一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTHA0571及其应用

一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)目前被用于谷氨酸、赖氨酸、支链氨基酸、维生素d、有机酸等的生产，在食品、医药、农业等领域得到了广泛应用。谷氨酸棒状杆菌不仅是一种重要的工业微生物，其常被当作微生物细胞工厂，利用葡萄糖、蔗糖、木糖等碳源生产氨基酸、有机酸、维生素及燃料乙醇等，已经成为一种重要的生物平台。
3.谷氨酸棒杆菌最适宜的培养温度一般在26℃-37℃，正常发酵生产一般控制温度在32℃左右，要控制谷氨酸棒杆菌发酵温度为32℃，需采取一系列的降温措施，比如循环水冷却、冷冻水冷却等，尤其在夏季高温季节，环境温度普遍较高，谷氨酸棒杆菌发酵过程中需要消耗大量冷媒介质，往往还达不到冷却效果，造成发酵异常，不仅冷却系统增加大量成本，而且发酵异常会直接影响产量，无形中增加了生产经营成本。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571及其应用。
5.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571，所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571由谷氨酸棒杆菌启动子和耐热功能基因组成，所述谷氨酸棒杆菌启动子为强启动子ptuf，所述耐热功能基因为来源于嗜热栖热菌cicc10647中的ttha0571基因；所述ttha0571基因序列如seq no.1所示，所述强启动子ptuf基因序列如seq no.2所示。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571的应用，所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571在提高谷氨酸棒杆菌耐热性中的应用。
7.优选的技术方案为：将谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571导入质粒然后在谷氨酸棒杆菌内表达。
8.优选的技术方案为：将谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571整合到谷氨酸棒杆菌基因组上。
9.优选的技术方案为：对带有谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571的谷氨酸棒杆菌进行高温驯化，提高谷氨酸棒杆菌的耐热性。
10.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
11.1、本发明通过构建大量谷氨酸棒杆菌耐热元器件，筛选到一种耐热性效果较好的谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571，并通过在谷氨酸棒杆菌中应用提高菌种的培养温度，可以降低能源消耗和生产成本，具有明显的生产实际应用价值，同时也为谷氨酸棒杆菌的抗逆性研究和抗逆元器件的构建设计提供很好的科学参考价值。
12.2、本发明中的谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571，可以使谷氨酸棒杆菌的热稳定性大大提高，增强菌株的耐热性，应用于工业化生产菌株中可以大大降低发酵过程中冷却水的能耗，降低生产成本，具有较好的工业应用前景。
附图说明
13.图1高温(42℃)培养后菌体生长情况对照状况一。
14.图2高温(42℃)培养后菌体生长情况对照状况二。
具体实施方式
15.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
16.请参阅图1-2。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
17.实施例1：一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571及其应用
18.谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571的构建方法，包括下列步骤：
19.步骤1：将嗜热栖热菌cicc10647活化后接种于液体培养基中，然后置于70-80℃的摇床中培养20-28h，得到种子培养液；将种子培养液接种于液体培养基中，取处于对数生长期的菌液提取基因组；
20.液体培养基成分：酵母粉4.0g；聚蛋白胨8.0g；nacl2.0g；蒸馏水1l；调ph值到7.0。
21.细菌基因组提取方法：
22.使用细菌基因组dna提取试剂盒(wizard genomic dna purification kit a1120)，按照以下步骤进行操作：
23.(1)从-80℃取出经过预处理好的谷氨酸棒杆菌细胞，向每管中加入600μl的细胞裂解液，并通过温柔的颠倒翻转或使用移液器吹打，使细胞均匀分散于裂解液中，将ep管置于80℃恒温水浴中孵育5min加速菌体裂解。
