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
214.e)vl序列，其与选自seq id no:88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
215.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
216.实施例110：根据实施例第104项至107中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含选自下列的序列：
217.a)vh序列，其包含选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列；
218.b)vl序列，其包含选自seq id no:51及54-67的氨基酸序列；和
219.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
220.d)vh序列，其包含选自seq id no:79及81-87的氨基酸序列；
221.e)vl序列，其包含选自seq id no:80及88-94的氨基酸序列；和
222.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
223.实施例111：根据实施例第104项至107中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二结合结构域包含选自下列的序列：
224.a)vh序列，其包含选自seq id no:52、53、105和106的氨基酸序列；
225.b)vl序列，其包含选自seq id no:54-67的氨基酸序列；及
226.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
227.d)vh序列，其包含选自seq id no:81-87的氨基酸序列；
228.e)vl序列，其包含选自seq id no:88-94的氨基酸序列；及
229.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
230.实施例112：根据实施例104至107中任一项所述的双特异性抗体，其中该第二半的氨基酸抗体包含seq id no:52或seq id no:53的vh序列以及seq id no:55或seq id no:
62的vl氨基酸序列。
231.实施例113：根据实施例112所述的双特异性抗体，其中该第二半的氨基酸抗体包含seq id no:52的vh序列以及seq id no:55的vl氨基酸序列或seq id no:53的vh序列以及seq id no:62的vl氨基酸序列。
232.实施例114：根据实施例104至113中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域是人源化的。
233.实施例115：根据实施例104至114中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一结合结构域包含第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域，其中该第一重链可变结构域是与第一重链恒定区连接，并且该第一轻链可变结构域是与第一轻链恒定区连接；并且该第二结合结构域包含第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域，其中该第二重链可变结构域是与第二重链恒定区连接，并且该第二轻链可变结构域是与第二轻链恒定区连接。
234.实施例116：根据实施例115所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区包含杵(knob)突变，并且该第二重链恒定区包含臼(hole)突变；或其中该第一重链恒定区包含臼突变，并且该第二重链恒定区包含杵突变。
235.实施例117：根据实施例116所述的双特异性抗体，其中该抗体是igg1抗体并且其中该杵突变包含t366w突变。
236.实施例118：根据实施例116或实施例117所述的双特异性抗体，其中该抗体是igg1抗体并且其中该臼突变包含选自t366s、l368a和y407v的至少一个、至少两个或三个突变。
237.实施例119：根据实施例118所述的双特异性抗体，其中该抗体是igg1抗体并且其中该臼突变包含t366s、l368a和y407v突变。
238.实施例120：根据实施例115至119中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和/或该第二重链恒定区包含n297g取代(eu编号)。
239.实施例121：根据实施例120所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和该第二重链恒定区各包含n297g取代(eu编号)。
240.实施例122：根据实施例115至121中任一项所述的双特异性抗体，其中：
241.a)该第一重链恒定区进一步包含s183k取代(eu编号)并且该第一轻链恒定区包含v133e取代(eu编号)，并且该第二重链恒定区进一步包含s183e取代(eu编号)并且该第二轻链恒定区包含v133k取代(eu编号)；或
242.b)该第一重链恒定区进一步包含s183e取代(eu编号)并且该第一轻链恒定区包含v133k取代(eu编号)，并且该第二重链恒定区进一步包含s183k取代(eu编号)并且该第二轻链恒定区包含v133e取代(eu编号)。
243.实施例123：根据实施例115至122中任一项所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和/或该第二重链恒定区进一步包含至少一个选自m428l及n434s(eu编号)的取代。
244.实施例124：根据实施例123所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和该第二重链恒定区各进一步包含至少一个选自m428l及n434s(eu编号)的取代。
245.实施例125：根据实施例124所述的双特异性抗体，其中该第一重链恒定区和该第二重链恒定区各进一步包含m428l及n434s取代(eu编号)。
246.实施例126：根据实施例115至125中任一项所述的双特异性抗体，其中：
247.a)该第一重链恒定区包含选自seq id no:96、184、98、186、117、188、119和190的
氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列；并且该第二重链恒定区包含选自seq id no:97、185、99、187、118、189、120和191的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
248.b)该第二重链恒定区包含选自seq id no:96、184、98、186、117、188、119和190的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列；并且该第一重链恒定区包含选自seq id no:97、185、99、187、118、189、120和191的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列。
249.实施例127：根据实施例126所述的双特异性抗体，其中：
250.a)该第一重链恒定区包含seq id no:96或184的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第二重链恒定区包含seq id no:97或185的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
251.b)该第一重链恒定区包含seq id no:98或186的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第二重链恒定区包含seq id no:99或187的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
252.c)该第二重链恒定区包含seq id no:96或184的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第一重链恒定区包含seq id no:97或185的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
253.d)该第二重链恒定区包含选自seq id no:98或186的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第一重链恒定区包含选自seq id no:99或187的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
254.e)该第一重链恒定区包含seq id no:118或189的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第二重链恒定区包含seq id no:117或188的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
255.f)该第一重链恒定区包含seq id no:120或191的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第二重链恒定区包含seq id no:119或190的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
256.g)该第二重链恒定区包含seq id no:118或189的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第一重链恒定区包含seq id no:117或188的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列；或
257.h)该第二重链恒定区包含选自seq id no:120或191的氨基酸序列，并且该第二轻链恒定区包含seq id no:103的氨基酸序列，并且该第一重链恒定区包含选自seq id no:119或190的氨基酸序列，并且该第一轻链恒定区包含seq id no:104的氨基酸序列。
258.实施例128：根据实施例69至127中任一项所述的双特异性抗体，其中通过如通过表面等离子体共振测量，该抗体以小于60pm、小于30pm、小于20pm、小于10pm、或小于5pm的kd结合人klk5。
259.实施例129：根据实施例69至128中任一项所述的双特异性抗体，其中该抗体抑制人klk5蛋白酶活性的ic50小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm。
260.实施例130：根据实施例69至129中任一项所述的抗体，其中如通过表面等离子体共振测量，该抗体以小于60pm、小于30pm、小于20pm、小于10pm、或小于5pm的kd结合人klk5；
并且其中该抗体以小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm的ic50抑制人klk5蛋白酶活性。
261.实施例131：根据实施例129或实施例130所述的双特异性抗体，其中抑制人klk5蛋白酶活性是抑制人klk5介导的底物boc-val-pro-arg-amc的裂解。
262.实施例132：根据实施例69至131中任一项所述的双特异性抗体，其中如通过表面等离子体共振测量，该抗体以小于20pm、或小于15pm、或小于10pm、小于5pm、或小于3pm、或小于2pm、或小于1pm的kd结合人klk7。
263.实施例133：根据实施例69至132中任一项所述的双特异性抗体，其中该抗体抑制人klk7蛋白酶活性的ic50小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm。
264.实施例134：根据实施例69至133中任一项所述的双特异性抗体，其中如通过表面等离子体共振测量，该抗体小于20pm、或小于15pm、或小于10pm、小于5pm、或小于3pm、或小于2pm或小于1pm的kd结合人klk7；并且其中该抗体以小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm的ic50抑制人klk7蛋白酶活性。
265.实施例135：根据实施例133或实施例134所述的双特异性抗体，其中抑制人klk7蛋白酶活性是抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸。
266.实施例136：根据实施例69至135中任一项所述的双特异性抗体，其中该人klk5的双特异性抗体的kd及该人klk7的抗体的kd是彼此的3倍以内、或2.5倍以内、或2倍以内、或1.5倍以内。
267.实施例137：一种经分离的核酸，其编码根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体。
268.实施例138：一种经分离的核酸，其编码根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体的第一结合结构域。
269.实施例139：一种经分离的核酸，其编码根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体的第二结合结构域。
270.实施例140：一种经分离的宿主细胞，其包含根据实施例137所述的经分离的核酸。
271.实施例141：一种经分离的宿主细胞，其包含根据实施例138所述的经分离的核酸。
272.实施例142：一种经分离的宿主细胞，其包含根据实施例139所述的经分离的核酸。
273.实施例143：一种经分离的宿主细胞，其表达根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体。
274.实施例144：一种经分离的宿主细胞，其表达根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体的第一结合结构域。
275.实施例145：一种经分离的宿主细胞，其编码根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体的第二结合结构域。
276.实施例146：一种生产结合人klk5和人klk7的双特异性抗体的方法，其包含在适合于表达抗体的条件下培养根据实施例140或根据实施例143所述的宿主细胞。
277.实施例147：根据实施例146所述的方法，其进一步包含自该宿主细胞回收该抗体。
278.实施例148：一种生产结合人klk5和人klk7的双特异性抗体的方法，其包含(i)在适合于表达该第一结合结构域的条件下培养根据实施例141或根据实施例144所述的宿主
细胞；以及(ii)在适合于表达该第二结合结构域的条件下培养根据实施例142或根据实施例145所述的宿主细胞。
279.实施例149：根据实施例148所述的方法，其进一步包含回收该第一结合结构域及该第二结合结构域并组装该双特异性抗体。
280.实施例150：一种药物组合物，其包含根据实施例1至27中任一项所述的抗体以及药用载体。
281.实施例151：根据实施例150所述的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
282.实施例152：根据实施例151所述的药物组合物，其中该另外的治疗剂是klk5抑制剂。
283.实施例153：根据实施例152所述的药物组合物，其中该klk5抑制剂是抗klk5抗体。
284.实施例154：根据实施例153所述的药物组合物，其中该抗klk5抗体包含：
285.a)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39及107的氨基酸序列、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40及41的氨基酸序列和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43及44的氨基酸序列、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；或
286.b)重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69及70的氨基酸序列、和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71及72的氨基酸序列，和轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74、和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列。
287.实施例155：根据实施例153或实施例154所述的药物组合物，其中该抗klk5抗体包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:47。
288.实施例156：根据实施例153或实施例154所述的药物组合物，其中该抗klk5抗体包含：重链可变结构域(vh)，其包含(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68、(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:70和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:72，以及轻链可变结构域(vl)，其包含(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73、(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:76。
289.实施例157：根据实施例153至156中任一项所述的药物组合物，其中该抗klk5抗体是单克隆抗体。
290.实施例158：根据实施例153至157中任一项所述的药物组合物，其中该抗klk5抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
291.实施例159：根据实施例153至158中任一项所述的药物组合物，其中该抗klk5抗体是结合人klk5的抗体片段。
292.实施例160：根据实施例153至159中任一项所述的抗体，其中该抗klk5抗体包含选自下列的序列：
293.a)vh序列，其与选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
294.b)vl序列，其与选自seq id no:51及54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
295.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
296.d)vh序列，其与选自seq id no:79及81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
297.e)vl序列，其与选自seq id no:80及88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
298.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
299.实施例161：根据实施例153至159中任一项所述的抗体，其中该抗klk5抗体包含选自下列的序列：
300.a)vh序列，其与选自seq id no:52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
301.b)vl序列，其与选自seq id no:54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
302.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
303.d)vh序列，其与选自seq id no:81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；
304.e)vl序列，其与选自seq id no:88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；及
305.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
306.实施例162：根据实施例153至159中任一项所述的抗体，其中该抗klk5抗体包含选自下列的序列：
307.a)vh序列，其包含选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列；
308.b)vl序列，其包含选自seq id no:51及54-67的氨基酸序列；和
309.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
310.d)vh序列，其包含选自seq id no:79及81-87的氨基酸序列；
311.e)vl序列，其包含选自seq id no:80及88-94的氨基酸序列；和
312.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
313.实施例163：根据实施例153至159中任一项所述的抗体，其中该抗klk5抗体包含选自下列的序列：
314.a)vh序列，其包含选自seq id no:52、53、105和106的氨基酸序列；
315.b)vl序列，其包含选自seq id no:54-67的氨基酸序列；及
316.c)如(a)中所定义的vh序列以及如(b)中所定义的vl序列；
317.d)vh序列，其包含选自seq id no:81-87的氨基酸序列；
318.e)vl序列，其包含选自seq id no:88-94的氨基酸序列；及
319.f)如(d)中所定义的vh序列以及如(e)中所定义的vl序列。
320.实施例164：根据实施例153所述的药物组合物，其中抗klk5抗体是根据实施例34至62中任一项所述的抗体。
321.实施例165：根据实施例153所述的药物组合物，其中抗klk5抗体是根据实施例47、48、51和52中任一项所述的抗体。
322.实施例166：一种药物组合物，其包含根据实施例34至62中任一项所述的抗体以及药用载体。
323.实施例167：根据实施例166所述的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
324.实施例168：根据实施例167所述的药物组合物，其中该另外的治疗剂是klk7抑制剂。
325.实施例169：根据实施例168所述的药物组合物，其中该klk7抑制剂是抗klk7抗体。
326.实施例170：根据实施例169所述的药物组合物，其中抗klk7抗体是根据实施例1至27中任一项所述的抗体。
327.实施例171：一种药物组合物，其包含根据实施例1至27中任一项所述的抗体以及根据实施例34至62中任一项所述的抗体和药用载体。
328.实施例172：根据实施例150至171中任一项所述的药物组合物，其包含选自抗炎剂及抗生素的另外的治疗剂。
329.实施例173：一种药物组合物，其包含根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体。
330.实施例174：根据实施例173所述的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
331.实施例175：根据实施例174所述的药物组合物，其中该另外的治疗剂是抗炎剂。
332.实施例176：根据实施例150至175中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物是用于局部施用。
333.实施例177：根据实施例150至175中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物是用于皮下施用或静脉内施用。
334.实施例178：根据实施例1至27及34至62中任一项所述的抗体、根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例150至177中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
335.实施例179：根据实施例1至27及34至62中任一项所述的抗体、根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例150至177中任一项所述的药物组合物，其用于治疗选自netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻的疾病。
336.实施例180：根据实施例179所述的抗体、双特异性抗体或药物组合物，其中该哮喘是选自特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林敏感性/加重性哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未经皮质类固醇治疗的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇抗性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断并且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、不受皮质类固醇控制的哮喘、t辅助淋巴细胞2型(th2)或高2型(th2)、或2型(t2)驱动的哮喘、嗜酸细胞性哮喘、骨膜素高哮喘(periostin-high asthma)、嗜酸性粒细胞高哮喘、低th2哮喘或非th2驱动的哮喘、骨膜蛋白水平低和嗜酸性粒细胞低哮喘。
337.实施例181：根据实施例180所述的抗体、双特异性抗体或药物组合物，其中该哮喘是嗜酸性粒细胞低哮喘。
338.实施例182：一种根据实施例1至27中任一项所述的抗体以及根据实施例34至62中
任一项所述的抗体的组合，其用作药物。
339.实施例183：一种根据实施例1至27中任一项所述的抗体以及根据实施例34至62中任一项所述的抗体的组合，其用于治疗选自netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎及酒糟鼻的疾病。
340.实施例184：根据实施例183所述的组合，其中该哮喘是选自特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林敏感性/加重性哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未经皮质类固醇治疗的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇抗性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断并且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、不受皮质类固醇控制的哮喘、t辅助淋巴细胞2型(th2)、高2型(th2)、或2型(t2)驱动的哮喘、嗜酸细胞性哮喘、骨膜素高哮喘、嗜酸性粒细胞高哮喘、低th2哮喘或非th2驱动的哮喘、骨膜蛋白水平低和嗜酸性粒细胞低哮喘。
341.实施例185：根据实施例184所述的组合，其中该哮喘是嗜酸性粒细胞低哮喘。
342.实施例186：一种根据实施例1至27及34至62中任一项所述的抗体、根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例150至177中任一项所述的药物组合物的用途，其用于制备用于治疗选自netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻的疾病的药物。
343.实施例187：根据实施例186所述的用途，其中该哮喘是选自特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林敏感性/加重性哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未经皮质类固醇治疗的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇抗性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断并且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、不受皮质类固醇控制的哮喘、t辅助淋巴细胞2型(th2)、高2型(th2)、或2型(t2)驱动的哮喘、嗜酸细胞性哮喘、骨膜素高哮喘、嗜酸性粒细胞高哮喘、低th2哮喘或非th2驱动的哮喘、骨膜蛋白水平低和嗜酸性粒细胞低哮喘。
344.实施例188：根据实施例187所述的用途，其中该哮喘是嗜酸性粒细胞低哮喘。
345.实施例189：一种根据实施例1至27中任一项所述的抗体及根据实施例34至第62项中任一项所述的抗体的组合的用途，其用于制备用于治疗选自netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻的疾病的药物。
346.实施例190：根据实施例189所述的用途，其中该哮喘是选自特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林敏感性/加重性哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未经皮质类固醇治疗的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇抗性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断并且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、不受皮质类固醇控制的哮喘、t辅助淋巴细胞2型(th2)或高2型(th2)、或2型(t2)驱动的哮喘、嗜酸细胞性哮喘、骨膜素高哮喘、嗜酸性粒细胞高哮喘、低th2哮喘或非th2驱动的哮喘、骨膜蛋白水平低和嗜酸性粒细胞低哮喘。
347.实施例191：根据实施例190所述的用途，其中该哮喘是嗜酸性粒细胞低哮喘。
348.实施例192：一种根据实施例1至27及34至62中任一项所述的抗体、根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例150至177中任一项所述的药物组合物的用途，其用于制备用于减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的药物。
349.实施例193：一种根据实施例1至27中任一项所述的抗体及根据实施例34至62中任一项所述的抗体的组合的用途，其用于制备用于减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子
的药物。
350.实施例194：一种治疗具有选自netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻的疾病的个体的方法，其包含将有效量的根据实施例1至27及34至62中任一项所述的抗体、根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例150至177中任一项所述的药物组合物施用于该个体。
351.实施例195：一种治疗具有选自netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻的疾病的个体的方法，其包含将a)有效量的根据实施例1至27中任一项所述的抗体；以及b)有效量的根据实施例34至62中任一项所述的抗体施用于该个体。
352.实施例196：根据实施例第195项所述的方法，其中该(a)的抗体和该(b)的抗体是同时施用。
353.实施例197：根据实施例第195项所述的方法，其中该(a)的抗体和该(b)的抗体是依次施用。
354.实施例198：一种治疗具有选自netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻的疾病的个体的方法，其包含将有效量的根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体或有效量的根据实施例150至177中任一项所述的药物组合物施用于该个体。
355.实施例199：根据实施例194至198中任一项所述的方法，其中该哮喘是选自特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林敏感性/加重性哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未经皮质类固醇治疗的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇抗性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断并且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、不受皮质类固醇控制的哮喘、t辅助淋巴细胞2型(th2)或高2型(th2)、或2型(t2)驱动的哮喘、嗜酸细胞性哮喘、骨膜素高哮喘、嗜酸性粒细胞高哮喘、低th2哮喘或非th2驱动的哮喘、骨膜蛋白水平低和嗜酸性粒细胞低哮喘。
356.实施例200：根据实施例199所述的方法，其中该哮喘是嗜酸性粒细胞低哮喘。
357.实施例201：根据实施例194至198中任一项所述的方法，其中该个体具有netherton综合征。
358.实施例202：根据实施例194至198中任一项所述的方法，其中该个体具有酒糟鼻。
359.实施例203：根据实施例194至202中任一项所述的方法，其进一步包含将另外的治疗剂施用于该个体。
360.实施例204：根据实施例203所述的方法，其中该另外的治疗剂是抗炎剂。
361.实施例205：一种减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复个体的上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法，其包含将有效量的根据实施例1至27以及34至62中任一项所述的抗体、根据实施例69至136中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例150至177中任一项所述的药物组合物施用于该个体，以减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全和/或恢复个体的上皮屏障。
362.实施例206：一种减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复个体的上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法，其包含将a)有效量的根据实施例1至27中任一项所述的抗体；及b)有效量的根据实施例34至62中
任一项所述的抗体施用于该个体，以减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全和/或恢复个体的上皮屏障。
363.实施例207：根据实施例第206项所述的方法，其中该(a)的抗体和该(b)的抗体是同时施用。
364.实施例208：根据实施例第206项所述的方法，其中该(a)的抗体和该(b)的抗体是依次施用。
365.实施例209：一种减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复个体的上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法，其包含将根据实施例69至第136项中任一项所述的双特异性抗体、或有效量的根据实施例第150项至第177项中任一项所述的药物组合物施用于该个体，以减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全和/或恢复个体的上皮屏障。
366.实施例210：根据实施例194至209中任一项所述的方法，其中该施用是皮下施用或静脉内施用。
367.实施例211：根据实施例194至209中任一项所述的方法，其中该施用是局部施用。
368.实施例212：根据实施例194至209中任一项所述的方法，其中该施用是静脉内施用。
369.实施例213：一种结合人klk7的经分离的抗体，其中当结合人klk7时导致人klk7的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk7的底物结合位点和/或活性位点的破坏。
370.实施例214：根据实施例213所述的经分离的抗体，其是双特异性抗体。
371.实施例215：根据实施例214所述的经分离的抗体，其中该双特异性抗体结合人klk7和人klk5。
372.实施例216：根据实施例215所述的经分离的抗体，其中当结合人klk5时导致人klk5的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk5的底物结合位点和/或活性位点的破坏。
373.实施例217：根据实施例216所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、gly133、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177、asp178、gly184、asp185、lys186、ala186a、arg188、asn223、arg224、pro225和lys233，其根据标准蛋白酶编号。
374.实施例218：根据实施例217所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自由以下项组成的组的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177、asp178、arg224和lys233，其根据标准蛋白酶编号。
375.实施例219：根据实施例217所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、gly133、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177和lys233，其根据标准蛋白酶编号。
376.实施例220：根据实施例217所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人klk5上的表
位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：ser131、ala132、gly133、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、pro173、arg174、gly184、asp185、lys186、ala186a、arg188、asn223、arg224和pro225，其根据标准蛋白酶编号。
377.实施例221：根据实施例213至220中任一项所述的经分离的抗体，其中该抗体结合klk7(seq id no:4)的氨基酸r71-n82、k152-s158和/或q211-k222内的表位。
378.实施例222：根据实施例213至221中任一项所述的经分离的抗体，其中该抗体结合包含klk7(seq id no:4)的氨基酸h72、p73、g74、s76、q78、n82、n157、k211和/或t213中的一者或多者的表位。
379.实施例223：一种包含第一结合结构域及第二结合结构域的双特异性抗体，其中该第一结合结构域结合人klk7并且该第二结合结构域结合人klk5，其中当结合人klk7时导致人klk7的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk7的底物结合位点和/或活性位点的破坏。
380.实施例224：根据实施例223所述的双特异性抗体，其中当结合人klk5时导致人klk5的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk5的底物结合位点和/或活性位点的破坏。
381.实施例225：一种包含第一结合结构域及第二结合结构域的双特异性抗体，其中该第一结合结构域结合人klk7并且该第二结合结构域结合人klk5，其中当结合人klk5时导致人klk5的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk5的底物结合位点和/或活性位点的破坏。
382.实施例226：根据实施例224或实施例225所述的双特异性抗体，其中所述抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、gly133、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177、asp178、gly184、asp185、lys186、ala186a、arg188、asn223、arg224、pro225和lys233，其根据标准蛋白酶编号。
383.实施例227：根据实施例226所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自由以下项组成的组的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177、asp178、arg224和lys233，其根据标准蛋白酶编号。
384.实施例228：根据实施例226所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、gly133、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177和lys233，其根据标准蛋白酶编号。
385.实施例229：根据实施例226所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：ser131、ala132、gly133、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、pro173、arg174、gly184、asp185、lys186、ala186a、arg188、asn223、arg224和pro225，其根据标准蛋白酶编号。
386.实施例230：根据实施例223至229中任一项所述的双特异性抗体，其中该抗体结合klk7(seq id no:4)的氨基酸r71-n82、k152-s158和/或q211-k222内的表位。
387.实施例231：根据实施例223至230中任一项所述的双特异性抗体，其中该抗体结合包含klk7(seq id no:4)的氨基酸h72、p73、g74、s76、q78、n82、n157、k211和/或t213中的一者或多者的表位。
388.实施例232：一种药物组合物，其包含根据实施例213至222中任一项所述的抗体以及药用载体。
389.实施例233：一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施例223至231中任一项所述的双特异性抗体以及药用载体。
390.实施例234：根据实施例213至222中任一项所述的抗体、根据实施例223至231中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例232或实施例233所述的药物组合物，其用作药物。
391.实施例235：根据实施例213至222中任一项所述的抗体、根据实施例223至231中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例232或实施例233所述的药物组合物，其用于治疗选自以下项的疾病：内瑟顿综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻。
392.实施例236：根据实施例235所述的所使用的抗体、双特异性抗体、或药物组合物，其中所述哮喘选自特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林敏感性/加重性哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未经皮质类固醇治疗的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇抗性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断并且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、不受皮质类固醇控制的哮喘、t辅助淋巴细胞2型(th2)或高2型(th2)、或2型(t2)驱动的哮喘、嗜酸细胞性哮喘、骨膜素高哮喘、嗜酸性粒细胞高哮喘、th2低哮喘或非th2驱动的哮喘、骨膜素低哮喘和嗜酸性粒细胞低哮喘。
393.实施例237：根据实施例213至222中任一项所述的抗体、根据实施例223至231中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例232或实施例233所述的药物组合物，其用于减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子。
394.实施例238：根据实施例213至222中任一项所述的抗体、根据实施例223至231中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例232或实施例233所述的药物组合物的用途，其用于制备用于治疗选自以下项的疾病的药物：内瑟顿综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻。
395.实施例239：根据实施例238所述的用途，其中所述哮喘选自特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林敏感性/加重性哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、皮质类固醇初治哮喘未经皮质类固醇治疗的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇抗性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断并且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、不受皮质类固醇控制的哮喘、t辅助淋巴细胞2型(th2)或高2型(th2)、或2型(t2)驱动的哮喘、嗜酸细胞性哮喘、骨膜素高哮喘、嗜酸性粒细胞高哮喘、th2低哮喘或非th2驱动的哮喘、骨膜素低哮喘和嗜酸性粒细胞低哮喘。
396.实施例240：根据实施例213至222中任一项所述的抗体、根据实施例223至231中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例232或实施例233所述的药物组合物的用途，其用于制备用于以下项的药物：减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子。
397.实施例241：一种治疗患有选自以下项的疾病的个体的方法：内瑟顿综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施例213至222中任一项所述的抗体、根据实施例223至231中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例232或实施例233所述的药物组合物。
398.实施例242：根据实施例241所述的方法，其中所述哮喘选自特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林敏感性/加重性哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、皮质类固醇初治哮喘未经皮质类固醇治疗的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇抗性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断并且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、不受皮质类固醇控制的哮喘、t辅助淋巴细胞2型(th2)或高2型(th2)、或2型(t2)驱动的哮喘、嗜酸细胞性哮喘、骨膜素高哮喘、嗜酸性粒细胞高哮喘、th2低哮喘或非th2驱动的哮喘、骨膜素低哮喘和嗜酸性粒细胞低哮喘。
399.实施例243：一种个体中减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施例213至222中任一项所述的抗体、根据实施例223至231中任一项所述的双特异性抗体、或根据实施例232或实施例233所述的药物组合物，以用来减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全和/或恢复上皮屏障。
400.实施例244：根据实施例179或实施例235所述的所使用的抗体、双特异性抗体、或药物组合物，其中所述疾病是内瑟顿综合征。
401.实施例245：根据实施例183所述的所使用的组合，其中所述疾病是内瑟顿综合征。
402.实施例246：根据实施例186、189和238中任一项所述的用途，其中所述疾病是内瑟顿综合征。
403.实施例247：根据实施例192、193和240中任一项所述的用途，其中所述药物用于在患有内瑟顿综合征的个体中减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子。
404.实施例248：一种用于治疗内瑟顿综合征的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与人klk7结合并且所述第二结合结构域与人klk5结合，其中所述第一结合结构域包含seq id no:112或194的重链氨基酸序列和seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且所述第二结合结构域包含seq id no:114或195的重链氨基酸序列和seq id no:115的轻链氨基酸序列。
405.实施例249：一种用于治疗内瑟顿综合征的抗klk5抗体，其中所述抗klk5抗体包含(a)seq id no:52的vh序列和seq id no:55的vl序列；或(b)seq id no:53的vh序列和seq id no:62的vl序列。
406.实施例250：一种用于治疗内瑟顿综合征的抗klk7抗体，其中所述抗klk7抗体包含(a)seq id no:29的vh序列和seq id no:32的vl序列；或(b)seq id no:30的vh序列和seq id no:38的vl序列。
407.实施例251：一种用于治疗内瑟顿综合征的抗体组合，其中所述抗体组合包含抗klk5抗体和抗klk7抗体，其中所述抗klk5抗体包含seq id no:52的vh序列和seq id no:55的vl序列，或seq id no:53的vh序列和seq id no:62的vl序列；并且其中所述抗klk7抗体
包含seq id no:29的vh序列和seq id no:32的vl序列，或seq id no:30的vh序列和seq id no:38的vl序列。
408.实施例252：一种治疗患有选自以下项的疾病的个体的方法：内瑟顿综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合人klk7并且抑制klk7蛋白酶活性，并且所述第二结合结构域结合人klk5并且抑制klk5蛋白酶活性。
409.实施例253：一种治疗患有选自以下项的疾病的个体的方法：内瑟顿综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和酒糟鼻，所述方法包括向所述个体施用抗klk5抗体和抗klk7抗体，其中所述抗klk5抗体抑制klk5蛋白酶活性，并且其中所述抗klk7抗体抑制klk7蛋白酶活性。
410.实施例254：一种个体中减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法，所述方法包括向所述个体施用klk5拮抗剂和klk7拮抗剂。
411.实施例255：根据实施例254所述的方法，其中所述klk5拮抗剂是抗klk5抗体和/或所述klk7拮抗剂是抗klk7抗体。
412.实施例256：一种个体中减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合人klk7并且抑制klk7蛋白酶活性，并且所述第二结合结构域结合人klk5并且抑制klk5蛋白酶活性。
413.实施例257：一种个体中减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法，所述方法包括向所述个体施用抗klk5抗体和抗klk7抗体，其中所述抗klk5抗体抑制klk5蛋白酶活性，并且其中所述抗klk7抗体抑制klk7蛋白酶活性。
414.实施例258：一种在患有内瑟顿综合征的个体中减轻皮疹和/或结疤脱屑的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合人klk7并且抑制klk7蛋白酶活性，并且所述第二结合结构域结合人klk5并且抑制klk5蛋白酶活性。
415.实施例259：一种在患有内瑟顿综合征的个体中减轻皮疹和/或结疤脱屑的方法，所述方法包括向所述个体施用抗klk5抗体和抗klk7抗体，其中所述抗klk5抗体抑制klk5蛋白酶活性，并且其中所述抗klk7抗体抑制klk7蛋白酶活性。
416.实施例260：根据实施例192、193、240或247中任一项所述的用途，或根据实施例205、206、209、243、或254至257中任一项所述的方法，或根据实施例237所述的所使用的抗体、双特异性抗体、或药物组合物，其中所述皮肤炎症细胞因子是il-8、tnfα、il-6、il-4和/或g-csf中的一者或多者。
417.实施例261：一种双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与人klk7结合并且所述第二结合结构域与人klk5结合，其中所述第一结合结构域包含seq id no:194的重链氨基酸序列和seq id no:113的
轻链氨基酸序列，并且所述第二结合结构域包含seq id no:195的重链氨基酸序列和seq id no:115的轻链氨基酸序列。
418.实施例262：一种双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与人klk7结合并且所述第二结合结构域与人klk5结合，其中所述第一结合结构域包含seq id no:112的重链氨基酸序列和seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且所述第二结合结构域包含seq id no:195的重链氨基酸序列和seq id no:115的轻链氨基酸序列。
419.实施例263：一种双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与人klk7结合并且所述第二结合结构域与人klk5结合，其中所述第一结合结构域包含seq id no:194的重链氨基酸序列和seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且所述第二结合结构域包含seq id no:114的重链氨基酸序列和seq id no:115的轻链氨基酸序列。
附图说明
420.图1a至1b显示抗klk7抗体rb.14h11c-lc轻链可变区与某些人源化形式的轻链可变区(1a)和抗klk7抗体rb.14h11c-hc重链可变区与某些人源化形式的重链可变区(1b)的排列比对。示出根据chothia、kabat和接触残基的cdr。人源化形式相对于亲本兔可变区的差异以白色字与黑色背景显示。
421.图2a至2b显示人源化抗klk5抗体hu.10c5-h28l5轻链可变区与某些经修饰人源化形式的轻链可变区(2a)和人源化抗klk5抗体hu.10c5-h28l5重链可变区与某些经修饰人源化形式的重链可变区(2b)的排列比对。示出根据chothia、kabat和接触残基的cdr。人源化形式相对于亲本可变区的差异以白色字与黑色背景显示。
422.图3a至3b显示人源化抗klk5抗体hu.9h5-h14l4轻链可变区与某些经修饰人源化形式的轻链可变区(3a)和人源化抗klk5抗体hu.9h5-h14l4重链可变区与某些经修饰人源化形式的重链可变区(3b)的排列比对。示出根据chothia、kabat和接触残基的cdr。人源化形式相对于亲本可变区的差异以白色字与黑色背景显示。
423.图4显示人源化抗klk5抗体hu.10c5.l5h28重链和轻链变体与亲本hu.10c5.l5h28的亲和力。
424.图5显示人源化抗klk5抗体hu.9h5.l4h14重链和轻链变体的缔合速率(ka)和解离速率(kd)的散点图。
425.图6a至6b显示针对人klk5(图6a)和食蟹猴klk5(图6b)所示hu.10c5.l5h28变体的表面等离子体共振记录曲线。
426.图7a至7b显示针对人klk5(图7a)和食蟹猴klk5(图7b)所示hu.9h5.l4h14变体的表面等离子体共振记录曲线。
427.图8显示在人正常皮肤、特应性皮炎和酒糟鼻中的代表性klk5蛋白质表达。
428.图9显示在人正常皮肤、特应性皮炎、酒糟鼻和银屑病中的代表性klk7 mrna染色。
429.图10a至10c显示在人正常皮肤、特应性皮炎、酒糟鼻和银屑病中的klk5表达深度(10a)、klk7表达深度(10b)和spink5表达深度(10c)。
430.图11显示经施用盐水、klk5、或klk7的小鼠的经皮水分流失。
431.图12a至12c显示sds/s中的每日临床评分(12a)、终末特应性皮炎总分(12b)和auc皮肤评分(12c)。金黄色葡萄球菌蛋白质a特应性皮炎模型小鼠施用于同种型对照抗体、抗鼠klk5抗体、抗鼠klk7抗体、抗klk5和抗klk7抗体组合、或spink5-fc。
432.图13显示在sds/s的终末特应性皮炎总分、经皮水分流失、和组织学疾病严重度评分。金黄色葡萄球菌蛋白质a特应性皮炎模式小鼠施用于同种型对照抗体、抗鼠klk5抗体、抗鼠klk7抗体、抗klk5和抗klk7抗体组合或抗il-13抗体。
433.图14显示来自sds/s皮肤的代表性的苏木精和曙红染色。金黄色葡萄球菌蛋白质a特应性皮炎模式小鼠施用于同种型对照抗体、抗klk5和抗klk7抗体组合或抗il-13抗体。
434.图15显示本文提供的一种示例性双特异性抗klk5/klk7抗体的示意图，其包括促进适当的重链/轻链配对的取代和/或降低效应子功能的取代。在替代型式中，杵可存在于抗klk5臂上，而孔洞可存在于抗klk7臂上。
435.图16a至16d显示，使用抗mklk5/mklk7双特异性抗体治疗的spink5缺失小鼠的皮疹及鳞屑减少。spink5 f/f cre-ert2阴性对照小鼠使用16mg/kg他莫昔芬(tamoxifen)治疗(16a)，而spink5 f/f cre-ert2 小鼠使用16mg/kg(16b)、8mg/kg(16c)、或4mg/kg(16d)他莫昔芬治疗，然后每隔一天使用2.5mg抗gp120同种型对照抗体或2.5mg抗mklk5/mklk7双特异性抗体治疗一次。于注射后6天分析背部皮肤。
436.图17a至17e显示，与同种型对照抗体治疗相比，从进行抗mklk5/mklk7双特异性抗体治疗的spink5缺失小鼠背部皮肤制备的溶解产物中的细胞因子il-8(17a)、tnf-α(17b)、il-6(17c)、il-4(17d)和g-csf(17e)减少。
437.图18显示来自使用16mg/kg他莫昔芬治疗的spink5 f/f cre-ert2阴性对照小鼠以及使用16mg/kg他莫昔芬及同种型对照抗体或抗mklk5/mklk7双特异性抗体治疗的spink5 f/f cre-ert2 小鼠的苏木精和曙红染色皮肤的代表性横截面。
438.图19a至19b显示上皮通透性，其通过使用klk5、klk7、klk5 klk7和klk5 klk7 抗klk5/klk7双特异性抗体加工的人上皮角质细胞中的跨上皮电阻(teer)测量。
439.图20a至20c显示结合klk7的抗klk7 rb.14h11c fab的晶体结构。结合klk7的完全fab示于图20a中，其中仅重叠klk7。图20b显示klk7-fab界面。图20c显示天然构象的klk7(黄色)及结合rb.14h11c fab的klk7(青蓝色)的重叠。该rb14h11c重链的部分以深蓝色显示。
具体实施方式
[0440]ⅰ.定义
[0441]“受体人框架(acceptor human framework)”为本文中的目的是如下述定义的衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架、包含轻链可变结构域(vl)框架或重链可变结构域(vh)框架的氨基酸序列的框架。“衍生自(derived from)”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列的变化。在一些方面，氨基酸变化数目为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些方面，vl受体人框架与vl人免疫球蛋白框架序列或人共同框架序列的序列相同。
[0442]“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间
的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所使用的“结合亲和力(binding affinity)”是指反映结合对成员(例如抗体及抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对于其配偶体y的亲和力通常可通过解离常数(kd)来表示。可通过本技术领域中已知的常见方法测定亲和力，包括那些本文所述的方法。下面描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性方法。
[0443]
术语“亲和力成熟”的抗体是指在一或多个互补决定区(cdr)中具有一或多种变化的抗体，与不具有此类变化的亲本抗体相比，此类变化引起该抗体对抗原的亲和力的改善。
[0444]
术语“抗klk7抗体(anti-klk7 antibody)”及“结合klk7的抗体(antibody that binds to klk7)”是指能够以足够亲和力结合klk7(例如人klk7)，从而使得该抗体可用作靶向klk7的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个方面，其中通过例如表面等离子体共振(spr)测得，抗klk7抗体对不相关的非klk7蛋白质结合的程度低于该抗体对klk7结合约10％。在某些方面，结合klk7的抗体的解离常数(kd)是≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm、或≤0.001nm(例如10-8
m或更低，例如10-8
m至10-13
m，例如10-13
至10-13
m)。当抗体的kd为1μm或更少时，称该抗体与klk7“特异性结合”。在某些方面，抗klk7抗体结合klk7的表位，其在不同物种的klk7中是保守的。
[0445]
术语“抗klk5抗体(anti-klk5 antibody)”及“结合klk5的抗体(antibody that binds to klk5)”是指能够以足够亲和力结合klk5(例如人klk5)，从而使得该抗体可用作靶向klk5的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个方面，其中通过例如表面等离子体共振(spr)测得，抗klk5抗体对不相关的非klk5蛋白质结合的程度低于该抗体对klk5结合约10％。在某些方面，结合klk5的抗体的解离常数(kd)是≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm、或≤0.001nm(例如10-8
m或更低，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
至10-13
m)。当抗体的kd为1μm或更少时，称该抗体与klk5“特异性结合”。在某些方面，抗klk5抗体结合klk5的表位，其在不同物种的klk5中是保守的。
[0446]
术语“抗klk5/klk7抗体(anti-klk5/klk7 antibody)”以及“结合klk5及klk7的抗体(antibody that binds to klk5 and klk7)”是指能够以足够亲和力结合klk7及klk5，从而使得该抗体可用作靶向klk7和/或klk5的诊断剂和/或治疗剂的多特异性抗体。在一个方面，其中通过例如表面等离子体共振(spr)测得，抗klk5/klk7抗体与不相关的非klk7/非klk5蛋白质结合的程度低于该抗体与klk7或klk5结合约10％。在某些方面，结合klk7及klk5的多特异性抗体的解离常数(kd)对于klk5及klk7中的每一个是≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm、或≤0.001nm(例如10-8
m或更小，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
至10-13
m)。当抗体的kd为1μm或更小时，称该抗体与靶标蛋白质“特异性结合”。在某些方面，抗klk5/klk7抗体结合klk7的表位，其在不同物种的klk7中是保守的。在某些方面，抗klk5/klk7抗体结合klk5的表位，其在不同物种的klk5中是保守的。
[0447]
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要它们表现出所需抗原结合活性即可。
[0448]“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含结合完整抗体所结合抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括(但不限于)fv、fab、fab'、fab
’‑
sh、f(ab')2；从抗体片段所形成的双体抗体(diabody)、线性抗体；单链抗体分子(例如scfv及scfab)；单结构域抗
体(dab)；以及多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见holliger及hudson,nature biotechnology 23:1126-1136(2005)。
[0449]
本文所用的抗体的“结合结构域(binding domain)”是指足以结合抗原的可变结构域的一部分。在一些实施例中，结合结构域包括重链(hc)cdr1、cdr2和cdr3和轻链(lc)cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施例中，结合结构域包括重链(hc)cdr1、fr2、cdr2、fr3、和cdr3和轻链(lc)cdr1、fr2、cdr2、fr3、和cdr3。
[0450]
术语“表位(epitope)”表示抗klk7抗体或抗klk5抗体与的结合的抗原上的位点，无论是蛋白性的还是非蛋白性的。表位可由连续的氨基酸延伸形成(线性表位)或由非连续的氨基酸组成(构象表位)，例如，由于抗原的折叠，即通过蛋白抗原的三级折叠而在空间上接近。线性表位通常在蛋白抗原暴露于变性剂后仍被抗体结合，而构象表位通常在变性剂加工后被破坏。在独特空间构象中，表位包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或8至10个氨基酸。
[0451]
筛选结合特定表位的抗体(即相同表位结合者)可使用本技术领域的常规方法进行，例如但不限于丙氨酸扫描、肽印迹(参见meth.mol.biol.248(2004)443-463)、肽裂解分析、表位切除、表位萃取、抗原的化学修饰(参见prot.sci.9(2000)487-496)和和交叉阻断(参见“antibodies”,harlow and lane(cold spring harbor press,cold spring harb.,ny)。
[0452]
基于抗原结构的抗体剖析(asap)，也称为修饰辅助剖析(map)，允许根据从众多化学或酶修饰的抗原表面的各抗体结合剖析，将特异性结合klk7或klk5的众多单克隆抗体进行分箱(bin)(参见例如us 2004/0101920)。每个分箱中的抗体结合相同的表位，该表位可能是独特的表位，与另一分箱所代表的表位明显不同或部分重叠。
[0453]
此外，竞争性结合可用来易于确定抗体是否结合klk7的相同表位，或竞争性结合抗klk7抗体。例如，作为参考抗klk7抗体的“结合相同表位的抗体”所指的抗体，是在竞争性测定中，分别阻断参考抗klk7抗体与其抗原结合50％或更多，反之，参考抗体在竞争性测定中阻断该抗体与其抗原结合50％或更多。又例如，为了确定抗体是否与参考抗klk7抗体结合在相同表位，让参考抗体在饱和条件下与klk7结合。在去除过量的参考抗klk7抗体后，评估有关抗klk7抗体结合klk7的能力。如果在参考抗klk7抗体饱和结合后，抗klk7抗体能够结合klk7，则可以断定该抗klk7抗体与参考抗klk7抗体结合的表位不同。但是，如果在参考抗klk7抗体饱和结合后，抗klk7抗体不能结合klk7，则该抗klk7抗体可能与参考抗klk7抗体结合的表位相同。为了确认该抗体是否与相同的表位结合，或者只是由于空间原因而阻碍了结合，可以使用常规实验(例如，使用elisa、ria、表面等离子体共振、流式细胞仪或本技术中可获得的任何其他定量或定性的抗体结合测定进行肽突变和结合分析)。此测定应分两次设置进行，即以两种抗体为饱和抗体。如果在这两种设置中，只有第一种(饱和)抗体能够结合klk7结合，则可断定该抗klk7抗体和参考抗klk7抗体竞争与klk7的结合。
[0454]
同样地，竞争性结合可用来易于确定抗体是否结合klk5的相同表位结合，或与抗klk5抗体竞争性结合。例如，作为参考抗klk5抗体的“结合相同表位的抗体”所指的抗体，是在竞争性测定中，分别阻断参考抗klk5抗体与其抗原结合50％或更多，反之，参考抗体在竞争性测定中阻断该抗体与其抗原结合50％或更多。又例如，为了确定抗体是否与参考抗klk5抗体结合在相同表位，让参考抗体在饱和条件下与klk5结合。在去除过量的参考抗
klk5抗体后，评估有关抗klk5抗体结合klk5的能力。如果在参考抗klk5抗体饱和结合后，抗klk5抗体能够结合klk5，则可以断定该抗klk5抗体与参考抗klk5抗体结合的表位不同。但是，如果在参考抗klk5抗体饱和结合后，抗klk5抗体不能结合klk5，则该抗klk5抗体可能与参考抗klk5抗体结合的表位相同。为了确认该抗体是否与相同的表位结合，或者只是由于空间原因而阻碍了结合，可以使用常规实验(例如，使用elisa、ria、表面等离子体共振、流式细胞仪或本技术中可获得的任何其他定量或定性的抗体结合测定进行肽突变和结合分析)。此测定应分两次设置进行，即以两种抗体为饱和抗体。如果在这两种设置中，只有第一种(饱和)抗体能够结合klk5结合，则可断定该抗klk5抗体和参考抗klk5抗体竞争与klk5的结合。