24.(2)将裂解体系冷却到室温，向每管加入2μl rna酶溶液(使用试剂盒提供的或自行配制浓度为50mg/ml的rnase溶液)，37℃水浴孵育30-90min。
25.(3)向每管加入200μl蛋白质分离液，并迅速通过颠倒翻转使溶液得到充分混合，待出现明显的白色絮状沉淀后，将1.5ml ep管置于冰浴2-3min，在4℃条件下离心，时间10-20min，转速10000-13000r/min，将400-600μl上清液转移到一个新的1.5ml ep管中。
26.(4)向1.5ml ep管中加入等体积的异丙醇或二倍体积的无水乙醇，温柔地颠倒翻转使溶液得到充分混合，此时基因组dna会以肉眼可见的形式析出，通过观察可以直观地判断基因组dna的提取是否成功。
27.(5)将1.5ml ep管在4℃条件下离心1min，转速12000r/min，弃上清液。
28.(6)向1.5ml ep管中加入700μl浓度为70％的乙醇溶液(-20℃)，温柔地颠倒翻转，使基因组dna充分地接触乙醇溶液，在4℃条件下离心，时间1min，转速12000r/min，弃上清液，并重复本步骤的操作2-3次。
29.(7)小心地用移液器将残留的乙醇溶液尽可能地吸取干净，将1.5ml ep管敞口静置1-2h使乙醇充分挥发。
30.(8)向1.5ml ep管中加入40-100μl缓冲溶液(ph 7.0-8.0)或ddh2o，室温静置1h或4℃静置12h，使基因组dna充分溶解。
31.(9)用移液器将10μl基因组dna溶液转移到一个新的1.5ml ep管中用于质控分析，剩余的溶液置于-80℃保存。
32.步骤2：以步骤1提取得到的基因组为模板，以上引物ttha0571-1和下引物ttha0571-2进行pcr扩增；
33.上引物ttha0571-1：
[0034]5’‑
cgaagtccaggaggaaagctt atgctggagcgccacgac-3’；
[0035]
下引物ttha0571-2：
[0036]5’‑
tatcatcacagagtgcaaccagatc ctacgcctcctttaggggaag-3’。
[0037]
步骤3：将谷氨酸棒杆菌atcc 13032活化后接种于液体lb培养基中置于30-34℃摇床中培养20-28h，得到种子培养液；将种子培养液接种于液体lb培养基中，取处于对数生长期的菌液提取基因组；基因组提取方法同上。
[0038]
步骤4：以步骤3提取得到的基因组为模板，以上引物ptuf-1、下引物ptuf-2进行pcr扩增；
[0039]
上引物ptuf-1：
[0040]5’‑
tgttgacctcaaatatcggaagtacaagcgcgtgccctctttgctgcag-3’；
[0041]
下引物ptuf-2：5
’‑
gtcgtggcgctccagcat aagctttcctcctggacttcg-3’。
[0042]
步骤5：启动子ptuf与耐热功能基因ttha0571的dna片段连接；使用的引物对为：上引物up-1、下引物down-2；
[0043]
上引物up-1：5'-accacgtcgatgtcttttacctg-3'；
[0044]
下引物down-2：5'-gagaagttagcaaagccacgagtag-3'。
[0045]
步骤6：谷氨酸棒杆菌结合转化。
[0046]
步骤2中，耐热功能基因ttha0571的pcr扩增体系：配制50μl酶切反应体系，首先向0.2ml的pcr管中加入20的μl ddh2o；加入10μl的5
×
primestar buffer溶液；加入4μl的dntp溶液；加入上引物ttha0571-1、下引物ttha0571-2溶液各2μl；加入总dna不超过200ng的模板；加入0.5μl primestar hs dna polymerase溶液；用ddh2o将反应体系补足50μl并用移液器反复吹吸混匀；耐热功能基因ttha0571的pcr扩增参数为：95℃预变性5min；30个循环包括98℃变性10s、55℃退火5s和72℃延伸30s；72℃延伸10min。
[0047]
步骤4中，启动子ptuf的pcr扩增体系：配制50μl酶切反应体系，首先向0.2ml的pcr管中加入20μl的ddh2o；加入10μl的5
×
primestar buffer溶液；加入4μl的dntp溶液；加入上引物ptuf-1、下引物ptuf-2溶液各2μl；加入总dna不超过200ng的模板；加入0.5μl的primestar hs dna polymerase溶液；用ddh2o将反应体系补足50μl并用移液器反复吹吸混匀；启动子ptuf的pcr扩增参数为：95℃预变性5min；30个循环包括98℃变性10s、55℃退火
5s和72℃延伸30s；72℃延伸10min。
[0048]
步骤5中，配制50μl酶切反应体系，首先向0.2ml的pcr管中加入20μl的ddh2o；加入10μl的5
×