[0455]
在一些方面，如果一个抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍的过量抑制另一抗体的结合少50％、至少75％、至少90％或甚至99％或更多(通过竞争性结合测定测得)，则认为两个抗体结合相同或重叠的表位(参见例如junghans等人，cancer res.50(1990)1495-1502)。
[0456]
在一些方面，如果抗原中基本上所有的氨基酸突变降低或消除了一个抗体的结合，也降低或消除了另一抗体的结合，则认为两个抗体结合相同的表位。如果只有减少或消除一个抗体结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位(overlapping epitope)”。
[0457]
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
[0458]
抗体或免疫球蛋白的“类别(class)”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些中的一些可进一步分为亚类(同种型(isotype))，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。在某些方面，该抗体是igg1同种型。在某些方面，该抗体是igg1同种型，具有p329g、l234a及l235a突变以减少fc区效应子功能。在其他方面，该抗体是igg2同种型。在某些方面，该抗体是igg4同种型，在铰链区中具有s228p突变以改善igg4抗体的稳定性。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。基于其恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可被归类为两种类型中的一种，称为卡帕(κ)及兰姆达(λ)。
[0459]“效应子功能(effector function)”，是指归因于抗体的fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调；以及b细胞活化。
[0460]
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”是指在所需的施用剂量和时间段内有效实现所需的治疗或预防效果的量。
[0461]
本文的术语“fc结构域”或“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c末端区，该c末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一个方面，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的c末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子而产生的抗体可包括全长重链，或者可包括全长重链的切割变体。重链的最后两个c末端氨基酸为甘氨酸(g446)及赖氨酸(k447，根据
kabat eu索引编号)。因此，可以存在或可以不存在fc区的c末端赖氨酸(lys447)或c末端甘氨酸(gly446)及赖氨酸(lys447)。因此，“全长igg1”例如包括含有gly446和lys447、或不含lys447、或不含gly446和lys447两者的igg1。除非另有说明，否则包括fc区的重链的氨基酸序列在本文中表示不含c末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面，根据本发明所述的抗体中包含重链，该重链包括如本文所指定的fc区，其可包含gly446和lys447(根据eu索引编号)。在一个方面，根据本发明所述的抗体中包含重链，该重链包括如本文所指定的fc区，其可包含gly446(根据eu索引编号)。除非本文另有说明，否则fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据eu编号系统(也称为eu索引)进行，如kabat等人所述(sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md,1991)(另见上文)。
[0462]“框架”或“fr”是指互补决定区(cdr)之外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常由四个fr域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，cdr及fr序列通常以如下顺序出现在vh(或vl)中：fr1-cdr-h1(cdr-l1)-fr2-cdr-h2(cdr-l2)-fr3-cdr-h3(cdr-l3)-fr4。
[0463]
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有包含本文所定义的fc区的重链的抗体。
[0464]
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已向其中引入外源性核酸的细胞，包括此类细胞的子代细胞。宿主细胞包括“转化子”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞及由其衍生的子代细胞，而与传代次数无关。子代细胞的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文中包括具有与原始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变子代细胞。
[0465]“人抗体(human antibody)”为具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人体细胞产生或来源于利用抗体谱(antibody repertoire)或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0466]“人共有框架”是代表一系列人免疫球蛋白vl或vh框架序列中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列的选择来源于可变结构域序列的亚群。通常，序列的亚群是如kabat等人在sequences of proteins of immunological interest(第5版，nih publication 91-3242，bethesda md(1991)，第1-3卷)中所述的亚群。在一个方面，对于vl，亚群是如kabat等人在上述文献中所述的亚群κi。在一个方面，对于vh，亚群是如kabat等人在上述文献中所述的亚群iii。
[0467]“人源化(humanized)”抗体是指包含来自非人cdr的氨基酸残基以及来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些方面，人源化抗体将包括基本上所有或至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有cdr对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有fr对应于人抗体的那些。人源化抗体可选地可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式(humanized form)”是指已经历人源化的抗体。
[0468]
如本文所用，术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域中序列高变并决定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“cdr”)。
[0469]
一般而言，抗体包含六个cdr；三个在vh中(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)，及三个在vl中(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)。在本文中，示例性cdr包括：
[0470]
(a)存在于氨基酸残基26-32(l1)、50-52(l2)、91-96(l3)、26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)处的高变环(chothia及lesk，j.mol.biol.196:901-917(1987))；
[0471]
(b)存在于氨基酸残基24-34(l1)、50-56(l2)、89-97(l3)、31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)处的cdr(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版public health service，national institutes of health，bethesda,md(1991))；以及
[0472]
(c)存在于氨基酸残基27c-36(l1)、46-55(l2)、89-96(l3)、30-35b(h1)、47-58(h2)和93-101(h3)处的抗原接触点(maccallum等人j.mol.biol.262:732-745(1996))。
[0473]
除非另有说明，否则cdr根据kabat等人在上述文献中所述的方法来确定。本领域的技术人员将理解，也可以根据chothia在上述文献、mccallum在上述文献中所述的方法或任何其他科学上接受的命名系统来确定cdr名称。在一个方面，cdr残基包括图1至3或本说明书中其他地方所标记的cdr残基。
[0474]“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体，其包括但不限于细胞毒性剂。
[0475]“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人及非人类灵长类动物诸如猴)、兔以及囓齿动物(例如小鼠及大鼠)。在某些方面，个体或受试者为人。
[0476]“经分离的”抗体是从其自然环境的组分中分离出来的抗体。在一些实施例中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，通过(例如)电泳(例如sds-page、等电聚焦(ief)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相hplc)方法测定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如flatman等人，j.chromatogr.b 848:79-87(2007)。
[0477]
术语“连接”在两个多肽的上下文中使用时，是指作为同一氨基酸序列的一部分的多肽。两个连接的多肽可由附加氨基酸序列隔开；即，它们不必是连续的或直接彼此连接。
[0478]
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括任何包含核苷酸聚合物的化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基特别是嘌呤或嘧啶碱基(即，胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))、糖(即，脱氧核糖或核糖)及磷酸基团构成。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常由5’至3’表示。在本文中，术语核酸分子包括：脱氧核糖核酸(dna)，其包括例如互补dna(cdna)和基因组dna；核糖核酸(rna)，特别是信使rna(mrna)；dna或rna的合成形式；以及包含两个或更多个这些分子的混合聚合物。核酸分子可以是线性或环状的。另外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所述的核酸分子可包含天然存在或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括带有衍生糖、磷酸盐连接或化学修饰残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还包括适于在体外和/或体内例如在宿主或患者体内直接表达本发明的抗体的载体的dna和rna分子。此类dna(例如，cdna)或rna(例如，mrna)载体可以是未修饰的或经过修饰的。例如，mrna可经过化学修饰以增强rna载体的稳定性和/或编码分子的表达，从而将mrna注入受试者体内以产生抗体(参见例如stadler等人，nature medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或ep 2 101 823b1)。
[0479]“经分离的”核酸是指已经从其自然环境的组分中分离出来的核酸分子。经分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或与
自然染色体位置不同的染色体位置。
[0480]“经分离的编码抗klk7抗体的核酸”是指编码抗klk7抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独抗体中的此类核酸分子，并且此类核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。
[0481]“经分离的编码抗klk5抗体的核酸”是指编码抗klk5抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独抗体中的此类核酸分子，并且此类核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。
[0482]“经分离的编码抗klk5/klk7双特异性抗体的核酸”是指编码抗klk5/klk7双特异性抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独抗体中的此类核酸分子，并且此类核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。
[0483]
如本文中所使用的术语“单克隆抗体(monoclonal antibody)”，是指获自基本上同源抗体群体的抗体，即群体中包含的个别抗体是相同的和/或结合相同表位，但不包括(例如)含有天然生成的突变或产生于单克隆抗体制剂生产过程中的可能的变体抗体，此类变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对于抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆的”表示抗体的特征获自基本上同质的抗体群体，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，意欲根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制造，包括但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法和利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述此类方法以及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。
[0484]“裸抗体”是指未与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。
[0485]“天然抗体”是指具有不同结构的天然免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗体为约150,000道耳顿、由两条相同轻链及两条相同重链经二硫键键合所构成的异源四聚体糖蛋白。从n末端至c末端，每条重链具有可变结构域(vh)，亦称为重链可变结构域或重链可变区，接着是三个重链恒定结构域(ch1、ch2及ch3)。类似地，从n末端至c末端，每条轻链具有可变结构域(vl)，亦称为轻链可变结构域或轻链可变区，接着为轻链恒定(cl)域。
[0486]
术语“包装插页”用于指通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明，其中包含有关使用此类治疗性产品的适应症、用法、剂量、施用途径、联合治疗、禁忌症和/或警告等信息。
[0487]
相对于参考多肽序列所述的“百分比(％)氨基酸残基同一性”，是指候选序列中氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比，在比对序列并且引入差异后(如有必要)，可实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守性取代作为序列同一性的一部分。为确定氨基酸百分比序列同一性的目的而进行的比对可通过本领域中技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件诸如blast、blast-2、clustal w、megalign(dnastar)软件或fasta程序封装实现。本领域的技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可使用序列比较计算机程序align-2生成同一性百分比值。align-2序列比较计算机程序由genentech,inc.开发，并且其源代码已与用户文文件一起提交到u.s.copyright office,washington d.c.,20559，在那里以美国版权登记号txu510087注册，并且在wo 2001/
007611中有所描述。
[0488]
除非另有说明，否则出于本文的目的，使用fasta包36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序及blosum50比较矩阵来生成氨基酸序列同一性百分比值。fasta程序包由以下作者开发：w.r.pearson和d.j.lipman(1988)(“improved tools for biological sequence analysis”,pnas 85:2444-2448)；w.r.pearson(1996)(“effective protein sequence comparison”meth.enzymol.266:227-258)；和pearson等人(1997)(genomics 46:24-36)，并且可从以下网址公开获得：www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/tools/sss/fasta。或者，可以使用可在fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(blosum50；开放：-10；ext:-2；ktup＝2)比较序列，以确保执行全局而不是局部比对。氨基酸同一性百分比提供于输出比对标题中。
[0489]
术语“药物组合物”是指以下制剂，其形式为允许其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不含对组合物将施用于的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
[0490]“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0491]
除非另有说明，否则如本文所使用的术语“klk5”和“血浆激肽释放酶相关肽酶5”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然klk5，包括来自哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和囓齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工klk5以及通过细胞中加工产生的任何形式的klk5。该术语还涵盖天然生成的klk5变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人前药klk5蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示(uniprotkb/swiss-prot：q9y337.3)。示例性人成熟的klk5蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示，其缺少信号肽(氨基酸1-22)和原肽(氨基酸23-66)。示例性食蟹猴前药klk5蛋白的氨基酸序列如seq id no:100所示(uniprotkb：a0a2k5w0t6)。示例性食蟹猴成熟的klk5蛋白的氨基酸序列如seq id no:101所示，其缺少信号肽(氨基酸1-22)和原肽(氨基酸23-64)。
[0492]
除非另有说明，否则如本文所使用的术语“klk7”和“血浆激肽释放酶相关肽酶7”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然klk7，包括来自哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和囓齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工klk7以及通过细胞中加工产生的任何形式的klk7。该术语还涵盖天然生成的klk7变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人前药klk7蛋白的氨基酸序列如seq id no:3所示(uniprotkb/swiss-prot：p49862.1)。示例性人成熟的klk7蛋白的氨基酸序列如seq id no:4所示，其缺少信号肽(氨基酸1-22)和原肽(氨基酸23-29)。示例性食蟹猴前药klk7蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示(uniprotkb：g7pyg2)。示例性食蟹猴成熟的klk7蛋白的氨基酸序列如seq id no:6所示，其缺少信号肽(氨基酸1-21)和原肽(氨基酸22-29)。
[0493]
如本文中所使用的“治疗”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)，是指待治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。所期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
[0494]
术语“可变区(variable region)”或“可变结构域(variable domain)”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为vh和vl)的可变结构域通常具有类似的结构，且每个域均包含四个保守框架区(fr)及三个高变区(cdr)。参见例如kindt等人，kuby immunology，第6版，w.h.freeman and co.，第91页(2007)。可变结构域可包含：重链(hc)cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3，其含有或不含fr1和/或fr4的全部或一部分；和轻链(lc)cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3，其含有或不含fr1和/或fr4的全部或一部分。即，可变结构域可缺少fr1和/或fr4的一部分，只要其保留抗原结合活性即可。单个vh或vl结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用vh或vl结构域将结合特定抗原的抗体与结合该抗原的抗体分离，以分别筛选互补vl或vh结构域的文库。参见例如portolano等人，j.immunol.150:880-887(1993)；clarkson等人，nature 352:624-628(1991)。
[0495]
如本文所用，术语“载体”是指能够载运与其相链接的另一核酸的核酸分子该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入该宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地链接的核酸的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。
[0496]
ii.组合物及方法
[0497]
在一个方面，本发明部分地基于以下发现：klk5及klk7均可能在上皮屏障通透性中发挥作用。因此，同时抑制klk5及klk7可能改善治疗上皮屏障通透性过高的疾病的疗效。在某些方面，提供了结合klk5的抗体。在某些方面，提供了结合klk7的抗体。在某些方面，提供了结合klk5和klk7的多特异性抗体。本发明的抗体可用于例如诊断或治疗netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎及酒糟鼻等疾病。
[0498]
a.示例性抗klk7抗体
[0499]
在一个方面，本发明提供了结合klk7的抗体。在一个方面，提供了结合klk7的经分离的抗体。在一个方面，本发明提供了特异性结合klk7的抗体。在某些方面，抗klk7抗体抑制klk7蛋白酶活性。在一些实施例中，抗klk7抗体抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸。在一些实施例中，抗klk7抗体抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸，ic50小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm。在一些实施例中，抗klk7抗体抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸，ic50是不大于5nm、或不大于3nm、或不大于2nm、或不大于1nm。在一些实施例中，其中如通过表面等离子体共振测量，抗klk7抗体小于20pm、或小于10pm、或小于9pm、或小于8pm、或小于7pm、或小于6pm、或小于5pm、或小于3pm、或小于2pm或小于1pm的kd结合人klk7。在一些实施例中，其中如通过表面等离子体共振测量，抗klk7抗体不大于20pm、不大于10pm、或不大于9pm、或不大于8pm、或不大于7pm、或不大于6pm、或不大于5pm、或不大于3pm、或不大于2pm或不大于1pm的kd结合人klk7。
[0500]
在一些实施例中，抗klk7抗体结合klk7的氨基酸r71-n82、k152-s158和/或q211-k222内的表位，其中这些氨基酸根据seq id no:4编号。在一些实施例中，抗klk7抗体与klk7的氨基酸r71-n82中的至少一个氨基酸接触，与氨基酸k152-s158中的至少一个氨基酸接触，并且与氨基酸q211-k222中的至少一个氨基酸接触，其根据seq id no:4编号。在一些实施例中，抗klk7抗体结合包含klk7的氨基酸h72、p73、g74、s76、q78、n82、n157、k211和/或t213中的一者或多者的表位，其根据seq id no:4编号。在一些实施例中，抗klk7抗体结合
包含klk7的氨基酸h91、p92、g93、s95、q97、n101、n178、k233和/或t235中的一者或多者的表位，通过胰凝乳蛋白酶编号。在一些实施例中，抗klk7抗体结合包含klk7的氨基酸h72、p73、g74、s76、q78、n82、n157、k211和/或t213的表位，其根据seq id no:4编号。在一些实施例中，抗klk7抗体结合包含klk7的氨基酸h91、p92、g93、s95、q97、n101、n178、k233和/或t235的表位，通过胰凝乳蛋白酶编号。
[0501]
在一些实施例中，当结合人klk7时，抗klk7抗体导致人klk7的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk7的底物结合位点和/或活性位点的破坏。
[0502]
在一些实施例中，抗klk7抗体不结合klk5。在一些实施例中，抗klk7抗体不结合klk1、klk4、klk5、klk11和klk14。在一些实施例中，抗klk7抗体结合人klk7和食蟹猴klk7。
[0503]
在一方面，本发明提供了一种抗klk7抗体，该抗体包含选自以下项的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或全部六个cdr：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。
[0504]
在一个方面，本发明提供了一种抗体，该抗体包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个vh cdr序列：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9。在一个方面，该抗体包含cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9。在另一方面，该抗体包含：cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；和cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。在又一方面，该抗体包含：cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9,cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；和cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8。在又一方面，该抗体包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9。
[0505]
在另一方面，本发明提供了一种抗体，该抗体包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个vl cdr序列：(a)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(b)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(c)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。在一个方面，该抗体包含(a)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(b)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(c)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。
[0506]
在另一方面，本发明的抗体包含：(a)vh结构域，该vh结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个vh cdr序列：(i)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(ii)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；和(iii)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；和(b)vl结构域，该vl结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个vl cdr序列：(i)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(ii)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(c)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。
[0507]
在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。
[0508]
在本文提供的任一方面，抗klk7抗体为人源化抗体。在一个方面，抗klk7抗体进一
id no:147-150具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:147-150具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:147-150具有至少98％的序列同一性。
[0518]
在另一方面，抗klk7抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:152-154具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:152-154具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:152-154具有至少98％的序列同一性。
[0519]
在另一方面，抗klk7抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:156-158具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:156-158具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:156-158具有至少98％的序列同一性。
[0520]
在另一方面，抗klk7抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr4，该lc-fr4与seq id no:160具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:160具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:160具有至少98％的序列同一性。
[0521]
在另一方面，抗klk7抗体包含vh的一个或多个cdr序列，其选自seq id no:13和15-30。在另一个实施例中，抗klk7抗体包含vl的一个或多个cdr序列，其选自seq id no:14和31-38。在另一个实施例中，抗klk7抗体包含：vh的一个或多个cdr序列，其选自seq id no:13和15-30，以及vl的cdr序列，其选自seq id no:14和31-38。
[0522]
在又一方面，抗klk7抗体包含：vh的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3氨基酸序列，其选自seq id no:13和15-30；以及vl的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3氨基酸序列，其选自seq id no:14和31-38。
[0523]
在一个方面，抗klk7抗体包含：vh的一个或多个重链cdr氨基酸序列，其选自：seq id no:13和15-30；和框架，该框架与选自seq id no:13和15-30的vh的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk7抗体包含：vh的三个重链cdr氨基酸序列，其选自：seq id no:13和15-30；和框架，该框架与选自seq id no:13和15-30的vh的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk7抗体包含：vh的三个重链cdr氨基酸序列，其选自：seq id no:13和15-30；和框架，该框架与选自seq id no:13和15-30的vh的框架氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在另一方面，抗klk7抗体包含：vh的三个重链cdr氨基酸序列，其选自：seq id no:13和15-30；和框架，该框架与选自seq id no:13和15-30的vh的框架氨基酸序列具有至少98％的序列同一性。
[0524]
在一个方面，抗klk7抗体包含：vl的一个或多个轻链cdr氨基酸序列，其选自：seq id no:14和31-38；和框架，该框架与选自seq id no:14和31-38的vl的框架氨基酸序列具
有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk7抗体包含：vl的三个轻链cdr氨基酸序列，其选自：seq id no:14和31-38；和框架，该框架与选自seq id no:14和31-38的vl的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk7抗体包含：vl的三个轻链cdr氨基酸序列，其选自：seq id no:14和31-38；和框架，该框架与选自seq id no:14和31-38的vl的框架氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在另一方面，抗klk7抗体包含：vl的三个vl cdr氨基酸序列，其选自：seq id no:14和31-38；和框架，该框架特别地与选自seq id no:14和31-38的vl的框架氨基酸序列具有至少98％的序列同一性。
[0525]
在一个方面，抗klk7抗体包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:14和31-38的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一个方面，vh结构域与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，vl结构域与选自seq id no:14和31-38的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
[0526]
在一个方面，抗klk7抗体包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:14和31-38的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；其中该抗体特异性结合klk7。在一个方面，vh结构域与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，vl结构域与选自seq id no:14和31-38的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，其中如通过表面等离子体共振测量，抗体以小于10pm、或小于9pm、或小于8pm、或小于7pm、或小于6pm或小于5pm的解离常数(kd)结合klk7。在一个方面，其中如通过表面等离子体共振测量，抗体以不大于10pm、或不大于9pm、或不大于8pm、或不大于7pm、或不大于6pm或不大于5pm的解离常数(kd)结合klk7。
[0527]
在另一方面，抗klk7抗体包含重链可变结构域(vh)序列，该vh序列与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一方面，抗klk7抗体包含重链可变结构域(vh)序列，该vh序列与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在某些方面，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的vh序列包含相对于参考序列的取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗klk7抗体
amc的裂解，其ic50小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm。在一些实施例中，抗klk5抗体抑制人klk5介导的底物boc-val-pro-arg-amc的裂解，其ic50是不大于5nm、或不大于3nm、或不大于2nm、或不大于1nm。在一些实施例中，其中如通过表面等离子体共振测量，抗klk5抗体以小于60pm、或小于30pm、或小于20pm、或小于10pm或小于5pm的kd结合klk5。在一些实施例中，其中如通过表面等离子体共振测量，抗klk5抗体以不大于60pm、不大于30pm、不大于20pm、不大于10pm或不大于5pm的kd结合klk5。
[0535]
在一些实施例中，当结合人klk5时，抗klk5抗体导致人klk5的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk5的底物结合位点和/或活性位点的破坏。
[0536]
在一些实施例中，抗klk5抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、gly133、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177、asp178、gly184、asp185、lys186、ala186a、arg188、asn223、arg224、pro225、和lys233，其根据标准蛋白酶编号(p113、s114、a115、g116、v145、l146、s147、q148、k149、r150、e152、d153、a154、y155、p156、r157、q158、i159、d160、d161、g167、d168、k169、a170、r172、n204、r205、p206、和k214，用seq id no:2顺序编号)。参见例如pct公开号wo 2019/178316 a1。在一些实施例中，抗klk5抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自由以下项组成的组的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177、asp178、arg224和lys233，其根据标准蛋白酶编号。在一些实施例中，抗klk5抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：pro130、ser131、ala132、gly133、val162、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、tyr172、pro173、arg174、gln174a、ile176、asp177和lys233，其根据标准蛋白酶编号。在一些实施例中，抗klk5抗体与人klk5上的表位结合，所述表位包括选自以下项的一个或多个氨基酸残基：ser131、ala132、gly133、leu163、ser164、gln165、lys166、arg167、glu169、asp170、ala171、pro173、arg174、gly184、asp185、lys186、ala186a、arg188、asn223、arg224和pro225，其根据标准蛋白酶编号。
[0537]
在一些实施例中，抗klk5抗体不结合klk7。在一些实施例中，抗klk5抗体不结合klk1、klk4、klk7、klk11或klk14。在一些实施例中，抗klk5抗体结合人klk5和食蟹猴klk5。
[0538]
抗体hu.10c5-h28l5及变体
[0539]
在一个方面，本发明提供了一种抗klk5抗体，该抗体包含选自以下项的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或全部六个cdr：(a)cdr-h1其包含氨基酸序列seq id no:39和107；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:40和41；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43和44；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:46-49。
[0540]
在一个方面，本发明提供了一种抗体，该抗体包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个vh cdr序列：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42。在又一方面，该抗体包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42。
no:161具有至少98％的序列同一性。
[0550]
在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含hc-fr2，该hc-fr2与seq id no:162-163具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vh结构域包含hc-fr2，该hc-fr2与seq id no:162-163具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vh结构域包含hc-fr2，该hc-fr2与seq id no:162-163具有至少98％的序列同一性。
[0551]
在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含hc-fr3，该hc-fr3与seq id no:164具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vh结构域包含hc-fr3，该hc-fr3与seq id no:164具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vh结构域包含hc-fr3，该hc-fr3与seq id no:164具有至少98％的序列同一性。
[0552]
在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含hc-fr4，该hc-fr4与seq id no:165具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vh结构域包含hc-fr4，该hc-fr4与seq id no:165具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vh结构域包含hc-fr4，该hc-fr4与seq id no:165具有至少98％的序列同一性。
[0553]
在一个方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含选自以下项的一个或多个轻链框架序列：(a)seq id no:166的轻链框架区1(lc-fr1)；(b)seq id no:167-168的轻链框架区2(lc-fr2)；(c)seq id no:169的轻链框架区3(lc-fr3)；以及(d)seq id no:170的轻链框架区4(lc-fr4)。
[0554]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含seq id no:166的lc-fr1。在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含seq id no:167-168的lc-fr2。在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含seq id no:169的lc-fr3。在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含seq id no:170的lc-fr4。
[0555]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:166具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:166具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:166具有至少98％的序列同一性。
[0556]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:167-168具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:167-168具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:167-168具有至少98％的序列同一性。
[0557]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:169具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:169具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:169具有至少98％的序列同一性。
[0558]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr4，该lc-fr4与seq id no:170具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr4，该lc-fr4与seq id no:170具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr4，该lc-fr4与seq id no:170具有至少98％的序列同一性。
[0559]
在另一方面，抗klk5抗体包含seq id no:50、52、53、105或106的vh的一个或多个cdr序列。在另一个实施例中，抗klk5抗体包含seq id no:51或54-57的vl的一个或多个cdr序列。在另一个实施例中，抗klk5抗体包含seq id no:50、52、53、105或106的vh的cdr序列以及seq id no:51或54-57的vl的cdr序列。
[0560]
在又一方面，抗klk5抗体包含seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3氨基酸序列以及seq id no:51或54-57的vl结构域的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3氨基酸序列。
[0561]
在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的一个或多个重链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的三个重链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的三个重链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在另一方面，抗klk5抗体包含：seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的三个重链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:50、52、53、105或106的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少98％的序列同一性。
[0562]
在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:51或54-57的vl结构域的一个或多个轻链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:51或54-57的vl结构域的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:51或54-57的vl结构域的三个轻链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:51或54-57的vl结构域的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:51或54-57的vl结构域的三个轻链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:51或54-57的vl结构域的框架氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在另一方面，抗klk5抗体包含：seq id no:51或54-57的vl结构域的三个轻链cdr氨基酸序列；和框架，该框架特别地与seq id no:50、52、53、105及106的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少98％的序列同一性。
[0563]
在一个方面，抗klk5抗体包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39或107；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:40或41；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43或44；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:46-49；和vh结构域，该vh结
构域与seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与seq id no:51和54-67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一个方面，vh结构域与seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，vl结构域与seq id no:51和54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
[0564]
在一个方面，抗klk5抗体包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39或107；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:40或41；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43或44；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:46-49；和vh结构域，该vh结构域与seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与seq id no:51和54-67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；其中抗体特异性地结合klk5。在一个方面，vh结构域与seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，vl结构域与seq id no:51和54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，该抗体结合klk5的解离常数(kd)相比于包含seq id no:50、52、53、105和106的vh序列和seq id no:51和54-67的vl序列的抗体的解离常数(kd)减少多达10倍或增加多达10倍。
[0565]
在另一方面，抗klk5抗体包含重链可变结构域(vh)序列，该vh序列与seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含重链可变结构域(vh)序列，该vh序列与seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在某些方面，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的vh序列包含相对于参考序列的取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗klk5抗体保留结合klk5的能力。在某些方面，在seq id no:50、52、53、105和106中，共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在cdr以外的区域(即，在fr中)。可选地，抗klk5抗体包含seq id no:50、52、53、105和106中的vh序列，其包括该序列的翻译后修饰。在一个特定方面，vh包含选自以下项的一个、两个或三个cdr：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39或107；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:40或41；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42。在另一方面，提供了一种抗klk5抗体，该抗体包含轻链可变结构域(vl)序列，该vl序列与seq id no:51和54-67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一方面，抗klk5抗体包含轻链可变结构域(vl)序列，该vl序列与seq id no:51和54-67的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在某些方面，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的vl序列包含相对于参考序列的取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗klk5抗体保留结合klk5的能力。在某些方面，在seq id no:51和54-67中，共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在cdr以外的区域(即，在fr中)。可选地，抗klk5抗体包含seq id no:51或54-67中的vl序列，其包括该序列的翻译后修饰。在一个特定方面，vl包含选自以下项的
id no:74；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:76。
[0576]
在本文提供的任一方面，抗klk5抗体为人源化抗体。在一个方面，抗klk5抗体进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
[0577]
在一个方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含选自以下项的一个或多个重链框架序列：(a)seq id no:171的重链框架区1(hc-fr1)；(b)seq id no:172-173的重链框架区2(hc-fr2)；(c)seq id no:174的重链框架区3(hc-fr3)；以及(d)seq id no:175的重链框架区4(hc-fr4)。
[0578]
在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含seq id no:171的hc-fr1。在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含seq id no:172或173的hc-fr2。在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含seq id no:174的hc-fr3。在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含seq id no:175的hc-fr4。
[0579]
在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含hc-fr1，该hc-fr1与seq id no:171具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vh结构域包含hc-fr1，该hc-fr1与seq id no:171具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vh结构域包含hc-fr1，该hc-fr1与seq id no:171具有至少98％的序列同一性。
[0580]
在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含hc-fr2，该hc-fr2与seq id no:172或173具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vh结构域包含hc-fr2，该hc-fr2与seq id no:172或173具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vh结构域包含hc-fr2，该hc-fr2与seq id no:172或173具有至少98％的序列同一性。
[0581]
在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含hc-fr3，该hc-fr3与seq id no:174具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vh结构域包含hc-fr3，该hc-fr3与seq id no:174具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vh结构域包含hc-fr3，该hc-fr3与seq id no:174具有至少98％的序列同一性。
[0582]
在另一方面，抗klk5抗体包含vh结构域，该vh结构域包含hc-fr4，该hc-fr4与seq id no:175具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vh结构域包含hc-fr4，该hc-fr4与seq id no:175具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vh结构域包含hc-fr4，该hc-fr4与seq id no:175具有至少98％的序列同一性。
[0583]
在一个方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含选自以下项的一个或多个轻链框架序列：(a)seq id no:176的轻链框架区1(lc-fr1)；(b)seq id no:177-178的轻链框架区2(lc-fr2)；(c)seq id no:179的轻链框架区3(lc-fr3)；以及(d)seq id no:180的轻链框架区4(lc-fr4)。
[0584]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含seq id no:176的lc-fr1。在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含seq id no:177-178的lc-fr2。在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含seq id no:179的lc-fr3。在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含seq id no:180的lc-fr4。
[0585]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:176具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:176具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:176具有至少98％的序列同一性。
[0586]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:177或178具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:177或178具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr2，该lc-fr2与seq id no:177或178具有至少98％的序列同一性。
[0587]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:179具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:179具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr3，该lc-fr3与seq id no:179具有至少98％的序列同一性。
[0588]
在另一方面，抗klk5抗体包含vl结构域，该vl结构域包含lc-fr4，该lc-fr4与seq id no:180具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:180具有至少95％的序列同一性。在另一方面，vl结构域包含lc-fr1，该lc-fr1与seq id no:180具有至少98％的序列同一性。
[0589]
在另一方面，抗klk5抗体包含seq id no:79或81-87的vh的一个或多个cdr序列。在另一个实施例中，抗klk5抗体包含seq id no:80或88-94的vl的一个或多个cdr序列。在另一个实施例中，抗klk5抗体包含seq id no:79或81-87的vh的cdr序列以及seq id no:80或88-94的vl的cdr序列。
[0590]
在又一方面，抗klk5抗体包含seq id no:79或81-87的vh结构域的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3氨基酸序列以及seq id no:80或88-94的vl结构域的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3氨基酸序列。
[0591]
在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:79或81-87的vh结构域的一个或多个重链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:79或81-87的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:79或81-87的vh结构域的三个重链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:79或81-87的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:79或81-87的vh结构域的三个重链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:79或81-87的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在另一方面，抗klk5抗体包含：seq id no:79或81-87的vh结构域的三个重链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:79或81-87的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少98％的序列同一性。
[0592]
在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:80或88-94的vl结构域的一个或多个轻
链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:80或88-94的vl结构域的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:80或88-94的vl结构域的三个轻链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:80或88-94的vl结构域的框架氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，抗klk5抗体包含：seq id no:80或88-94的vl结构域的三个轻链cdr氨基酸序列；和框架，该框架与seq id no:80或88-94的vl结构域的框架氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在另一方面，抗klk5抗体包含：seq id no:80或88-94的vl结构域的三个轻链cdr氨基酸序列；和框架，该框架特别地与seq id no:80或88-94的vh结构域的框架氨基酸序列具有至少98％的序列同一性。
[0593]
在一个方面，抗klk5抗体包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:69-70；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:71-72；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:75-78；和vh结构域，该vh结构域与seq id no:79或81-87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与seq id no:80或88-94的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一个方面，vh结构域与seq id no:79或81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，vl结构域与seq id no:80或88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
[0594]