primestar buffer溶液；加入4μl的dntp溶液；加入上引物up-1、下引物down-2溶液各2μl；加入1μl的up模板、2.5μl的ptuf模板(步骤4的扩增产物)、0.9μl的ttha0571模板(步骤2的扩增产物)、1.7μl的down模板；加入0.5μl primestar hs dna polymerase溶液；用ddh2o将反应体系补足50μl并用移液器反复吹吸混匀；pcr仪参数设置为：95℃预变性5min；30个循环包括98℃变性10s、55℃退火5s和72℃延伸2min；72℃延伸10min。
[0049]
up模板序列：
[0050]
accacgtcgatgtcttttacctgctcgatcacacaaccagccctcagatcacggtgctgccgcactcaatggattatttcgatcaaacgcgcagcgatgctgttatggctgccatcattgagcaaaaccctgcgttcgcagaaattaaaggctcacccattacaaccgcagatgtagccctccacaatctcggtgacaccaacgccaaccgacgctggcagtctaacgtgctgcttgcccggctactcgggggtattagtgtgcgcggagaggtacctgagcaccagagccacaaccatctcgccaagcagtttgccgaggcaaccttggtcaccagggacttcgatgtgaattatgatccaacaagcgctcacccttttactgctggcttcaactcgatcaactatgacaccaccttgctcagcctgtacttcgcaatgttgacctcaaatatcggaagtac。
[0051]
down模板序列：
[0052]
gatctggttgcactctgtgatgatattcgcggtgtacttgatcgaggtttagagatctcatctccgaatcatcatgagatggtggatgctatgcgcaagcagctgcactatattcaggcattttaccgtgcctggggacccattcaacgccgcttcaatgacgctgacccagcggtgacccatccgcatctcacagtgatctacccaccgctcacccctgcatccgcagagaaattcaacaagatcacctcagtcgctgctgtgagcaagcgcccaaccaccctgccgtatttccgtgcagatggttcacctactcgtggctttgctaacttctc。
[0053]
步骤6具体包括：配制20μl体外连接体系，首先向0.2ml pcr管中加入5μl的ddh2o；加入4μl的5
×
ce butter溶液；加入pk18mobrpsl质粒50～200ng；加入步骤5得到的连接好的目的dna片段20～200ng；加入exnasetmii 2μl；用ddh2o将反应体系补足20μl；37℃水浴30min；加入e.coli dh5α感受态细胞，冰浴20min；置于42℃水浴锅，热激60s，冰浴2min；在无菌ep管中加入900μl预热的soc复苏液，37℃、220r/min，培养1h；取100μl菌液，涂布于卡那霉素抗性平板，37℃培养12h；随机挑选平板中的单菌落，进行菌落pcr鉴定，筛选正确的目的菌株，命名为大肠杆菌dh5α-pk18mobrpsl-ptuf-ttha0571，将平板置于37℃培养过夜；将鉴定正确的菌株接种于带卡那霉素的lb液体培养基中，培养10h，离心菌体提取质粒；将2mm电转杯在冰上预冷约20min，待冷冻的谷氨酸棒杆菌atcc13032感受态细胞融化和质粒加入其中，都加入电转杯，冰浴20min；电转后，用900μl预热的bhis复苏液重悬电转杯中的菌体，转入ep管内，46℃热击6min，在32℃、220r/min条件下复苏2h，涂布含有卡那霉素抗性的bhi平板，32℃培养24h；用牙签随机挑选平板中的单菌落，先划于固体培养基平板中，再将该牙签上的菌落溶于配制好的菌落pcr反应体系中，将反应体系进行菌落pcr扩增，通过pcr鉴定结果筛选正确目的菌株，命名为谷氨酸棒杆菌atcc 13032-pk18mobrpsl-ptuf-ttha0571，将平板置于32℃培养过夜；将鉴定正确的菌株接种于带卡那霉素的bhi液体培养基中，培养10～12h；吸3～5μl菌液至900μl bhi复苏液中，吸取100μl上述复苏液至链霉素抗性平板涂布，32℃培养24h；用牙签随机挑选平板中的单菌落，先划于固体培养基平板中，再将该牙签上的菌落溶于配制好的菌落pcr反应体系中，将反应体系进行菌落pcr扩增，通
13032提高了18.72％，atcc 13032-pk18mobrpsl-ptuf-ttha0571菌体在高温下(42℃)的生长情况明显优于atcc 13032。
[0071]
谷氨酸棒杆菌atcc 13032-ptuf-ttha0571高温驯化
[0072]
将谷氨酸棒杆菌atcc 13032-ptuf-ttha0571从甘油管划线至平板活化，32℃培养24h，经过多次高温(42℃)培养驯化后，将培养后的发酵液进行梯度稀释，吸取50μl梯度稀释后的发酵液涂布平板，32℃培养16h，从平板中挑选菌体形态和生长良好的单菌落进行保藏。将经过高温驯化后的菌株命名为谷氨酸棒杆菌atcc 13032-ptuf-ttha0571变种。将谷氨酸棒杆菌atcc 13032-ptuf-ttha0571变种、谷氨酸棒杆菌atcc 13032-ptuf-ttha0571、谷氨酸棒杆菌atcc 13032在42℃相同条件下进行培养对照试验，培养24h后检测od