在一个方面，抗klk5抗体包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:69-70；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:71-72；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:75-78；和vh结构域，该vh结构域与seq id no:79或81-87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与seq id no:80或88-94的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；其中抗体特异性地结合klk5。在一个方面，vh结构域与seq id no:79或81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，vl结构域与seq id no:80或88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在一个方面，该抗体结合klk5的解离常数(kd)相比于包含seq id no:79或81-87的vh序列和seq id no:80或88-94的vl序列的抗体的解离常数(kd)减少多达10倍或增加多达10倍。
[0595]
在另一方面，抗klk5抗体包含重链可变结构域(vh)序列，该vh序列与seq id no:79或81-87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一方面，抗klk5抗体包含重链可变结构域(vh)序列，该vh序列与seq id no:79或81-87的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在某些方面，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的vh序列包含相对于参考序列的取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗klk5抗体保留结合klk5的能力。在某些方面，在seq id no:79或81-87中，共有1至10个氨基酸被取代、插
入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在cdr以外的区域(即，在fr中)。可选地，抗klk5抗体包含seq id no:79或81-87中的vh序列，其包括该序列的翻译后修饰。在一个特定方面，vh包含选自以下项的一个、两个或三个cdr：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:69-70；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:71-72。在另一方面，提供了一种抗klk5抗体，该抗体包含轻链可变结构域(vl)序列，该vl序列与seq id no:80或88-94的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一方面，抗klk5抗体包含轻链可变结构域(vl)序列，该vl序列与seq id no:80或88-94的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。在某些方面，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的vl序列包含相对于参考序列的取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗klk5抗体保留结合klk5的能力。在某些方面，在seq id no:80或88-94中，共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在cdr以外的区域(即，在fr中)。可选地，抗klk5抗体包含seq id no:80或88-94中的vl序列，其包括该序列的翻译后修饰。在一个特定方面，vl包含选自以下项的一个、两个或三个cdr：(a)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73；(b)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74；和(c)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:75-78。
[0596]
在另一方面，提供了一种抗klk5抗体，该抗体包含上文提供的任一方面的vh序列以及上文提供的任一方面的vl序列。在一个方面，该抗体包含分别为seq id no:79或81-87和seq id no:80或88-94的vh和vl序列，其包括那些序列的翻译后修饰。
[0597]
在又一方面，本发明提供了一种与本文提供的抗klk5抗体结合同一表位的抗体。例如，在某些方面，提供了一种与本文提供的抗klk5抗体结合同一表位的抗体，其包含seq id no:79或81-87的vh序列和seq id no:80或88-94的vl序列。
[0598]
在本发明的又一方面，根据以上方面的任一项所述的抗klk5抗体为单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个方面，抗klk5抗体为抗体片段，例如fv、fab、fab’、scfv、双体抗体或f(ab’)2片段。在另一方面，抗体为全长抗体，例如本文所定义的完整igg1抗体或其他抗体类别或同种型。
[0599]
在另一方面，如以下1-8部分所述，根据以上方面的任一项所述的抗klk5抗体可单独或组合地结合任何特征。
[0600]
c.示例性抗klk5/klk7多特异性抗体
[0601]
在一个方面，本发明提供了同时结合klk5和klk7的多特异性抗体。在一些实施例中，提供了同时结合klk5和klk7的双特异性抗体。在一些实施例中，多特异性(诸如双特异性)抗体同时抑制klk5蛋白酶活性和klk7蛋白酶活性。在一些实施例中，其中如通过表面等离子体共振测量，多特异性(诸如双特异性)抗体以小于60pm、或小于30pm、或小于20pm、或小于10pm或小于5pm的kd结合klk5。在一些实施例中，其中如通过表面等离子体共振测量，多特异性(诸如双特异性)抗体以小于20pm、或小于10pm、或小于9pm、或小于8pm、或小于7pm、或小于6pm、或小于5pm、或小于3pm、或小于2pm或小于1pm的kd结合klk7。在一些实施例中，其中如通过表面等离子体共振测量，多特异性(诸如双特异性)抗体以不大于60pm、不大于30pm、不大于20pm、不大于10pm或不大于5pm的kd结合klk5。在一些实施例中，其中如通过表面等离子体共振测量，多特异性(诸如双特异性)抗体以不大于20pm、不大于10pm、或不大
于9pm、或不大于8pm、或不大于7pm、或不大于6pm、或不大于5pm、或不大于3pm、或不大于2pm或不大于1pm的kd结合klk7。
[0602]
在一些实施例中，抗klk5/klk7多特异性抗体抑制人klk7蛋白酶活性并且抑制人klk5蛋白酶活性。在一些实施例中，抗klk5/klk7多特异性抗体抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸，ic50小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm。在一些实施例中，抗klk5/klk7多特异性抗体抑制人klk5介导的底物boc-val-pro-arg-amc的裂解，其ic50小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm。在一些实施例中，抗klk5/klk7多特异性抗体抑制人klk7介导的包含氨基酸序列rpkpve-nval-wrk(seq id no:121)的底物的裂解，其中nval为正缬氨酸，ic50是不大于5nm、或不大于3nm、或不大于2nm、或不大于1nm。在一些实施例中，抗klk5/klk7多特异性抗体抑制人klk5介导的底物boc-val-pro-arg-amc的裂解，其ic50是不大于5nm、或不大于3nm、或不大于2nm、或不大于1nm。在一些实施例中，人klk5的多特异性抗体的kd及人klk7的抗体的kd是彼此的3倍以内、或2.5倍以内、或2倍以内、或1.5倍以内。
[0603]
在一些方面，同时结合klk5和klk7的多特异性抗体包含结合klk7的第一结合结构域及结合klk5的第二结合结构域。
[0604]
在一些实施例中，当结合人klk5时，结合klk5及klk7两者的多特异性抗体导致人klk5的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk5的底物结合位点和/或活性位点的破坏。在一些实施例中，当结合人klk5时，结合klk7及klk7两者的多特异性抗体导致人klk7的构象变化，其中该构象变化别构地导致人klk7的底物结合位点和/或活性位点的破坏。
[0605]
在一些实施例中，第一结合结构域包括如本文所述的抗klk7抗体结合结构域。例如，在一些此类实施例中，第一结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12。作为又一个非限制性实例，在一些实施例中，第一结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:14和31-38的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，第一结合结构域包含分别为seq id no:29和seq id no:32的vh和vl序列，其包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施例中，第一结合结构域包含分别为seq id no:30和seq id no:38的vh和vl序列，其包括那些序列的翻译后修饰。
[0606]
在一些实施例中，第二结合结构域包括如本文所述的抗klk5抗体结合结构域。例如，在一些此类实施例中，第二结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39和107的氨基酸序列；(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40和41的氨基酸序列；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42；和轻链可变结构域(vl)，该vl包含：(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43和44的氨基酸序列；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45，和(f)
cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列。作为又一个非限制性实例，在一些实施例中，第二结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39和107的氨基酸序列；(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40和41的氨基酸序列；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42；和轻链可变结构域(vl)，该vl包含：(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43和44的氨基酸序列；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45，和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:51和54-67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，第二结合结构域包含分别为seq id no:52和seq id no:55的vh和vl序列，其包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施例中，第二结合结构域包含分别为seq id no:53和seq id no:62的vh和vl序列，其包括那些序列的翻译后修饰。
[0607]
在一些实施例中，第二结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68；(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69和70的氨基酸序列；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:71和72；和轻链可变结构域(vl)，该vl包含：(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74，和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列。作为又一个非限制性实例，在一些实施例中，第二结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68；(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69和70的氨基酸序列；和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71和72的氨基酸序列；和轻链可变结构域(vl)，该vl包含：(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74，和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列；和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:79和81-87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:80和88-94的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，第二结合结构域包含分别为seq id no:83和seq id no:88的vh和vl序列，其包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施例中，第二结合结构域包含分别为seq id no:87和seq id no:92的vh和vl序列，其包括那些序列的翻译后修饰。
[0608]
在一些实施例中，提供了一种多特异性抗体(诸如双特异性抗体)，其中第一结合结构域结合klk7并且第二结合结构域结合klk5，其中第一结合结构域为本文所提供的抗klk7抗体结合结构域，并且第二结合结构域为本文所提供的抗klk5结合结构域。在一些此类实施例中，第一结合结构域
[0609]
在一些实施例中，第一结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；并且第二结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39和107的氨基酸序列；(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40和41的氨基酸序列；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42；和轻链可变结构域(vl)，其包含：(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43和44的氨基酸序列；(e)cdr-l2，其包含氨基
酸序列seq id no:45；和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列。在一些实施例中，第一结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；并且第二结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68；(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69和70的氨基酸序列；和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71和72的氨基酸序列；和轻链可变结构域(vl)，其包含：(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74；和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列。
[0610]
在一些实施例中，第一结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:14和31-38的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；并且第二结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含选自seq id no:39和107的氨基酸序列；(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:40和41的氨基酸序列；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42；和轻链可变结构域(vl)，其包含：(d)cdr-l1，其包含选自seq id no:43和44的氨基酸序列；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45；和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:46-49的氨基酸序列；和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:50、52、53、105和106的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:51和54-67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0611]
在一些实施例中，第一结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:13和15-30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:14和31-38的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；并且第二结合结构域包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68；(b)cdr-h2，其包含选自seq id no:69和70的氨基酸序列；和(c)cdr-h3，其包含选自seq id no:71和72的氨基酸序列；和轻链可变结构域(vl)，其包含：(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74；和(f)cdr-l3，其包含选自seq id no:75-78的氨基酸序列，和vh结构域，该vh结构域与选自seq id no:79和81-87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和vl结构域，该vl结构域与选自seq id no:80和88-94的氨基酸序列具有至少
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0612]
在一些实施例中，双特异性抗klk5/klk7抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合人klk7并且第二结合结构域结合人klk5，其中第一结合结构域包含重链可变结构域(vh)，该vh包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；和轻链可变结构域(vl)，该vl包含：(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；并且第二结合结构域包含重链可变结构域(vh)，该vh包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:39；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:41；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:42；和轻链可变结构域(vl)，该vl包含：(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:43；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:45；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:47。
[0613]
在一些实施例中，双特异性抗klk5/klk7抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合人klk7并且第二结合结构域结合人klk5，其中第一结合结构域包含重链可变结构域(vh)，该vh包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:7；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:8；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:9；和轻链可变结构域(vl)，该vl包含：(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:10；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:11；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:12；并且第二结合结构域包含重链可变结构域(vh)，该vh包含：(a)cdr-h1，其包含氨基酸序列seq id no:68；(b)cdr-h2，其包含氨基酸序列seq id no:70；和(c)cdr-h3，其包含氨基酸序列seq id no:72；和轻链可变结构域(vl)，该vl包含：(d)cdr-l1，其包含氨基酸序列seq id no:73；(e)cdr-l2，其包含氨基酸序列seq id no:74；和(f)cdr-l3，其包含氨基酸序列seq id no:76。
[0614]
在一些实施例中，双特异性抗klk5/klk7抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合人klk7并且第二结合结构域结合人klk5，其中(i)第一结合结构域包含seq id no:29的vh氨基酸序列和seq id no:32的vl氨基酸序列，或seq id no:30的vh氨基酸序列和seq id no:38的vl氨基酸序列；并且(ii)第二结合结构域包含seq id no:52的vh序列和seq id no:55的vl氨基酸序列，或seq id no:53的vh序列和seq id no:62的vl氨基酸序列。在一些实施例中，第一结合结构域包含seq id no:30的vh序列和seq id no:38的vl序列，并且第二结合结构域包含seq id no:53的vh序列和seq id no:62的vl序列。
[0615]
在一些实施例中，双特异性抗klk5/klk7抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合人klk7并且第二结合结构域结合人klk5，其中(i)第一结合结构域包含seq id no:29的vh氨基酸序列和seq id no:32的vl氨基酸序列，或seq id no:30的vh氨基酸序列和seq id no:38的vl氨基酸序列；并且(ii)第二结合结构域包含seq id no:83的vh序列和seq id no:88的vl氨基酸序列，或seq id no:87的vh序列和seq id no:92的vl氨基酸序列。在一些实施例中，第一结合结构域包含seq id no:30的vh序列和seq id no:38的vl序列，并且第二结合结构域包含seq id no:87的vh序列和seq id no:92的vl序列。
[0616]
在一些实施例中，双特异性抗klk5/klk7抗体包含结合klk7的第一结合结构域及结合klk5的第二结合结构域，其中第一结合结构域包含第一重链可变区和第一轻链可变区，并且第二结合结构域包含第二重链可变区和第二轻链可变区。在一些此类实施例中，第一重链可变区包含q39e取代(kabat编号)并且第一轻链可变区包含q38k取代(kabat编号)；第二重链可变区包含q39k取代(kabat编号)并且第二轻链可变区包含q38e取代(kabat编号)。在一些实施例中，第一重链可变区包含q39k取代(kabat编号)并且第一轻链可变区包含q38e取代(kabat编号)；第二重链可变区包含q39e取代(kabat编号)并且第二轻链可变区包含q38k取代(kabat编号)。在一些实施例中，q39e/q38k及q39k/q38e取代减少了双特异性抗体的重链与轻链的错配。
[0617]
在一些实施例中，第一结合结构域包含与第一重链恒定区连接的第一重链可变结构域及与第一轻链恒定区连接的第一轻链可变结构域；并且第二结合结构域包含与第二重链恒定区连接的第二重链可变结构域及与第二轻链恒定区连接的第二轻链可变结构域。在一些此类实施例中，第一重链恒定区包含s183k取代(eu编号)并且第一轻链恒定区包含v133e取代(eu编号)，第二重链恒定区包含s183e取代(eu编号)并且第二轻链恒定区包含v133k取代(eu编号)。在一些实施例中，第一重链恒定区包含s183e取代(eu编号)并且第一轻链恒定区包含v133k取代(eu编号)，第二重链恒定区包含s183k取代(eu编号)并且第二轻链恒定区包含v133e取代(eu编号)。在一些实施例中，s183k/v133e及s183e/v133k取代减少了双特异性抗体的重链与轻链的错配。
[0618]
在一些实施例中，双特异性抗klk5/klk7抗体包含结合结构域中的q39e/q38k和q39k/q38e取代及恒定区中的s183k/v133e和s183e/v133k取代。参见例如wo 2016/172485，其通过引用以其全文并出于所有目的并入本文。双特异性抗体的一种非限制性示例性示意图如图15所示。
[0619]
在一些实施例中，提供了一种双特异性抗klk5/klk7抗体，其中该双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合人klk7并且第二结合结构域结合人klk5，其中第一结合结构域包含seq id no:108或192的重链氨基酸序列以及seq id no:109的轻链氨基酸序列，并且第二结合结构域包含seq id no:110或193的重链氨基酸序列以及seq id no:111的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，提供了一种双特异性抗klk5/klk7抗体，其中该双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合人klk7并且第二结合结构域结合人klk5，其中第一结合结构域包含seq id no:112或194的重链氨基酸序列以及seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且第二结合结构域包含seq id no:114或195的重链氨基酸序列以及seq id no:115的轻链氨基酸序列。
[0620]
在一些实施例中，提供了一种双特异性抗klk5/klk7抗体，其中该双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合人klk7并且第二结合结构域结合人klk5，其中第一结合结构域包含seq id no:108或192的重链氨基酸序列以及seq id no:109的轻链氨基酸序列，并且第二结合结构域包含seq id no:114或195的重链氨基酸序列以及seq id no:111的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，提供了一种双特异性抗klk5/klk7抗体，其中该双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合人klk7并且第二结合结构域结合人klk5，其中第一结合结构域包含seq id no:112或194的重链氨基酸序列以及seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且第二结合结构
域包含seq id no:110或193的重链氨基酸序列以及seq id no:115的轻链氨基酸序列。
[0621]
在一些实施例中，提供了双特异性抗klk5/klk7抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与人klk7结合并且所述第二结合结构域与人klk5结合，其中所述第一结合结构域包含seq id no:194的重链氨基酸序列和seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且所述第二结合结构域包含seq id no:195的重链氨基酸序列和seq id no:115的轻链氨基酸序列。
[0622]
在一些实施例中，提供了双特异性抗klk5/klk7抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与人klk7结合并且所述第二结合结构域与人klk5结合，其中所述第一结合结构域包含seq id no:112的重链氨基酸序列和seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且所述第二结合结构域包含seq id no:195的重链氨基酸序列和seq id no:115的轻链氨基酸序列。
[0623]
在一些实施例中，提供了双特异性抗klk5/klk7抗体，其中所述双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与人klk7结合并且所述第二结合结构域与人klk5结合，其中所述第一结合结构域包含seq id no:194的重链氨基酸序列和seq id no:113的轻链氨基酸序列，并且所述第二结合结构域包含seq id no:114的重链氨基酸序列和seq id no:115的轻链氨基酸序列。
[0624]
在另一方面，如以下1-8部分所述，根据以上任一实施例所述的抗体可单独或组合地结合任何特征。
[0625]
1.抗体亲和力
[0626]
在某些方面，本文提供的抗体具有的解离常数(kd)是≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm、或≤0.001nm(例如10-8
m或更小，例如10-8
m的10-13
m，例如10-9
m的10-13
m)。
[0627]
在一个方面，kd使用表面等离子体共振来测量。在一个方面，kd使用表面等离子体共振测定诸如biacore
tm
t200或biacore
tm
8k测定来测量。例如，使用biacore
tm
8k(biacore,inc.，piscataway，nj)的测定在25℃或37℃下执行，其中固定化抗体以约300响应单位(ru)存在于protein a芯片上。在37℃下，将抗原(例如人klk7或人klk5)的十倍连续稀释液以100l/min的流速注入hbs-p缓冲剂中。可替代地，在25℃下，将抗原的十倍连续稀释液以30μl/min的流速注入hbs-p缓冲剂中。缔合速率(ka)和解离速率(kd)使用1:1langmuir结合模型进行计算(例如，使用biacore insight评估软件2.0版)。解离常数(kd)通过比率kd/ka计算得出。
[0628]
在另一种方法中，kd通过放射性标记的抗原结合测定(ria)进行测量。在一个方面，使用目标抗体及其抗原的fab版执行ria。例如，通过在一系列未标记的抗原滴定存在下用最小浓度的(
125
i)标记的抗原平衡fab，然后用抗fab抗体包被的板捕获结合的抗原，来测量fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如chen等人，j.mol.biol.293:865-881(1999))。为确定测定的条件，用溶于50mm碳酸钠(ph 9.6)中的5μg/ml捕获抗fab抗体(cappel labs)将多孔板(thermo scientific)包被过夜，然后在室温(约23℃)下用溶于pbs中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭2至5小时。在非吸附板(nunc#269620)中，将100pm或26pm[
125
i]-抗原与目标fab的连续稀释液混合(例如，与presta等人在cancer res.57:
4593-4599(1997)中所述的抗vegf抗体fab-12的评估结果一致)。然后将目标fab孵育过夜；但是，可继续孵育更长时间(例如约65小时)，以确保达到平衡。此后，将混合物转移的捕获板上，在室温下进行孵育(例如，孵育1小时)。然后除去溶液，用溶于pbs中的0.1％聚山梨醇酯20将板洗涤八次。当板干燥后，将闪烁剂(microscint-20
tm
；packard)以150μl/孔的量加入，并利用topcounttm
tm
γ计数器(packard)进行10分钟计数。选择提供小于或等于最大结合浓度的20％的每种fab的浓度以用于竞争性结合测定中。
[0629]
2.抗体片段
[0630]
在某些方面，本文提供的抗体为抗体片段。
[0631]
在一个方面，抗体片段为fab、fab’、fab
’‑
sh或f(ab’)2片段，特别是fab片段。木瓜酶对完整抗体的消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，其各自包含重链和轻链可变结构域(分别为vh和vl)和轻链的恒定结构域(cl)和重链的第一恒定结构域(ch1)。因此，术语“fab片段”是指包含轻链(包含vl结构域和cl结构域)及重链片段(包含vh结构域和ch1结构域)的抗体片段。“fab’片段”与fab片段的区别在于在ch1结构域的羧基末端增加了残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab
’‑
sh是fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有一个游离硫醇基团。胃蛋白酶加工产生一个f(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个fab片段)和一部分fc区。关于包含补救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的fab及f(ab')2片段的论述，参见美国第5,869,046号专利。
[0632]
在另一个实施例中，抗体片段为双体抗体、三体抗体或四体抗体。双体抗体为具有两个抗原结合位点(其可是二价或双特异性的)的抗体片段。参见例如ep 404,097；wo 1993/01161；hudson等人，nat.med.9:129-134(2003)；及hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448(1993)。hudson等人(nat.med.9:129-134，(2003))中也描述了三体抗体及四体抗体。
[0633]
在又一方面，抗体片段为单链fab片段。“单链fab片段”或“scfab”由抗体重链可变结构域(vh)、抗体重链恒定结构域1(ch1)、抗体轻链可变结构域(vl)、抗体轻链恒定结构域(cl)及连接基组成，其中所述抗体域及所述连接基在n末端至c末端方向具有以下序列的一个：a)vh-ch1-连接基-vl-cl、b)vl-cl-连接基-vh-ch1、c)vh-cl-连接基-vl-ch1或d)vl-ch1-连接基-vh-cl。特别地，所述连接基为至少30个氨基酸并且较佳地32至50个氨基酸组成的多肽。所述单链fab片段通过cl结构域与ch1结构域之间的天然二硫键达到稳定。此外，这些单链fab片段可通过插入半胱氨酸残基产生链间二硫键而得到进一步稳定(例如，根据kabat编号，在变异重链的位置44和变异轻链的位置100处插入)。
[0634]
在另一方面，抗体片段为单链可变片段(scfv)。“单链可变片段”或“scfv”为抗体的重链(vh)和轻链(vl)的可变结构域的融合蛋白，其通过连接基连接。特别地，连接基为10至25个氨基酸组成的短多肽，并且通常富含甘氨酸以提高柔韧性，并含有丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度，并且可将vh的n末端与vl的的c末端连接，反的亦然。尽管去除了恒定区并引入了连接基，但是该蛋白仍保留了原始抗体的特异性。关于scfv片段的综述，参见例如pl
ü
ckthun，the pharmacology of monoclonal antibodies，第113卷，rosenburg和moore编，springer-verlag，new york，第269页至第315页(1994)；页可参见wo 93/16185；以及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。
[0635]
在另一方面，抗体片段为单结构域抗体。单结构域抗体为包含抗体的重链可变结
构域的全部或部分或抗体的轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体为人单结构域抗体(domantis,inc.，waltham,ma；参见例如美国专利第6,248,516b1号)。
[0636]
抗体片段可通过各种技术制造，包括但不限于如本文所述的完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌)的重组产生。
[0637]
3.嵌合和人源化抗体
[0638]
在某些方面，本文提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；及morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984)。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴的可变区)及人恒定区。在又一个实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类或子类相比于其亲本抗体已发生变化。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
[0639]
在某些方面，嵌合抗体为人源化抗体。通常，非人抗体为人源化抗体以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性及亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中cdr(或其部分)来源于非人抗体，并且fr(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些fr残基经来自非人抗体(例如衍生cdr残基的抗体)的对应残基取代，以例如恢复或改善抗体特异性或亲和力。
[0640]
人源化抗体及其制备方法综述于例如almagro和fransson，front.biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如：riechmann等人，nature 332:323-329(1988)；queen等人，proc.nat’l acad.sci.usa 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；kashmiri等人，methods 36:25-34(2005)(具体描述了特异性决定残基(sdr)接枝)；padlan，mol.immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；dall’acqua等人，methods 36:43-60(2005)(描述了“fr改组”)；osbourn等人，methods 36:61-68(2005)；以及klimka等人，br.j.cancer，83:252-260(2000)(描述了用于fr改组的“指导选择”方法)中。
[0641]
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如sims等人j.immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区特定亚群的人抗体共有序列的框架区(参见例如：carter等人proc.natl.acad.sci.usa，89:4285(1992)；以及presta等人j.immunol.，151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如almagro和fransson，front.biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选fr文库的框架区(参见例如：baca等人，j.biol.chem.272:10678-10684(1997)；及rosok等人，j.biol.chem.271:22611-22618(1996))。
[0642]
4.人抗体
[0643]
在某些方面，本文提供的抗体为人抗体。可使用此领域中所习知的各种技术生产人抗体。人抗体通常描述于：van dijk和van de winkel，curr.opin.pharmacol.5:368-74(2001)；以及lonberg，curr.opin.immunol.20:450-459(2008)。
[0644]
可通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已被修饰以应答抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物
的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。有关从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见lonberg，nat.biotech.23:1117-1125(2005)。另见例如：美国专利号6,075,181和6,150,584(描述了xenomouse
tm
技术)；美国专利号5,770,429(描述了技术)；美国专利号7,041,870(描述了k-m技术)；以及美国专利申请公开号us 2007/0061900(描述了技术)。由此类动物产生的来源于完整抗体的人可变区可被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区结合来修饰。
[0645]
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法进行制备。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如：kozbor j.immunol.，133:3001(1984)；brodeur等人，monoclonal antibody production techniques and applications，pp.51-63(marcel dekker，inc.，new york，1987)；以及boerner等人，j.immunol.，147:86(1991)。)通过人b细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于li等人，proc.natl.acad.sci.usa，103:3557-3562(2006)。其他方法包括描述于例如以下文献中的那些：美国专利号7,189,826(描述了由杂交瘤细胞系生产单克隆人igm抗体)，以及ni，xiandai mianyixue，26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(trioma技术)也描述于以下文献中：vollmers和brandlein，histology and histopathology，20(3):927-937(2005)；以及vollmers和brandlein，methods and findings in experimental and clinical pharmacology，27(3):185-91(2005)。
[0646]
人抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的可变结构域序列来产生。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域结合。下文描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。
[0647]
5.来源于文库的抗体
[0648]
在某些方面，本文提供的抗体来源于文库。用于本发明的抗体可通过筛选组合文库中具有所需的一种或多种活性的抗体来分离。例如，用于筛选组合文库的方法综述于例如lerner等人的nature reviews 16:498-508(2016)。例如，此领域中所已知的多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有所需结合特性的抗体。此类方法综述于以下文献中：frenzel等人的mabs 8:1177-1194(2016)；bazan等人的human vaccines and immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)；以及zhao等人的critical reviews in biotechnology 36:276-289(2016)；以及hoogenboom等人的methods in molecular biology 178:1-37(o’brien等人主编，human press，totowa，nj，2001)；以及marks和bradbury的methods in molecular biology248:161-175(lo主编，human press，totowa，nj，2003)。
[0649]
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(pcr)分别克隆vh和vl基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可按照以下文献所述的方法筛选抗原结合噬菌体：winter等人，annual review of immunology 12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链fv(scfv)片段或fab片段展示抗体片段。来自免疫源的文库无需构建杂交瘤即可向免疫原提供高亲和力抗体。或者，可以在不进行任何免疫的情况下克隆天然组成成分(例如，来自人的)以向各种非自身以及自身抗原提供抗体的单一来源，如griffiths等人在embo journal 12:725-734(1993)中所述。最后，还可以通过克隆干细胞中未重排的v基因片段，并使用包含随机序列的pcr引物来编码高变异性cdr3区域并在体外完成重排，由此合成天然文库，如hoogenboom
和winter在journal of molecular biology 227:381-388(1992)中所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373、7,985,840、7,785,903及8,679,490；以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764及2007/0292936。
[0650]
用于筛选组合文库中具有所需活性的抗体的此领域中所已知方法的其他实例包括核醣体和mrna展示以及用于细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞上的抗体展示和选择的方法。酵母表面展示方法综述于例如scholler等人的methods in molecular biology 503:135-56(2012)和cherf等人的methods in molecular biology 1319:155-175(2015)以及zhao等人的methods in molecular biology 889:73-84(2012)中。用于核醣体展示的方法描述于例如he等人的nucleic acids research 25:5132-5134(1997)以及hanes等人的pnas 94:4937-4942(1997)中。
[0651]
从人抗体文库中分离的抗体或抗体片段在本文中也被视作人抗体或人抗体片段。
[0652]
6.多特异性抗体
[0653]
在某些实施例中，本文提供的抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同位点(即不同抗原上的不同表位或同一抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些方面，结合特异性中的一种为对klk7的结合特异性，而另一种是针对任何其他抗原的。在某些方面，结合特异性中的一种为对klk7的结合特异性，而另一种是针对klk5的。在某些方面，双特异性抗体可结合抗原的两个(或更多个)不同表位。多特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段。
[0654]
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见milstein和cuello，nature 305:537(1983))和“杵臼”(knob-in-hole)工程(参见例如美国专利号5,731,168，以及atwell等人j.mol.biol.270:26(1997))。非限制性示例性杵臼取代包括t366w(杵)和t366s/l368a/y407v(臼)。在一些实施例中，杵臼取代发生于igg1恒定结构域中。
[0655]
还可通过工程化静电转向效应得到抗体fc-异二聚体分子，从而制得多特异性抗体。参见例如wo 2009/089004；dillon等人，mabs 9(2):213-230(2017)。作为非限制性实例，在包含两个重链可变区和两个轻链可变区的双特异性抗体中，第一重链可变区可包含q39e取代(kabat编号)并且第一轻链可变区可包含q38k取代(kabat编号)；第二重链可变区可包含q39k取代(kabat编号)并且第二轻链可变区可包含q38e取代(kabat编号)。在一些实施例中，q39e/q38k及q39k/q38e取代减少了双特异性抗体的重链与轻链的错配。类似地，第一重链恒定区可包含s183k取代(eu编号)并且第一轻链恒定区可包含v133e取代(eu编号)，第二重链恒定区可包含s183e取代(eu编号)并且第二轻链恒定区可包含v133k取代(eu编号)。在一些实施例中，s183k/v133e及s183e/v133k取代减少了双特异性抗体的重链与轻链的错配。
[0656]
在一些实施例中，双特异性抗体包含结合结构域中的q39e/q38k和q39k/q38e取代以及恒定区中的s183k/v133e和s183e/v133k取代。在一些实施例中，双特异性抗体同时包含杵臼取代和静电取代。参见例如wo 2016/172485，其通过引用以其全文并出于所有目的并入本文。双特异性抗体的一种非限制性示例性示意图如图15所示。
[0657]
因此，在一些实施例中，提供了一种多特异性抗体，该多特异性抗体包含：a)结合
第一抗原的第一重链/轻链对，其包含第一重链多肽(h1)和第一轻链多肽(l1)，及b)结合第二抗原的第二重链/轻链对，其包含第二重链多肽(h2)和第二轻链多肽(l2)，其中每个h1和h2包含重链可变结构域(vh)及重链恒定结构域(ch1)，并且每个l1和l2包含轻链可变结构域(vl)和轻链恒定结构域(cl)；其中h1的ch1结构域包含s183(eu编号)处的氨基酸取代，并且l1的cl结构域包含v133(eu编号)处的氨基酸取代；并且其中h1的vh结构域包含q39位置处的氨基酸取代，l1的vl结构域包含q38位置处的氨基酸取代，和/或h2的vh结构域包含q39位置处的氨基酸取代，l2的vl结构域包含q38位置(均采用kabat编号)处的氨基酸取代。在一些实施例中，h1的vh结构域包含q39(kabat编号)处的氨基酸取代，并且l1的vl结构域包含q38(kabat编号)处的氨基酸取代。在一些实施例中，h2的ch1结构域包含s183(eu编号)处的氨基酸取代，并且l2的cl结构域包含v133(eu编号)处的氨基酸取代。在一些实施例中，h2的vh结构域进一步包含q39位置处的氨基酸取代，并且l2的vl结构域进一步包含q38(kabat编号)位置处的氨基酸取代。在一些实施例中，h1的ch1结构域包含s183k突变，l1的cl结构域包含v133e突变，h2的ch1包含s183e突变，并且l2的cl结构域包含v133k突变。在一些实施例中，h1的vh结构域包含q39e突变，l1的vl结构域包含q38k突变，h2的vh结构域包含q39k突变，并且l2的vl结构域包含q38e突变(均采用kabat编号)。
[0658]
多特异性抗体也可通过以下方法进行制备：交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980；及brennan等人，science，229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如，kostelny等人，j.immunol.，148(5):1547-1553(1992)；及wo 2011/034605)；使用常用轻链技术规避轻链错配问题(参见例如wo 98/50431)；使用“双体抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如，hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa，90:6444-6448(1993))；以及使用单链fv(sfv)二聚体(参见例如gruber等人，j.immunol.，152:5368(1994))；以及按照例如tutt等人j.immunol.147:60(1991)所述的方法制备三特异性抗体。
[0659]
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的改造的抗体，包括例如“章鱼抗体”(octopus antibodies)或dvd-ig(参见例如wo 2001/77342及wo 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他实例可参见wo 2010/115589、wo 2010/112193、wo 2010/136172、wo 2010/145792及wo 2013/026831中。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双重作用fab”或“daf”，其包含结合klk7以及另一种不同抗原诸如klk5的抗原结合位点(参见例如us 2008/0069820及wo 2015/095539)。
[0660]
多特异性抗体也可以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中具有结构域交叉，即通过交换vh/vl结构域(参见例如wo 2009/080252和wo 2015/150447)、ch1/cl结构域(参见例如wo 2009/080253)或完整的fab臂(参见例如wo 2009/080251、wo 2016/016299，另见schaefer等人，pnas，108(2011)1187-1191，及klein等人，mabs 8(2016)1010-20)实现。在一个方面，多特异性抗体包含交叉fab片段。术语“交叉fab片段”或“xfab片段”或“交换型fab片段”是指其中重链和轻链的可变区或恒定区发生交换的fab片段。交叉fab片段包含由轻链可变区(vl)和重链恒定区1(ch1)构成的多肽链以及由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的多肽链。还可通过将带电或不带电氨基酸突变引入结构域界面引导正确fab配对，从而设计不对称的fab臂。参见例如wo 2016/172485。
[0661]
用于多特异性抗体的各种其他分子形式为本技术领域中已知的并且包括在本文
中(参见例如spiess等人，mol immunol 67(2015)95-106)。
[0662]
可用于此目的的双特异性抗体形式包括但不限于所谓“bite”(bispecific t cell engager)分子，其中，两个scfv分子通过柔性连接基融合(参见例如wo 2004/106381、wo 2005/061547、wo 2007/042261及wo 2008/119567；nagorsen和exp cell res 317，1255-1260(2011))；双体抗体(holliger等人，prot eng 9，299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双体抗体(“tandab”；kipriyanov等人，j mol biol293，41-56(1999))；“dart”(双亲和重靶向)分子，其基于双体抗体形式，但具有c末端二硫键以供进一步稳定(johnson等人，j mol biol399，436-449(2010))，以及所谓triomab，它们为完整的小鼠/大鼠igg杂合分子(参见seimetz等人的综述：cancer treat rev 36，458-467(2010))。本文所包括的特定t细胞双特异性抗体形式描述于：wo 2013/026833；wo 2013/026839；wo 2016/020309；及bacac等人oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
[0663]
7.抗体变体
[0664]
在某些方面，考虑到本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可期望改变抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入和/或取代。可实施缺失、插入和取代的任意组合以得到最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合特征。
[0665]
a)取代、插入和缺失变体
[0666]
在某些方面，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目标位点包括cdr和fr。保守性取代列于表1的“优选取代”标题下。表1中的“示例性取代”标题下提供了更多实质性变化，并且下文将参考氨基酸侧链类别进行进一步描述。可将氨基酸取代引入目标抗体中，并筛选具有所需活性的产物，例如，保留/改善的抗原结合特征、降低的免疫原性或改善的adcc或cdc。
[0667]
表1
[0668]
[0669][0670]
氨基酸可根据常见的侧链特性进行分组：
[0671]
(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
[0672]
(2)中性亲水性：cys，ser，thr，asn，gln；
[0673]
(3)酸性：asp，glu；
[0674]
(4)碱性：his，lys，arg；
[0675]
(5)影响链取向的残基：gly，pro；
[0676]
(6)芳香族：trp，tyr，phe。
[0677]
非保守性取代需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
[0678]
一种类型的取代变体涉及取代一个或多个亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体将在某些生物学特性(例如提高亲和力、降低免疫原性)方面具有修饰(例如，改善)和/或基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文所述的那些。简而言的，取代一个或多个。cdr残基发生突变，并且变体抗体在噬菌体上展示并筛选出特定的生物学活性(例如，结合亲和力)。
[0679]
可以在cdr中进行改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。可在cdr“热点”(即由在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如chowdhury，methods mol.biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基中作出此类改变，其中对所得变体
vh或vl进行结合亲和力测试。通过构建并从二级文库中重新选择以实现亲和力成熟，例如hoogenboom等人在methods in molecular biology 178:1-37(o’brien等人主编，human press，totowa，nj(2001))中所述。在亲和力成熟的一些方面，通过多种方法(例如，易错pcr、链改组或寡核苷酸定向突变)中的任一者将多样性引入出于成熟目的而挑选的可变基因中。然后创建第二文库。然后筛选该文库，以识别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法是cdr定向方法，其中将若干cdr残基(例如，每次4-6个残基)随机化。可通过例如丙氨酸扫描诱变或建模以特异性识别参与抗原结合的cdr残基。特别是cdr-h3和cdr-l3经常成为靶点。
[0680]
在某些方面，在一个或多个cdr内可能发生取代、插入或缺失，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可在cdr中实施基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文所提供的保守性取代)。此类改变可以例如在cdr中的抗原接触残基之外。在上文提供的某些vh和vl序列变体中，各cdr未改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
[0681]
可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。替代性地或另外地，可使用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴定抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否包含所需的特性。
[0682]
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合体的长度，从一个残基到包含一百个或更多残基的序列，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的n末端或c末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如对于adept)或多肽融合。
[0683]
b)糖基化变体
[0684]
在某些实施例中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。抗体添加或缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来方便地实现。
[0685]
当抗体包含fc区时，可改变与其相连的寡糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，其通常通过n-连接附接至fc区ch2域的asn297。参见例如wright等人tibtech 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、n-乙酰基葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双触角寡糖结构的“主干”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施例中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
[0686]
在一个实施例中，提供了具有非岩藻糖基化寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接至fc区的岩藻糖的寡糖结构。此类非岩藻糖基化寡糖(也称为“去岩藻糖基化”寡糖)具体是一种n-连接寡糖，其在双触角寡糖结构的主干中缺少附接至第一glcnac的岩藻糖残基。在一个实施例中，提供了与天然或亲本抗体相比在fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、
至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比是缺少岩藻糖残基的寡糖相对于通过maldi-tof质谱法测得的附接至asn 297(例如复合物、杂合和高甘露糖结构)的所有寡糖的总和的(平均)量，例如wo 2006/082515中所述。asn297是指位于fc区中约297位的天冬酰胺残基(fc区残基的eu编号)；但是，由于抗体中的序列变化微小，因此asn297也可以位于位置297的上游或下游大约
±
3个氨基酸，即，在位置294与300之间。此类在fc区中具有增加的比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体可具有改善的fcγriiia受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的adcc功能。参见例如us 2003/0157108；us 2004/0093621。
[0687]
能够产生具有减少的岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺少蛋白质岩藻糖基化的lec13 cho细胞(ripka等人，arch.biochem.biophys.249:533-545(1986)；us 2003/0157108；及wo 2004/056312，尤其是在实例11中)；和敲除细胞系，诸如敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶基因fut8的cho细胞(参见例如yamane-ohnuki等人biotech.bioeng.87:614-622(2004)；kanda,y.等人,biotechnol.bioeng.,94(4):680-688(2006)；及wo 2003/085107)；或gdp-岩藻糖合成或转运蛋白活性降低或消失的细胞(参见例如us2004259150、us2005031613、us2004132140、us2004110282)。
[0688]
在另一个实施例中，抗体变体被提供有二等分的寡糖，例如，其中附接至抗体的fc区的双触角寡糖被glcnac平分。此类抗体变体可具有如上文所述的减少的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能。此类抗体变体的实例描述于例如：umana等人，nat biotechnol 17，176-180(1999)；ferrara等人，biotechn bioeng 93，851-861(2006)；wo 99/54342；wo 2004/065540、wo 2003/011878。
[0689]
还提供了在寡糖上具有至少一个附接至fc区的半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的cdc功能。此类抗体变体描述于例如wo 1997/30087、wo 1998/58964及wo 1999/22764中。
[0690]
c)fc区变体
[0691]
在某些方面，可在本文所提供的抗体的fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生fc区变体。fc区变体可包含人fc区序列(例如，人igg1、igg2、igg3或igg
4 fc区)，其在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如，取代)。
[0692]
在某些方面，本发明考虑了一种具有一部分但非全部效应子功能的抗体变体，使其成为以下应用中所需的候选抗体：其中抗体体内半衰期很重要，但某些效应子功能(例如补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc))是不必要或有害的。可实施体外和/或体内细胞毒性测定，以确认cdc和/或adcc活性的下降/耗竭。例如，可实施fc受体(fcr)结合测定，以确保抗体缺少fcγr结合(因此可能缺少adcc活性)，但保留fcrn结合能力。介导adcc的主要细胞nk细胞仅表达fcγriii，而单核细胞则表达fcγri、fcγrii及fcγriii。fcr在造血细胞上的表达汇总于ravetch和kinet的论文(annu.rev.immunol.9:457-492(1991))的第464页的表3中。用于评估目标分子的adcc活性的体外分析方法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362中(参见例如hellstrom,i.等人，proc.nat’l acad.sci.usa 83:7059-7063(1986))和hellstrom,i等人，proc.nat’l acad.sci.usa 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见bruggemann,m.等人，j.exp.med.166:1351-1361(1987))。替代性地，可采用非放射性测定方法(参见例如：用于
流式细胞术的acti
tm
非放射性细胞毒性测定(celltechnology，inc.mountain view，ca)；以及cytotox非放射性细胞毒性测定(promega，madison，wi))。用于此类分析的有用的效应子细胞包括外周血单核细胞(pbmc)及自然杀伤(nk)细胞。替代性地或另外地，可在例如clynes等人在proc.natl acad.sci.usa 95:652-656(1998)中公开的动物模型中在体内评估目标分子的adcc活性。还可以进行c1q结合测定以确认抗体无法结合c1q，因此缺乏cdc活性。参见例如wo 2006/029879及wo 2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为评估补体活化，可进行cdc测定(参见例如：gazzano-santoro等，j.immunol.methods 202:163(1996)；cragg,m.s.等，blood 101:1045-1052(2003)；以及cragg,m.s.和m.j.glennie，blood 103:2738-2743(2004))。fcrn结合和体内清除率/半衰期测定也可使用此领域中所已知的方法进行(参见例如petkova,s.b.等人，int’l.immunol.18(12):1759-1769(2006)；wo 2013/120929)。