600
值，od
600
值的结果显示atcc 13032-ptuf-ttha0571变种＞atcc 13032-ptuf-ttha0571＞atcc 13032，表明经过高温驯化后，谷氨酸棒杆菌atcc 13032-ptuf-ttha0571变种的耐热性得到进一步加强。
[0073]
本发明所述的谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571及其在谷氨酸棒杆菌中的应用，可以显著提高谷氨酸棒杆菌在高温培养条件下的耐热性。一方面可以提高谷氨酸棒杆菌的培养问题，加快菌体的生长繁殖，降低发酵培养过程中冷却所需的能源消耗；另一方面在谷氨酸棒杆菌发酵培养过程中遭遇夏季高温或冷却系统故障的突发状况下，具有该耐热元器件的菌株可以大大提高菌株的稳定性，使异常高温条件下对菌体生长产生的影响降到最低，有利于谷氨酸棒杆菌发酵的稳定生产。该谷氨酸棒杆菌耐热元器件可以广泛应用于以谷氨酸棒杆菌为生物技术平台的氨基酸、有机酸、维生素及燃料乙醇等产品的生产，本发明技术适合进行工业化生产推广，具有显著的先进性和较好的应用前景。
[0074]
seq no.1：ttha0571基因序列：
[0075]
atgctggagc gccacgaccg cctggaaacc ctgagaaagc tgaaggaact gcaggagcgc atcgccgagc tcgcctacct cctcaccggg gaggagcccg ccgcctggac ccccagggtg gaccttctgg aaaccgagga gcactacgtc ctcctcgtgg accttcccgg ggtgcgcccc gaggacctgg agcttctgga ggaggggcag cgggtgaccc tggccggggt gcgccacccc ctgcccggca cctacctctt ggaggagagg cccatgggca ccttccgccg caccctggac ctccccgggc ccattgagga ggggacggcc caggccaccc tgcggaacgg ggtcttggag gtccgcttcc gcaagaggcc ggccacggcc cttcccctaa aggaggcgta g。
[0076]
seq no.2：启动子ptuf基因序列
[0077]
gttaacagat cgtttagatc cgaaggaaaa cgtcgaaaag caatttgctt ttcgacgccc caccccgcgc gttttagcgt gtcagtaggc gcgtagggta agtggggtag cggcttgtta gatatcttga aatcggcttt caacagcatt gatttcgatg tatttagctg gccgttaccc tgcgaatgtc cacagggtag ctggtagttt gaaaatcaac gccgttgccc ttaggattca gtaactggca cattttgtaa tgcgctagat ctgtgtgctc agtcttccag gctgcttatc acagtgaaag caaaaccaat tcgtggctgc gaaagtcgta gccaccacga agtccaggag gaaagctt。
[0078]
实施例2：一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571及其应用
[0079]
使用的引物和材料同实施例1。
[0080]
一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571，所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571由谷氨酸棒杆菌启动子和耐热功能基因组成，所述谷氨酸棒杆菌启动子为
强启动子ptuf，所述耐热功能基因为来源于嗜热栖热菌cicc10647中的ttha0571基因；所述ttha0571基因序列如seq no.1所示，所述强启动子ptuf基因序列如seq no.2所示。
[0081]
所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571在提高谷氨酸棒杆菌耐热性中的应用。
[0082]
将谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571导入质粒然后在谷氨酸棒杆菌内表达。
[0083]
将谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571整合到谷氨酸棒杆菌基因组上。
[0084]
对带有谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571的谷氨酸棒杆菌进行高温驯化，提高谷氨酸棒杆菌的耐热性。