[0693]
具有降低的效应子功能的抗体包括具有一个或多个fc区残基238、265、269、270、297、327和329的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类fc变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸的两个或多个处具有取代的fc突变体，包括所谓的“dana”fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
[0694]
其中描述了某些与fcr的结合能力得到改善或减弱的抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；wo 2004/056312及shields等人，j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001)。)
[0695]
在某些方面，抗体变体包含具有改善adcc的一个或多个氨基酸取代的fc区，例如在fc区的位置298、333和/或334(殘基的eu编号)处的取代。
[0696]
在某些方面，抗体变体包含具有减弱了fcγr结合的一个或多个氨基酸取代的fc区，例如在fc区的位置234和235(殘基的eu编号)处的取代。在一个方面，取代为l234a和l235a(lala)。在某些方面，抗体变体进一步包含fc区中的d265a和/或p329g，其来源于人igg
1 fc区。在一个方面，取代为fc区中的l234a、l235a和p329g(lala-pg)，其来源于人igg
1 fc区。参见例如wo 2012/130831。在另一方面，取代为fc区中的l234a、l235a和d265a(lala-da)，其来源于人igg
1 fc区。
[0697]
在某些方面，在fc区中进行改变，得到改变(即改善或减少)的c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，例如美国专利号6,194,551、wo 99/51642和idusogie等人j.immunol.164:4178-4184(2000)所述。
[0698]
具有延长的半衰期和改善的新生儿fc受体(fcrn)结合、负责将母体igg转移至胎儿(guyer等人j.immunol.117:587(1976)和kim等人j.immunol.24:249(1994))的抗体描述于us2005/0014934(hinton等人)中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的fc区，其改善了fc区与fcrn的结合。此类fc变体包括在一个或多个fc区残基上发生取代的fc变体：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428或434，例如fc区残基434的取代(参见例如美国专利号7,371,826；dall'acqua,w.f.等人，j.biol.chem.281(2006)23514-23524)。在一些实施例中，本文所提供的抗体包含取代基m428l和/或n434s诸如m428l和n434s(“ls”)。
[0699]
通过定点诱变已经识别出对小鼠fc-小鼠fcrn相互作用至关重要的fc区残基(参见例如，dall’acqua,w.f.等人j.immunol 169(2002)5171-5180)。残基i253、h310、h433、n434和h435(eu索引编号)参与相互作用(medesan,c.等，eur.j.immunol.26(1996)2533；
firan,m.等人，int.immunol.13(2001)993；kim,j.k.等人，eur.j.immunol.24(1994)542)。已发现残基i253、h310和h435对于人fc与小鼠fcrn的相互作用至关重要kim,j.k.等人，eur.j.immunol.29(1999)2819)。对人fc-人fcrn复合物的研究表明，残基i253、s254、h435和y436对于相互作用至关重要(firan,m.等人，int.immunol.13(2001)993；shields,r.l.等人，j.biol.chem.276(2001)6591-6604)。在yeung,y.a.等人(j.immunol.182(2009)7667-7671)中，已经报告并研究了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。
[0700]
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的fc区，这些取代减少fcrn结合，例如fc区的位置253和/或310和/或435(殘基的eu编号)处的取代。在某些方面，抗体变体包含fc区，该fc区具有在位置253、310和435处的氨基酸取代。在一个方面，取代为fc区中的i253a、h310a和h435a，其来源于人igg1 fc区。参见例如grevys,a等人，j.immunol.194(2015)5497-5508。
[0701]
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的fc区，这些取代减少fcrn结合，例如fc区的位置310和/或433和/或436(殘基的eu编号)处的取代。在某些方面，抗体变体包含fc区，该fc区具有在位置310、433和436处的氨基酸取代。在一个方面，取代为fc区中的h310a、h433a和y436a，其来源于人igg1 fc区。(参见例如wo 2014/177460al)。
[0702]
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的fc区，这些取代增加fcrn结合，例如fc区的位置252和/或254和/或256(殘基的eu编号)处的取代。在某些方面，抗体变体包含fc区，该fc区具有在位置252、254和256处的氨基酸取代。在一个方面，取代为fc区中的m252y、s254t和t256e，其来源于人igg1 fc区。另请参见duncan&winter，nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；及wo 94/29351，其中涉及fc区变体的其他实例。
[0703]
如本文所报告的抗体的重链的c末端可以是以氨基酸残基pgk结束的完整c末端。重链的c末端可以是缩短的c末端，其中已经去除了一个或两个c末端氨基酸残基。在一个优选方面，重链的c末端是缩短的c末端结束的pg。在本文所报告的所有方面中的一方面，一种包含重链的抗体包括本文所指定的c末端ch3结构域，其包含c末端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447，根据氨基酸位置的eu索引编号)。在本文所报告的所有方面中的一方面，一种包含重链的抗体包括本文所指定的c末端ch3结构域，其包含c末端甘氨酸残基(g446，根据氨基酸位置的eu索引编号)。
[0704]
d)经半胱氨酸改造的抗体变体
[0705]
在某些方面，可期望创建半胱氨酸改造的抗体，例如thiomab
tm
抗体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此被定位在抗体的可接近位点，并可用于使抗体与其他部分(例如药物部分或连接基-药物部分)缀合，以形成免疫缀合物，如本文进一步所述。经半胱氨酸改造的抗体可按照例如美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或wo 2016040856所述的方法产生。
[0706]
e)抗体衍生物
[0707]
在某些实施例中，可进一步修饰本文所提供的抗体，以使其含有本技术领域中已知并且容易获得的另外的非蛋白质部分。适用于抗体的衍生化的部分包括但不限于水溶性
聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如,甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。该聚合物可具有任何分子量，并且可以为支链聚合物或非支链聚合物。附接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果附接的聚合物超过一种，则它们可以为相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素来确定，这些考虑因素包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗中等。
[0708]
8.免疫缀合物
[0709]
本发明还提供了包含如本文所述的抗体的免疫缀合物，其缀合(化学键合)至一种或多种治疗剂，例如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如来源于细菌、真菌、植物或动物的蛋白毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
[0710]
在一个实施例中，免疫缀合物为抗体-药物缀合物(adc)，其中抗体与上述一种或多种治疗剂缀合。通常使用连接基将抗体连接至一种或多种治疗剂。pharmacol review 68:3-19(2016)中列出了adc技术的概述，其包括治疗剂、药物和连接基的实例。
[0711]
在另一个实施例中，免疫缀合物包括缀合至酶活性毒素或其片段的本文所述的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、蒴莲根毒素a链、α-次黄嘌呤、油桐蛋白、石竹蛋白(dianthin protein)、美洲商陆蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、明胶、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
[0712]
在另一个实施例中，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。在另一个实施例中，多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。實例包括at
211
、i
131
、i
125
、y
90
、re
186
、re
188
、sm
153
、bi
212
、p
32
、pb
212
和lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如tc99m或i123，或用于核磁共振(nmr)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
[0713]
还可使用多种双功能蛋白偶联剂诸如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备包含抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。例如，可以如vitetta等人,science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见wo 94/11026。连接基可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可裂解的连接基”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对
光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(chari等人，cancer res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
[0714]
本文的免疫缀合物或adc明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自pierce biotechnology,inc.,rockford,il.,u.s.a)bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc、磺基-smpb和svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
[0715]
d.重组方法和组合物
[0716]
可使用重组方法和组合物来生产抗体，例如us 4,816,567中所述。对于这些方法，提供了编码抗体的一种或多种分离的核酸。
[0717]
如果是天然抗体或天然抗体片段，则需要两个核酸，一个用于轻链或其片段，并且另一个用于重链或其片段。此类核酸编码包含vl的氨基酸序列和/或包含抗体的vh的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或不同的表达载体上。
[0718]
在具有异源二聚重链的某些双特异性抗体的情况下，需要四种核酸，一种用于第一轻链，一种用于包含第一异单体(heteromonomeric)fc区多肽的第一重链，一种用于第二轻链，并且一种用于包含第二异单体fc区多肽的第二重链。这四个核酸可包含在一个或多个核酸分子或表达载体中。此类核酸编码构成抗体的第一vl的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第一异单体fc区的第一vh的氨基酸序列和/或构成抗体的第二vl的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第二异单体fc区的第二vh的氨基酸序列(例如抗体的第一轻链和/或第二轻链和/或第一重链和/或第二重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上，通常这些核酸位于两个或三个表达载体上，即一个载体可以包含这些核酸中的多于一种。这些双特异性抗体的实例是crossmabs(参见例如schaefer,w.等人，pnas，108(2011)11187-1191)。例如，异源单体重链的一条包含所谓“杵突变”(t366w，以及任选地s354c或y349c中的一者)，并且异单体重链中的另一条包含所谓“臼突变”(t366s、l368a和y407v，以及任选地y349c或s354c)(参见例如carter,p.等人，immunotechnol.2(1996)73)(根据eu索引编号)。
[0719]
在一个方面，提供了编码抗体的经分离的核酸，该抗体用于如本文所报告的方法中。
[0720]
在一个方面，提供了一种制备抗体的方法，其中该方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包含如上所述的编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收该抗体。
[0721]
在重组生产抗体时，将例如上述的编码抗体的核酸分离并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规程序(例如，通过使用能够与如本文所述的基因转录因子特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序、或通过重组方法或通过化学合成产生。
[0722]
适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和fc效应子功能时。有关抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如us 5,648,237、us 5,789,199及us 5,840,523。(另见
charlton,k.a.，在：methods in molecular biology，第248卷，lo,b.k.c.(主编)，humana press，totowa，nj(2003)第245-254页，其中描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
[0723]
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，所述真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见gerngross,t.u.，nat.biotech.22(2004)1409-1414；以及li,h.等人，nat.biotech.24(2006)210-215。
[0724]
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
[0725]
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的plantibodiestm技术)。
[0726]
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，可使用适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例包括：由sv40(cos-7)转化的猴肾cv1系；人胚肾系(293或293细胞，如例如在graham等人，j.gen virol.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠塞尔托利氏细胞(tm4细胞，如例如在mather,biol.reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck)；布法罗大鼠肝细胞(brl 3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hep g2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(mmt 060562)；tri细胞(如mather,j.p.等人，annals n.y.acad.sci.383(1982)44-68所述)；mrc 5细胞；及fs4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub,g.等人，proc.natl.acad.sci.usa 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如y0、ns0和sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如：yazaki,p.和wu,a.m.，methods in molecular biology，第248卷，lo,b.k.c.主编，humana press，totowa，nj(2004)，第255-268页。
[0727]
在一个方面，宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴样细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。
[0728]
e.分析
[0729]
可采用此领域中已知的各种分析法对本文所提供的抗klk7抗体和抗klk5抗体的物理/化学性质和/或生物活性进行鉴别、筛选或表征。
[0730]
1.结合测定及其他测定
[0731]
在一个方面，诸如elisa、蛋白质印迹等已知方法来测试本发明的抗体的抗原结合活性。
[0732]
在另一方面，可使用竞争测定鉴定与本文提供的抗体诸如hu.1411c-h11l2竞争结合klk7的抗体。在某些方面，此类竞争抗体与hu.1411c-h11l2结合的同一表位(例如，线性或构象表位)结合。在某些方面，此类竞争抗体与hu.1411c-h11l2结合的同一表位(例如，线性或构象表位)结合。在一些实施例中，可使用竞争测定鉴定与本文提供的抗体诸如hu.10c5-h28l5或hu.9h5-h14l4竞争结合klk5的抗体。在某些方面，此类竞争抗体结合hu.10c5-h28l5或hu.9h5-h14l4结合的同一表位(例如，线性或构象表位)。用于定位抗体与
之结合的表位的详细示例性方法提供于：morris(1996)，“epitope mapping protocols”，出自methods in molecular biology第66卷(humana press,totowa,nj)。
[0733]
在一种示例性竞争测定中，将固定化抗原(诸如klk5或klk7)置于包含结合抗原(例如，hu.1411c-h11l2、hu.10c5-h28l5或hu.9h5-h14l4)的第一标记抗体及另一种未标记的抗体(正在试验其与第一抗体竞争结合抗原的能力)的溶液中进行孵育。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原置于包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中进行孵育。在允许第一抗体与抗原结合的条件下孵育后，去除多余的未结合抗体，并测量与固定化抗原相关联的标记物的量。如果试验样品中与固定抗原相关的标记物的量相对于对照样品明显减少，则表明第二抗体正在与第一抗体竞争结合抗原。参见harlow和lane(1988)antibodies:a laboratory manual第14章(cold spring harbor laboratory，cold spring harbor，ny)。
[0734]
2.活性分析
[0735]
klk7是一种胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。在一些实施例中，klk7在芳族和/或疏水性氨基酸(诸如酪氨酸、苯丙氨酸和/或亮氨酸)之后裂解多肽。在一个方面，提供了用于鉴定抑制人klk7活性的抗klk7抗体的测定方法。生物学活性可包括例如klk7蛋白酶活性。还提供了在体内和/或体外具有此类生物学活性的抗体。
[0736]
在某些方面，测试本发明的抗体的此类生物活性。用于测定klk7蛋白酶活性的测定方法是本领域中已知的，并且通常包括在存在分子和试验分子(诸如抗klk7抗体)的情况下孵育klk7。用于试验抗klk7抗体(或包含抗klk7结合臂的多特异性抗体)是否抑制klk7蛋白酶活性的非限制性测定方法如下：klk7直接功能测定可在室温下于384孔板中进行，最终反应体积为15μl。在测定缓冲剂(75mm tris，ph 8.0，150mm nacl，0.01％tween 20)中将抑制剂样品稀释至最终浓度的3倍。将抑制剂(例如，抗klk7抗体)或对照样品(5μl)加入板中，然后加入溶于测定缓冲剂中的5μl人klk7(seq id no:4)，最终浓度为0.5nm。40min后，加入溶于测定缓冲剂中的5μl mca-rpkpve-nval-wrk(dnp)(seq id no:121；bachem m-2110，4.3mm储备液的dmso溶液)，最终浓度为10μm。加入底物后，使用光学模块fi 320 405在微板读数器(bmg labtech)中读取板，其中将增益设定为0％。每100s进行测量，持续约1.5小时。反应速率(表示为rfu/s)通过线性回归在线性范围内进行计算。反应速率可归一化至0％和100％活性对照值，并用4参数方程进行拟合以计算ic50值。对于二价抑制剂，可以将原始ic50乘以2。
[0737]
klk5是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。在一个方面，提供了用于鉴定抑制人klk5活性的抗klk5抗体的测定方法。生物学活性可包括例如klk5蛋白酶活性。在一个实施方案中，抗klk5抗体抑制klk5的丝氨酸蛋白酶活性。还提供了在体内和/或体外具有此类生物学活性的抗体。
[0738]
在某些方面，测试本发明的抗体的此类生物活性。用于测定klk5蛋白酶活性的测定方法是本领域中已知的，并且可包括例如在存在分子和试验分子(诸如抗klk5抗体)的情况下孵育klk5。在一些实施例中，抗klk5抗体的生物学活性通过一种或多种方法进行检测，这些方法选自直接活性测定、荧光肽测定、lc/ms测定及ki(app)测定。在一些实施例中，利用选自重组klk5直接活性测定、偶联pro-klk1荧光肽测定、偶联pro-klk7荧光肽测定、pro-klk1 lc/ms测定、pro-klk7 lc/ms测定及ki(app)测定中的一种或多种方法测量生物学活
性。在一些实施例中，ic50值通过本文所述的测定方法进行测量。在一些实施例中，本发明的抗klk5抗体使klk5的生物学活性抑制至少50％，该生物学活性通过选自重组klk5直接活性测定、偶联pro-klk1荧光肽测定、偶联pro-klk7荧光肽测定、pro-klk1 lc/ms测定、pro-klk7 lc/ms测定和ki(app)测定中的一种或多种方法进行测量。在一些实施例中，生物学活性是klk5的丝氨酸蛋白酶活性。在一些实施例中，ic50值通过本文所述的测定方法进行测量。
[0739]
用于试验抗klk5抗体(或包含抗klk5结合臂的多特异性抗体)是否抑制klk5蛋白酶活性的非限制性测定方法如下：klk5直接功能测定可在室温下于384孔板中进行，最终反应体积为15μl。在测定缓冲剂(75mm tris，ph 8.0，150mm nacl，0.01％tween 20)中将抑制剂样品稀释至最终浓度的3倍。将抑制剂(例如，抗klk5抗体)或对照样品(5μl)加入板中，然后加入溶于测定缓冲剂中的5μl人klk5(seq id no:2)，最终浓度为0.5nm。40min后，加入溶于测定缓冲剂中的5μl boc-val-pro-arg-amc(bachem i-1120，31.3mm储备液水溶液)，最终浓度为50μm。加入底物后，使用光学模块fi 320 405在微板读数器(bmg labtech)中读取板，其中将增益设定为0％。每100s进行测量，持续约1.5小时。反应速率(表示为rfu/s)通过线性回归在线性范围内进行计算。反应速率可归一化至0％和100％活性对照值，并用4参数方程进行拟合以计算ic50值。对于二价抑制剂，可以将原始ic50乘以2。
[0740]
f.用于诊断和检测的方法和组合物
[0741]
在某些方面，本文提供的任何抗体均可用于检测生物样品是否存在抗原。如本文所用的术语“检测”，涵盖定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织(诸如皮肤组织)。
[0742]
在一个方面，提供了一种用于诊断或检测方法中的抗体。在另一方面，提供了一种检测生物样品中是否存在klk5和/或klk7的方法。在某些方面，该方法包括在允许抗体与其抗原结合的条件下，使生物样品与本文所述的抗klk5抗体或抗klk7抗体接触，并检测抗体与抗原之间是否形成复合物。此种方法可为体外或体内方法。在一些实施例中，选择患者接受本文所提供的抗体的治疗的方法包括确定患者样品中的klk5和/或klk7表达。
[0743]
在某些方面，提供了标记的抗klk7抗体。在某些方面，提供了标记的抗klk5抗体。在某些方面，提供了标记的多特异性抗klk5/klk7抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧游标记、发色标记、电子致密标记、化学发游标记，以及放射性标记)，以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素
32
p、
14
c、
125
i、3h和
131
i；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素(fluorescein)及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮；萤光素酶(luciferase)，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利no.4,737,456)；萤光素(luciferin)；2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)；辣根过氧化物酶(hrp)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如hrp、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)偶联；生物素/抗生物素蛋白；纺丝标记；噬菌体标记或稳定自由基。
[0744]
g.药物组合物
[0745]
在又一方面，提供了包含本文所提供的任何抗体的药物组合物，例如用于以下任
何治疗方法。在一个方面，药物组合物包含本文所提供的任何抗体和药用载体。在另一方面，药物组合物包含任一种本文提供的双特异性抗体和例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。
[0746]
本文所述的抗klk7抗体和/或抗klk5抗体和/或抗klk5/klk7抗体的药物组合物通过将具有所需纯度的一种或多种抗体与一种或多种任选的药用载体(remington's pharmaceutical sciences第16版，osol,a.编(1980))混合)，制成冻干制剂或水溶液的形式。药用载体在所用的剂量和浓度下对受治疗者一般无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)。本文中示例性药用载体进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人类可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuph20(halozyme,inc.)。某些示例性shasegp及用法(包括rhuph20)描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，shasegp与一种或多种另外的糖胺聚醣酶(诸如软骨素酶)组合。
[0747]
在一些实施例中，本文所提供的一种或多种抗体配制成用于皮下施用。在一些实施例中，本文所提供的一种或多种抗体配制成用于静脉内施用。在一些实施例中，本文所提供的一种或多种抗体配制成用于局部施用。
[0748]
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和wo 2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
[0749]
本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。例如，在一些实施例中，药物组合物包含抗klk7抗体与抗klk5抗体的组合。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
[0750]
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或粗滴乳液中。此类技术公开于remington's pharmaceutical sciences(第16版，osol,a.主编，1980)。
[0751]
可制备用于缓释的药物组合物。缓释制剂的合适实例包括含有多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，这些基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。
[0752]
用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
[0753]
h.治疗方法和施用途径
[0754]
本文提供的任何抗体均可单独或组合用于治疗方法中。
[0755]
在一个方面，提供了一种用作药物的抗klk7抗体。在一个方面，提供了一种用作药物的抗klk5抗体。在一个方面，提供了一种用作药物的多特异性抗klk5/klk7抗体。在一个方面，提供了一种用作药物的抗klk7抗体与抗klk5抗体的组合。在另一些方面，提供了用于治疗netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和/或酒糟鼻的此类抗体。在某些方面，提供了一种用于治疗方法中的抗klk7抗体。在某些方面，提供了一种用于治疗方法中的抗klk5抗体。在某些方面，提供了一种用于治疗方法中的多特异性抗klk5/klk7抗体。在某些方面，提供了一种用于治疗方法中的抗klk7抗体与抗klk5抗体的组合。在某些方面，本发明提供了用于治疗具有netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和/或酒糟鼻的疾病的个体的方法中的此类抗体，该方法包含将有效量的一种抗体或多种抗体施用于该个体。在一个此类方面，该方法进一步包括，例如，如下文所述向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)。
[0756]
在另一些方面，本发明提供了用于减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的抗klk7抗体和/或抗klk5抗体和/或多特异性抗klk5/klk5抗体。在某些方面，本发明提供了用于减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复个体的上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法中的抗klk7抗体和/或抗klk5抗体和/或多特异性抗klk5/klk5抗体，该方法包含将有效量的一种或多种抗体施用于该个体，以减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全和/或恢复上皮屏障。根据上述任一方面的“个体”优选地是人。
[0757]
在又一方面，本发明提供了抗klk7抗体和/或抗klk5抗体和/或多特异性抗klk5/klk5抗体在药物的生产和/或制备中的用途。在一个方面，该药物用于治疗netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和/或酒糟鼻。在又一方面，该药物用于治疗netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和/或酒糟鼻的方法中，该方法包含将有效量的药物施用于具有netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和/或酒糟鼻的个体。在一个此类实施例中，方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文所述的治疗剂。在又一方面，该药物用于减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复个体的上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子。在又一方面，该药物用于减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复个体的上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法中，该方法包含将有效量的该药物施用于该个体，以减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全和/或恢复上皮屏障。根据上述任一方面的“个体”可以是人。
[0758]
在又一方面，本发明提供了一种治疗netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和/或酒糟鼻的方法。在一个方面，该方法包含将有效量的有效量的抗klk7抗体和/或抗klk5抗体和/或多特异性抗klk5/klk5抗体施用于具有netherton综合征、哮喘、特应性皮炎、银屑病、嗜酸细胞性食管炎和/或酒糟鼻的疾病的个体。在一个此类方面，该方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文所述的治疗剂。
[0759]
在一些实施例中，提供了一种在患有内瑟顿综合征的个体中减轻皮疹和/或脱屑的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗klk7抗体和/或抗klk5抗体和/或多特异性抗klk5/klk5抗体。
[0760]
根据上述任一方面的“个体”可以是人。
[0761]
在又一方面，本发明提供了一种减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复个体的上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子的方法。在一个方面，该方法包含将有效量的抗klk7抗体和/或抗klk5抗体和/或多特异性抗klk5/klk5抗体施用于个体以减少上皮细胞炎症、减少上皮通透性、减少经皮水分流失、减少皮肤浸润、减少角化不全、恢复上皮屏障和/或减少皮肤炎症细胞因子。非限制性示例性皮肤炎症细胞因子包括il-8、tnfα、il-6、il-4和g-csf。在一个方面，“个体”为人。
[0762]
在又一方面，本发明提供了包含本文所提供的任何抗体的药物组合物，例如用于以上任何治疗方法。在一个方面，药物组合物包含本文所提供的任何抗体和药用载体。在另一方面，药物组合物包含任一种本文提供的双特异性抗体和例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。
[0763]
本发明的抗体可单独施用于或用于联合疗法。例如，联合疗法包括施用本发明的抗体并且施用至少一种另外的治疗剂(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)。在某些方面，联合治疗包含施用本发明的抗体并且施用至少一种另外的治疗剂诸如抗炎剂。在一些实施例中，抗炎剂经口施用。在一些实施例中，抗炎剂皮下施用。抗炎剂包括但不限于低剂量抗生素、类固醇、皮质类固醇、他克莫司、抗il4r抗体、tnf抑制剂、il-12/23抑制剂、il-17抑制剂和il-4受体抑制剂。非限制性示例性抗炎剂包括脱氧羟四环素、甲氨蝶呤、强的松、环孢菌素、霉酚酸酯、度普利尤单抗(dupilumab)、塞妥珠单抗、依那西普、阿达木单抗、英夫利昔单抗、戈利木单抗、优特克单抗、苏金单抗、依克珠单抗、布罗达单抗、阿巴西普、tidrakizumab-asmn、risankisumab-rzaa和古塞奇尤单抗(guselkumab)。
[0764]
在一些实施例中，例如，在酒糟鼻的治疗中，该另外的治疗剂为经口施用于的脱氧羟四环素。在一些实施例中，例如在特应性皮炎时，该另外的治疗剂为皮下施用的度洛单抗；和/或局部施用于的类固醇。在一些实施例中，例如，在酒糟鼻的治疗中，该另外的治疗剂选自局部施用的类固醇；经口施用的甲氨蝶呤；经口施用的环孢素；及通常皮下施用的tnf抑制剂。
[0765]
上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或单独的组合物中)，以及单独施用，在分开施用的情况下，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。在一个方面，本发明的一种或多种抗体的施用及另外的治疗剂的施用在彼此相距约一个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、二天、三天、四天、五天或六天内进行。在一个方面，在治疗的第1天将抗体和另外的治疗剂施用于患者。
[0766]
本发明的免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
[0767]
在一些实施例中，本发明的抗体经皮下施用。在一些实施例中，抗体每四周或每个月施用一次。在一些实施例中，本发明的抗体经静脉内施用。在一些实施例中，抗体每四周或每个月施用一次。在一些实施例中，当该抗体包含半衰期延长的取代诸如m428l(eu编号)和n434s(eu编号)时，抗体每8周施用一次。
[0768]
本发明的抗体将按负荷良好医疗实践的方式进行配制、给药和施用。此背景中考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的原因、递送药物的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。该抗体无需但可以任选地与目前用于预防或治疗所述疾病的一种或多种药剂一起配制。此类其他药物的有效量取决于医药组合物中存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。
[0769]
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种附加治疗剂联合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重度和病程、施用该抗体用于预防还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对该抗体的应答以及主治医师的酌处权。在一次或一系列的治疗中适当地对患者施用抗体。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。根据上述因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常应持续直至发生所需的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量的范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受两次至约二十次，或例如约六次剂量抗体)。可施用初始更高负荷剂量，然后施用一种或多种更低剂量。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定可以容易地监测该治疗的进展。
[0770]
在各种实施例中，用于本文的方法的抗klk5抗体可以被klk5拮抗剂取代，其中所述klk5拮抗剂抑制klk5蛋白酶活性。在各种实施例中，用于本文的方法的抗klk7抗体可以被klk7拮抗剂取代，其中所述klk7拮抗剂抑制klk5蛋白酶活性。在各种实施例中，用于本文的方法的双特异性抗klk5.klk7抗体可以被klk5/klk7拮抗剂取代，其中所述klk5/klk7拮抗剂抑制klk5蛋白酶活性和klk7蛋白酶活性。
[0771]
i.制品
[0772]
本发明的另一方面提供包含用于治疗、预防和/或诊断上述疾病的制品。制品包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、iv溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。该容器可容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的组合物组合，并且容器可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，该制品可以包括(a)第一容器，第一容器中含有包含本发明的抗体的组合物；以及(b)第二容器，第二容器中含有包含其他细胞毒性剂或其他治疗剂的组合物。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。替代性地或
另外地，制品还可包括第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
[0773]
iii.实例
[0774]
以下为本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
[0775]
实例1：抗klk7抗体的生成
[0776]
用人klk7(seq id no:4)对新西兰白兔进行免疫接种，并使用与已发表文献相关的改良方案对单b细胞进行分离。参见例如offner等人，plos one 9(2)，2014。改变的工作流程包括直接facs将igg huklk7 b细胞分选到单个孔中。利用elisa测定b细胞培养上清液与人klk7及无关对照蛋白的结合。裂解klk7特异性b细胞，立即在-80℃下冷冻保存，直至进行分子克隆。如前所述，将来自兔b细胞的各种单克隆抗体的可变区(vh和vl)克隆到提取的mrna的表达载体中。参见上文。单个重组兔抗体在expi293细胞中表达，后续使用蛋白质a纯化。获得～244个结合人及猕猴klk7两者的抗klk7抗体。克隆171个抗体并将其表达用于进一步表征。经纯化的抗klk7抗体与huklk7的结合亲和力、对huklk7的选择性和功能活性。
[0777]
抗体的结合亲和力通过biacore
tm
t200仪器进行测定。重组表达兔抗体。为实施动力学测量，在研究级protein a芯片(ge healthcare，usa)上捕获抗体，以达到约300ru。在25℃下，将人和食蟹猴klk7的十倍连续稀释液以30μl/min的流速注入hbs-p缓冲剂中。缔合速率(ka)和解离速率(kd)使用1:1langmuir结合模型(biacore
tm
t200评估软件2.0版)进行计算。解离常数(kd)通过比率kd/ka计算得出。
[0778]
表1显示了针对人klk7和食蟹猴klk7最有效的抗体子集的的解离速率结果，未观察到对huklk1、huklk4、huklk5或huklk11的结合，证实这些抗体具有特异性。
[0779]
表1
[0780]
克隆idhu klk7 kd(1/s)cy klk7 kd(1/s)5d10《1e-6《1e-67c7(14d10)《1e-62.08e-59c7《1e-63.66e-511d11《1e-61.06e-415a2《1e-63.90e-414h11《1e-6《1e-612f112.84e-54.95e-413a4《1e-6《1e-613c10《1e-61.78e-415e6《1e-67.65e-510c8《1e-61.97e-411h73.51e-41.53e-427e94.02e-33.06e-417b91.25e-36.96e-425b82.87e-54.01e-4
27d104.34e-49.75e-42-18d41e-51e-5
[0781]
室温下在384孔板(黑色，小体积圆底，corning#4514)中进行klk7直接功能测定，最终反应体积为15μl。在测定缓冲剂(75mm tris，ph 8.0，150mm nacl，0.01％tween 20)中将抑制剂样品稀释至最终浓度的3倍。将缺少抑制剂的反应以及与200nm最终sfti 21705(genentech，dmso中的10mm储备液；也称为sfti-klk7；序列gkclfsnppicfpn(seq id no:196)的反应；参见例如de veer等人，2017，j.investig.dermatol.，137:430-439)分别用作100％和0％活性对照。将抑制剂或对照样品(5μl)加入板中，然后加入测定缓冲液中的5μl人klk7(seq id no:4加上c末端flag标签；genentech)或5μl cyno klk7(seq id no:6加上c末端flag标签；genentech)中，使其最终浓度达到0.5nm(mca底物测定)。40min后，加入溶于测定缓冲液中的最终浓度为10μm底物的5μl mca-rpkpve-nval-wrk(dnp)(seq id no:121；bachem m-2110，dmso中的4.3mm储备溶液)。加入底物后，使用光学模块fi 320 405在微板读数器(bmg labtech)中读取板，其中将增益设定为0％。每100s进行测量，持续约1.5小时。反应速率(表示为rfu/s)通过线性回归在线性范围内进行计算。反应速率可归一化至0％和100％活性对照值，并用4参数方程进行拟合以计算ic50值。对于某些与二价抑制剂有关的数据，将原始ic50乘以2，如下文所述。
[0782]
通过在每个时间点测得的相对荧光单位(rfu)进行线性回归，计算出每个测定孔的初始速率。通常忽略前两个时间点。相对于无抑制和完全抑制对照的平均值计算控制活性的百分比。绘制这些控制活性百分比与抑制剂浓度的关系曲线，并使用4参数方程进行拟合，以确定ic50值。表2显示了人klk7和食蟹猴klk7对某些抗体克隆的抑制测定结果。在表2中，由于所有克隆都是二价的，因此未对ic50的二价进行校正。
[0783]
表2：使用mca肽底物对抗klk7抗体的ic50，在ic50中未考虑二价(图1a和b)
[0784]
克隆idhu klk7(0.5nm)ic50(nm)cy klk7(0.3125nm)ic50(nm)5d100.15
±
0.010.18
±
0.0097c7(14d10)0.11
±
0.0040.07
±
0.0069c71.19
±
0.040.47
±
0.01611d110.12
±
0.0040.09
±
0.00415a20.2
±
0.010.90
±
0.08814h110.11
±
0.0040.15
±
0.00412f110.31
±
0.0131.58
±
0.1813a40.79
±
0.020.51
±
0.04613c100.12
±
0.0050.51
±
0.02315e60.1
±
0.010.25
±
0.00810c80.28
±
0.020.21
±
0.00911h70.12
±
0.010.13
±
0.00527e90.28
±
0.020.18
±
0.00617b91.59
±
0.183.37
±
1.2625b80.24
±
0.010.17
±
0.011
27d100.43
±
0.052.98
±
0.565
[0785]
实例2：抗klk7抗体的人源化
[0786]
按照实例1所述进行筛选后，选择具有最佳抑制活性的17种抗体进行进一步表征。选择具有最强结合亲和力、抑制活性且生产问题最少(14h11)的抗体进行人源化。首先通过用s取代c35a以消除未配对的半胱氨酸，对抗体14h11重链可变区(seq id no:116)进行修饰，得到抗体14h11c(vh,seq id no:13；vl seq id no:14)。
[0787]
按照以下方法对兔单克隆抗体14h11c进行人源化。根据kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service，national institutes of health，bethesda,md.(1991)进行残基编号。
[0788]
在14h11c人源化过程中构建的变体以人igg1的形式进行评估。将vl结构域中来自兔抗体的高变区的位置24-34(l1；seq id no:10)、50-56(l2；seq id no:11)和89-97(l3；seq id no:12)移植到kv1d-39*01框架中；并将vh结构域中的31-35b(h1；seq id no:7)、50-65(h2；seq id no:8)和95-102(h3；seq id no:9)移植到人hv3-53*01框架中。另外，将来自兔抗体的所有vl和vh游标位置移植到其相应的人种系框架中。所有兔氨基酸都位于游标位置的移植物称为l1h1(hu.14h11c.l1h1；seq id no:15(vh)和31(vl))。
[0789]
人源化抗体的结合亲和力通过biacore
tm
8k spr仪器进行测定。为实施动力学测量，在研究级protein a芯片(ge healthcare)上捕获抗体，以达到约300ru。在37℃下，将人klk7的十倍连续稀释液以100μl/min的流速注入hbs-p缓冲剂中。缔合速率(ka)和解离速率(kd)使用1:1langmuir结合模型(biacore insight评估软件2.0版)进行计算。解离常数(kd)通过比率kd/ka计算得出。
[0790]
比较了hu.14h11c.l1h1抗体与其亲本克隆的结合亲和力。将hu.14h11c.l1h1抗体的兔游标位置转换回人残基，以评估每个兔游标位置对hklk7的结合亲和力的贡献。制备三个附加轻链(l2:l1 ala43(seq id no:32)、l3:l1 phe71(seq id no:33)和l4:l1 ala43 phe71(seq id no:34))和九个附加重链(h2:h1 val2(seq id no:16)、h3:h1 val48(seq id no:17)、h4:h1 ser49(seq id no:18)、h5:h1 arg71(seq id no:19)、h6:h1 asn73(seq id no:20)、h7:h1 leu78(seq id no:21)、h8:h1 tyr91(seq id no:22)、h9:h1 gln105(seq id no:23)，以及h10：游标位置无兔残基(seq id no:24))。见图1a-1b。根据上文所述变体抗体的结合亲和力评估(数据未显示)，确定轻链上的tyr71(l2；seq id no:32)和重链上的gln2和pro105(h11；seq id no:29)为重要的兔游标残基。嵌合14h11c结合的kd小于1pm，而hu.14h11c.l2h11结合的kd小于0.4pm。
[0791]
表3.人源化抗klk7抗体的亲和力
[0792][0793]
实例3：抗klk5抗体的亲和力优化
[0794]
为提高抗klk5抗体hu.9h5.l4h14和hu.10c5.l5h28的亲和力，分别产生544和576单点突变体。利用表面等离子体共振对所得的抗体进行筛选，并根据解离速率进行排序。参见图4(hu.10c5.l5h28变体)和图5(hu.9h5.l4h14变体)。hu.10c5.l5h28中仅有五处突变，其导致解离速率变慢。它们是lc.s34k(seq id no:54)、lc.f92y(seq id no:55)、lc.s95f(seq id no:56)、hc.g33p(seq id no:105)及hc.n53v(seq id no:52)。见图2a-2b。对于hu.9h5.l4h14，仅四处突变的解离速率慢于亲本抗体：lc.h89v(seq id no:88)、lc.s95y(seq id no:89)、hc.g54a(seq id no:81)及hc.g98q(seq id no:82)。见图3a至图3b。
[0795]
为鉴定变体的良好组合，生成带有人igg1 fc的单臂(oa)单价抗体，其兼具单独和组合的突变集。通过表面等离子体共振表征鉴定良好的组合。表4-7显示了单臂(oa)单价抗体的动力学特性。
[0796]
表4.人klk5的hu.9h5.l4h14变体的亲和力
[0797][0798]
表5.食蟹猴klk5的hu9h5.l4h14变体的亲和力
[0799][0800]
表6.人klk5的hu10c5.l5h28变体的亲和力
[0801]
[0802][0803]
表7.食蟹猴klk5的hu10c5.l5h28变体的亲和力
[0804][0805]
图6显示了人klk5(图6a)和食蟹猴klk5(图6b)的所示hu.10c5.l5h28变体的表面等离子体共振记录曲线。图7显示了人klk5(图7a)和食蟹猴klk5(图7b)的所示hu.9h5.l4h14变体的表面等离子体共振记录曲线。
[0806]
实例4：抗klk5/klk7双特异性抗体的生成和表征
[0807]
为选择良好的10c5.l5h28变体组合以与双特异性抗体中的抗klk7臂配对，评估了每种变体的klk5抑制活性、杆状病毒结合测定中的非特异性结合以及与单个细胞中的抗klk7臂共表达时的正确双特异性。每种变体均构建有前文所述的突变，以增强单个细胞双特异性组装的正确链配对。参见dillon等人，mabs 9(2):213-230(2017)。抗klk5 lc包含q38e和v133k，并且hc包含q39k和s183e。抗klk7 lc包含q38k和v133e，并且hc包含q39e和s183k。
[0808]
所有单臂抗klk5抗体变体在klk5抑制测定均表达出相似的效价，ic50范围为1.14nm至2.30nm(数据未显示)。
[0809]
大致如hotzel等人(mabs 4(6):753-760(2012))所述，使用杆状病毒颗粒在elisa中测量每种抗klk5抗体变体的非特异性结合。
[0810]
在杆状病毒结合测定后，由于具有较高的非特异性结合，消除了两种变体(n53v/s34k及n53v/s34k/f92y/s95f)，这可能导致不良的药物代谢动力学特性。参见表8和9。
[0811]
表8：hu10c5.l5h28变体的杆状病毒结合elisa
[0812]
样本bv elisavh/vl seq id
hu.10c5.l5h28.wt0.2250/51hu.10c5.n53v0.3852/51hu.10c5.n53v.s34k1.8152/54hu.10c5.n53v.f92y0.1952/55hu.10c5.n53v.s95f0.2852/56hu.10c5.n53v.s34k f92y0.2952/57hu.10c5.n53v.s34k s95f0.2952/58hu.10c5.n53v.f92y.s95fn.d.52/59hu.10c5.n53v.s34k.f92y.s95f0.4652/60
[0813]
表9：hu.9h5.l4h14变体的杆状病毒结合elisa
[0814][0815]
评估了每种变体在hek293细胞中共表达时与抗klk7臂正确配对的能力。如表10所示，所有带有lc.s34k的变体均表达出较差的组装特性。
[0816]
表10.质谱法测定单细胞生产中双特异性的正确率(％)
[0817][0818]
根据结合的特性，选择含有q39k/q38e突变的hu.10c5.l5h28.n53v.f92y(vh,seq id no:53；vl,seq id no:62)作为抗klk5臂与含有q39e/q38k突变的hu14h11c.l2h11(vh，seq id no:30；vl，seq id no:38)抗klk7臂进行配对。higg1 n297g产生了两种版本的双特异性抗体，其具有减弱的效应子功能。其中一个版本包含两处突变(m428l/n434s)，已显示出能够延长抗体在体内的半衰期。参见zalevsky等人，nature biotech，2010，28:157-9；ko等人，nature，2014，514:642-5；gaudinski等人，plos medicine，2018，15:e1002493。
[0819]
确定了含有和不含m428l/n434s(“ls”)突变的抗klk5/klk7双特异性抗体与人和食蟹猴klk5和klk7的亲和力。
[0820]
表11.人和食蟹猴klk5的双特异性抗体的亲和力
[0821][0822][0823]
表12.人和食蟹猴klk7的双特异性抗体的亲和力
[0824][0825]
使用klk7和klk5直接功能测定法测定双特异性的活性，大致如实例1中所述。对于klk5功能测定，将实例1中的测定改变为使用人或食蟹猴klk5、9分别为seq id no:2和101)代替klk7以及最终浓度为50μm的底物boc-val-pro-arg-amc(bachem i-1120，31.3mm储备水溶液)。将200nm spink9.sre.fc(seq id no:197；genentech；参见例如brannstrom等人，2012，biol.chem.393:369-377)用作0％活性对照。结果示于图13及图14中。
[0826]
表13：抗klk5/klk7双特异性抗体和亲本单特异性抗体对人klk5和klk7的ic50，在ic50中校正了二价性(amc＝boc-val-pro-arg-amc；mca＝mca-rpkpve-nval-wrk(dnp))
[0827][0828][0829]
表14：抗klk5/klk7双特异性抗体和亲本单特异性抗体对食蟹猴klk5和klk7的ic50，在ic50中校正了二价性(amc＝boc-val-pro-arg-amc；mca＝mca-rpkpve-nval-wrk(dnp))
[0830][0831]
实例5：klk5和klk7在特应性皮炎、酒糟鼻及银屑病中的表达
[0832]
利用免疫化学法测定klk5在人酒糟鼻及特应性皮炎样品中的表达。如图8所示，与正常皮肤相比，人酒糟鼻和特应性皮炎中的klk5蛋白升高。
[0833]
为确定klk7是否也在人皮炎条件下表达，使用一种反义rna探针进行原位杂交，以观察klk5及klk7的表达。图9显示，与正常皮肤相比，特应性皮炎、酒糟鼻和银屑病中的代表性klk7 mrna染色。图10显示，klk5(10a)及klk7(10b)mrna在人皮肤中表达出相似的解剖表达，并且在特应性皮炎、酒糟鼻和银屑病中均有所上调。spink5表达的增加在特应性皮炎或酒糟鼻中不显著，在银屑病中则比较显著。图10中的数据显示了病理学家获得的双盲定量分析结果。
[0834]
实例6：皮内注射klk5或klk7增加经皮水分流失
[0835]
为测定klk5或klk7是否直接促进上皮屏障失调并增加经皮水分流失，将2μg重组klk5或klk7皮内注射到balb/c小鼠的背部皮肤中。
[0836]
如图11所示，在注射后6小时，如通过便携式皮肤vapometer(delfin technologies)测得，接受klk5及klk7注射的动物的经皮水分流失均有所增加。这些数据表明，klk5和klk7均可促进上皮通透性的增加。
[0837]
实例7：抑制klk5和klk7以改善小鼠炎性皮炎
[0838]
生成替代抗鼠klk5和抗鼠klk7抑制抗体，以测试抑制klk5和klk7对鼠特应性皮炎的疗效。通过sds和金黄色葡萄球菌protein a进行局部加工可诱导鼠特应性皮炎。然后，对患有炎性皮炎的小鼠腹膜内注射250μg同种型对照(抗gp120)、抗鼠klk5抗体、抗鼠klk7抗体或抗klk5及抗klk7抗体的组合。鼠spink5-fc融合蛋白在本文用作多种klk(包括klk5、klk7及klk14)的非特异性抑制剂。
[0839]
如图12所示，虽然单独抑制klk5或klk7可在日常皮炎临床分数(12a)、总终末特应性皮炎分数(12b)和auc皮肤分数(12c)方面提供中等程度的保护，但同时抑制klk5和klk7提供了与spink5-fc相似的卓越治疗效果。由于spink5在抑制klk5和klk7之外还抑制其他klk，因此这些数据表明抑制klk5和klk7足以获得预期治疗效果。
[0840]
炎性特应性皮炎与t细胞浸润和il-13产生相关。中和il-13可改善鼠动物模型和人特应性皮炎患者的特应性皮炎。在第二项实验中，将抗il-13抗体用作sds/金黄色葡萄球
菌protein a特应性皮炎模型中的阳性对照。如图13所示，抗klk5和抗klk7抗体的组合可降低总终末ad分数、减少经皮水分流失(tewl)并降低组织学疾病严重程度分数，达到与抗-il-13抗体相似的程度。图14显示了代表性苏木精和曙红染色结果，表明抗klk5和klk7抗体的组合可减少皮肤炎症及角化不全，其程度与抗il-13抗体相似。
[0841]
综上，这些结果表明klk5及klk7在促进上皮屏障通透性方面具有冗余作用。因此，与单独抑制klk5或klk7相比，联合抑制klk5和klk7有望改善皮炎临床分数、皮肤屏障功能及组织病理学表达。
[0842]
实例8：使用抗mklk5/mklk7双特异性抗体治疗或抗mklk5抗体/抗mklk7抗体联合治疗改善spink5缺失小鼠的皮疹及鳞屑
[0843]
对spink5 f/f cre-ert2 小鼠腹膜内注射16mg/kg、8mg/kg、或4mg/kg他莫昔芬以删除spink5基因。在他莫昔芬治疗前一天，抗鼠klk5抗体(每只小鼠2.5mg)和抗鼠klk7抗体(每只小鼠0.5mg)或同种型对照抗体(每只小鼠2.5mg)。使用与抗mklk7抗体相比过量的抗mklk5抗体，因为确定抗mklk5抗体的效力比抗mklk7抗体低100倍，其ic
50
为4.78nm，而抗mklk7抗体的ic
50
为0.48nm。在注射他莫昔芬后6天分析背部皮肤。spink5 f/f cre-ert2阴性小鼠也使用16mg/kg他莫昔芬作为对照物进行治疗。
[0844]
注射后6天的小鼠背部皮肤显示于图16a至16d中。使用同种型对照物治疗的spink5缺失小鼠的皮肤变得干燥、起屑、发炎和变红。通过抗mklk5抗体和抗mklk7抗体与不同剂量他莫昔芬的联合注射，此类外部netherton综合征样症状得到明显改善。
[0845]
将小鼠的背部皮肤于磷酸盐缓冲盐水中均质化以制备皮肤溶解产物。使用bio-plex多重免疫测定(biorad)分析该溶解产物的细胞因子水平。
[0846]
细胞因子测定的结果显示于图17a至17e中。与同种型对照抗体治疗相比，通过抗mklk5/mklk7双特异性抗体治疗降低了细胞因子il-8(17a)、tnf-α(17b)、il-6(17c)、il-4(17d)和g-csf(17e)的水平。
[0847]
图18显示来自使用16mg/kg他莫昔芬以及同种型对照抗体或联合的抗mklk5抗体/抗mklk7抗体治疗的spink5缺失小鼠的苏木精和曙红染色皮肤的代表性横截面。来自使用同种型对照抗体治疗的spink5缺失小鼠的皮肤显示明显的白血球浸润、上皮层的增厚以及表皮脱皮，而mklk5及mklk7的联合阻断明显减少了病理学临床特征。
[0848]
实例9：抗klk5/klk7双特异性抗体抑制klk5诱导的表皮通透性及klk7诱导的表皮通透性
[0849]
将人表皮角质细胞种植在涂覆有胶原的组织培养trans-well板中，并且使用1.5mm cacl2分化2天。分化后，将cacl2减少至0.1mm。该单层的最上侧使用klk5(5μg/ml)、klk7(5μg/ml)、klk5 klk7(各5μg/ml)、或klk5 klk7(各5μg/ml) 100μg/ml抗klk5/klk7双特异性抗体(hu.10c5vy.hu14h11c.l2h11 ls)加工72h或96h。使用伏特/奥姆计在每个时间点测量跨上皮电阻(teer)。
[0850]
结果显示于图22a至22b中。重组klk5、klk7、或klk5/klk7的加入一起诱导了表皮通透性，其通过跨上皮电阻来量化。抗klk5/klk7双特异性抗体明显降低了klk5诱导的表皮通透性以及klk7诱导的表皮通透性。
[0851]
实例10：结合klk7的抗klk7抗体14h11c的结构确定
[0852]
重组klk7残基i30-r253(seq id no:4)表达于哺乳动物表达系统(cho细胞)中，其
中his标签位于n末端，随后为改造的介于该his标签与klk7之间的肠激酶裂解位点。使用1mg/ml的奇夫碱(kifunensine)将cho细胞与endoh共表达。获取该表达介质，并且如第一步那样使用ni-nta纯化。自该ni-nta管柱洗出的蛋白质在superdex 200(s200)尺寸排阻柱上进一步纯化。通过使用肠激酶加工过夜而移除klk7上的his标签，并且于sp hp阳离子交换柱上使用25mm hepes ph7.8以及0-800mm nacl的梯度进一步纯化klk7。
[0853]
将包括抗klk7抗体rb.14h11c的重链和轻链的fab片段在hek293细胞内表达。将his标签加至该重链的c末端以便使用ni-nta树脂并且随后通过pbs中的尺寸排阻层析进行纯化。重链和轻链的序列分别显示于seq id no:198及199中。为了该实例的目的，将序列从信号序列开始编号。显示于seq id no:198中的fab重链因此从20开始编号(氨基酸20-256)，而显示于seq id no:199中的fab轻链因此从23开始编号(氨基酸23-237)。
[0854]
将klk7与14h11c fab以1:1.5klk7:fab的莫耳比率混合，复合物通过尺寸排阻层析在25mm hepes ph 7.8、150mm nacl中进行纯化。将包含该klk7:fab复合物的峰在赖氨酸上甲基化(methods in structure,2006,14,1617-1622)，并且在s200柱上使用25mm tris ph 7.8和150mm nacl进一步纯化。将该复合物浓缩至10mg/ml，并且使用1μl蛋白质及1μl的10％peg 4k和0.2m硫酸铵来悬滴生长晶体。晶体于3天后出现并且在另外2至3天后成熟。然后获取晶体进行数据收集。
[0855]
根据标准方法，使用高级光源(advanced light source(berkeley,ca))的各种同步x射线辐射在100克耳文的低温冷却条件下收集x射线衍射数据。使用数据加工软件xds加工并且还原衍射图像(kabsch,w.xds.acta cryst.d66,125-132(2010))。使用分子置换技术，以程序phaser生成模型。使用人klk7的结构(proc natl acad sci u s a 104:16086-16091(2007))和fab抗体模型作为研究模型。结构使用程序coot进行反复的模型调整，并且使用phenix进行改良。将模型改良为可接受的r值和r自由值以及ramachandran统计值(通过molprobity计算)。klk7的氨基酸残基编号基于胰凝乳蛋白酶编号系统(对于klk7，proc natl acad sci u s a104:16086-16091(2007)；pdb代码2qxi用作参考；也称为“标准蛋白酶编号”)。
[0856]
结合人klk7的14h11c fab的结构显示于图20a至20b中。结合klk7的完全fab示于图20a中，其中仅重叠klk7。图20b显示klk7-fab界面。
[0857]
表15列出了包括在fab-klk7界面中的14h11c重链氨基酸和klk7氨基酸。
[0858]
表15：介于14h11c重链与klk7之间的界面残基
[0859][0860][0861]
表16列出了包括在fab-klk7界面中的14h11c轻链氨基酸和klk7氨基酸。
[0862]
表16：介于14h11c轻链与klk7之间的界面残基
[0863][0864]
表17列出了在该结构中形成氢键的14h11c重链氨基酸和klk7氨基酸，而表18列出了形成盐桥的14h11c重链氨基酸和klk7氨基酸。
[0865]
表17：14h11c重链与klk7之间的氢键
[0866]
[0867][0868]
表18：14h11c重链与klk7之间的盐桥
[0869][0870]
表19列出了在该结构中形成氢键的14h11c重链氨基酸和klk7氨基酸。
[0871]
表19：14h11c轻链与klk7之间的氢键
[0872][0873]
基于该晶体结构，抗klk7抗体rb.14h11c结合klk7的不连续表位，其界面包含klk7(seq id no:4)的区域r71-n82、k152-s158和q211-k222。rb.14h11c与klk7的氨基酸h72、p73、g74、s76、q78、n82、n157、k211和t213形成氢键和/或盐桥，其根据seq id no:4编号(h91、p92、g93、s95、q97、n101、n178、k233和t235，其通过胰凝乳蛋白酶编号)。
[0874]
如图20c中所示，14h11c fab结合klk7的170s环(胰凝乳蛋白酶编号)导致了170s环中的协同构象变化，其中l176(seq id no:4中的l155)和d174(seq id no:4中的d153)的构象变化最明显。l176为天然状态下的klk7的疏水核心，其面向fab(并且通过与fab的相互作用而稳定化)。由于与fab的空间冲突，d174移动至更接近底物结合区的区域内，导致y172(seq id no:4中的y151)和w215(seq id no:4中的w192)的移动，与180s环冲突，导致180s环及220s环的展开以及底物结合位点的收缩。据信这些构象变化导致klk7酶的去活化。
[0875]
尽管为了清楚理解起见，通过图标和实例的方式对上述发明进行了详细描述，但是这些描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均以引用的方式明确纳入其全部内容。
[0876]
iv.特定序列表
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[0910][0911]
再多了解一些
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