[0085]
将嗜热栖热菌cicc 10647活化接种于液体lb培养基中置于75℃摇床中培养24h，得到种子培养液；将种子培养液接种于液体培养基中，取处于对数生长期的菌液提取基因组。
[0086]
谷氨酸棒杆菌耐热元器件ptuf-ttha0571的构建方法包括：
[0087]
耐热功能基因ttha0571的pcr扩增：配制50μl酶切反应体系，首先向0.2ml pcr管中加入20μl ddh2o；加入10μl 5
×
primestar buffer溶液；加入4μl dntp溶液；加入上引物ttha0571-1、下引物ttha0571-2溶液各2μl；加入总dna不超过200ng的模板；加入0.5μl primestar hs dna polymerase溶液；用ddh2o将反应体系补足50μl并用移液器反复吹吸混匀；pcr仪参数设置为：95℃预变性5min；30个循环包括98℃变性10s、55℃退火5s和72℃延伸30s；72℃延伸10min。
[0088]
将谷氨酸棒杆菌atcc 13032活化接种于液体lb培养基中置于32℃摇床中培养24h，得到种子培养液；将种子培养液接种于液体培养基中，取处于对数生长期的菌液提取基因组。
[0089]
启动子ptuf的pcr扩增：配制50μl酶切反应体系，首先向0.2ml pcr管中加入20μl ddh2o；加入10μl 5
×
primestar buffer溶液；加入4μl dntp溶液；加入上引物ptuf-1、下引物ptuf-2溶液各2μl；加入总dna不超过200ng的模板；加入0.5μl primestar hs dna polymerase溶液；用ddh2o将反应体系补足50μl并用移液器反复吹吸混匀；pcr仪参数设置为：95℃预变性5min；30个循环包括98℃变性10s、55℃退火5s和72℃延伸30s；72℃延伸10min。
[0090]
启动子ptuf与耐热功能基因ttha0571的dna片段连接：配制50μl酶切反应体系，首先向0.2ml pcr管中加入20μl ddh2o；加入10μl 5
×
primestar buffer溶液；加入4μl dntp溶液；加入上引物up-1、下引物down-2溶液各2μl；加入1μl的up模板、2.5μl的ptuf模板、0.9μl的ttha0571模板、1.7μl的down模板；加入0.5μl primestar hs dna polymerase溶液；用ddh2o将反应体系补足50μl并用移液器反复吹吸混匀；pcr仪参数设置为：95℃预变性5min；30个循环包括98℃变性10s、55℃退火5s和72℃延伸2min；72℃延伸10min。
[0091]
谷氨酸棒杆菌结合转化：配制20μl体外连接体系，首先向0.2ml pcr管中加入5μl ddh2o；加入4μl的5
×
ce butter溶液；加入pk18mobrpsl质粒50～200ng；加入上述连接好的目的dna片段20～200ng；加入exnase
tm
ii 2μl；用ddh2o将反应体系补足20μl；37℃水浴30min；加入e.coli dh5α感受态细胞，冰浴20min；置于42℃水浴锅，热激60s，冰浴2min；在无菌ep管中加入900μl预热的soc复苏液，37℃、220r/min，培养1h；取100μl菌液，涂布于卡
那霉素抗性平板，37℃培养12h；用牙签随机挑选平板中的单菌落，先划于固体培养基平板中，再将该牙签上的菌落溶于配制好的菌落pcr反应体系中，将反应体系进行菌落pcr扩增，通过pcr鉴定结果筛选正确目的菌株，命名为大肠杆菌dh5α-pk18mobrpsl-ptuf-ttha0571，将平板置于37℃培养过夜；将鉴定正确的菌株接种于带卡那霉素的lb液体培养基中，培养10h，离心菌体提取质粒；将2mm电转杯在冰上预冷约20min，待冷冻的谷氨酸棒杆菌atcc 13032感受态细胞融化和质粒加入其中，都加入电转杯，冰浴20min。电转后，用900μl预热的bhis复苏液重悬电转杯中的菌体，转入ep管内，46℃热击6min，在32℃、220r/min条件下复苏2h，涂布含有卡那霉素抗性的bhi平板，32℃培养24h；用牙签随机挑选平板中的单菌落，先划于固体培养基平板中，再将该牙签上的菌落溶于配制好的菌落pcr反应体系中，将反应体系进行菌落pcr扩增，通过pcr鉴定结果筛选正确目的菌株，命名为谷氨酸棒杆菌atcc13032-pk18mobrpsl-ptuf-ttha0571，将平板置于32℃培养过夜；将鉴定正确的菌株接种于带卡那霉素的bhi液体培养基中，培养10～12h；吸3～5μl菌液至900μl bhi复苏液中，吸取100μl上述复苏液至链霉素抗性平板涂布，32℃培养24h；用牙签随机挑选平板中的单菌落，先划于固体培养基平板中，再将该牙签上的菌落溶于配制好的菌落pcr反应体系中，将反应体系进行菌落pcr扩增，通过pcr鉴定结果筛选正确目的菌株，将鉴定正确的菌株保存，命名为谷氨酸棒杆菌atcc 13032-ptuf-ttha0571。
[0092]
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。