一种用于鉴定胚胎染色体性别的引物和探针及其应用的制作方法

1.本发明涉及性别鉴定技术领域，尤其涉及一种用于鉴定胚胎染色体性别的引物和探针及其应用。


背景技术：

2.试管婴儿技术是体外受精—胚胎移植等人工助孕技术的俗称，是一项结合胚胎学、内分泌、遗传学以及显微操作的综合技术，在治疗不孕不育症的方法中最为有效。它是将精子和卵子置于体外利用各种技术使卵子受精，培养几天后移入子宫，使女性受孕。其不仅能解决不孕问题，还能避开性别连锁遗传病的发生，降低社会负担。对于具有伴性遗传疾病家族史的人群，行胚胎植入前遗传学检测(pgt)，选择不携带致病变异胚胎进行移植，可避免伴性遗传疾病在家族中反复出现。但由于pgt技术对胚胎的侵入性和技术的复杂性，限制了其在临床的广泛应用。
3.近年来，随着游离基因组dna在胚胎培养液和囊胚腔液中的发现，为辅助生殖技术的非侵入性胚胎植入前遗传学检测开辟了新的可能性。但胚胎培养液中的游离dna的浓度极低，临床医生多利用高通量基因测序(ngs)检测胚胎培养液中的游离dna，分析囊胚的染色体拷贝数。ngs法虽能分析出胚胎染色体的变异情况，但是其高昂的检测成本、过长的报告周期、复杂的分析过程等缺陷在应用时都无法避免。而目前对于胚胎移植前的染色体性别检测除ngs外再无其他准确的方法。


技术实现要素：

4.针对现有胚胎植入前染色体性别检测存在的上述问题，本发明提供一种用于鉴定胚胎染色体性别的引物和探针及其应用，利用该引物和探针可以通过荧光定量pcr的方法准确检测出胚胎植入前染色体性别，且灵敏度高、检测成本低、检测周期短，在胚胎植入前染色体性别检测相关技术中具有极高的应用价值。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.一种用于鉴定胚胎染色体性别的引物和探针，包括：
7.根据基因sry设计的上游引物seq id no:1、下游引物seq id no:2及探针seq id no:3；
8.根据y染色体特异性区域设计的上游引物seq id no:4、下游引物seq id no:5及探针seq id no:6；以及上游引物seq id no:7、下游引物seq id no:8及探针seq id no:9；
9.内标基因β
‑
actin的特异性引物和探针：上游引物seq id no:10、下游引物seq id no:11及探针seq id no:12；
10.所述探针seq id no:3和探针seq id no:9携带的荧光基团，与所述探针seq id no:6和探针seq id no:12携带的荧光基团不同。
11.相对于现有技术，本发明提供的用于鉴定胚胎染色体性别的引物和探针可以实现在不损伤胚胎的情况下，仅利用胚胎培养液中的游离dna实现对移植前胚胎染色体性别的
准确鉴定。本发明所涉及的四组引物和探针可在同一荧光定量rcr反应条件下对胚胎培养液中的游离dna进行多重荧光定量pcr检测，检测过程与以往方法相比，在不损伤胚胎的情况下，有效地保证了检测结果的准确性，且检测周期短、方法简单、检测通量高、灵敏度高，与传统的高通量基因测序(ngs)方法相比极大的降低了移植前胚胎检测的成本和难度，检测过程对胚胎的活性不会产生任何影响，在胚胎移植和遗传学检测相关技术中具有重要的应用价值。
12.优选的，所述探针seq id no:3和探针seq id no:9携带fam荧光基团；所述探针seq id no:6和探针seq id no:12携带vic荧光基团。
13.探针seq id no:3具体为：5
′‑
fam
‑
gatgactgtacgaaagccag
‑
bhq1
‑3′
；
14.探针seq id no:9具体为：5
′‑
fam
‑
attcttgtagtacctatggga
‑
bhq1
‑3′
；
15.探针seq id no:6具体为：5
′‑
vic
‑
atgacgagcacataacttta
‑
bhq3
‑3′
；
16.探针seq id no:12具体为：5
′‑
yic
‑
tgctgggcgccagggtggc
‑
bhq3
‑3′
；
17.本发明还提供利用所述引物和探针进行胚胎染色体性别鉴定的方法，该方法包括以下步骤：
18.a、提取胚胎培养液中的游离dna；
19.b、在荧光定量pcr反应体系a中，以所述游离dna为模板，加入所述引物和探针seq id no:1
‑
6，进行荧光定量多重pcr反应；在荧光定量pcr反应体系b中，以所述游离dna为模板，加入所述引物和探针seq id no:7
‑
12，进行荧光定量多重pcr反应；
20.c、分别用所述探针seqidno:3、6、9和12携带的荧光基团对应的荧光检测通道检测荧光定量多重pcr反应；若所述探针seq id no:3、12检测出荧光信号，且所述探针seq id no:6、9中至少有一个检测出荧光信号，则所述胚胎含有y染色体；若所述探针seq id no:3、6、9都无荧光信号检出，且所述探针seq id no:12检测出荧光信号，则所述胚胎不含y染色体；若所述探针seq id no:3、6、9、12都无荧光信号检出，则检测失败。
21.相对于现有技术，本发明提供的利用所述引物和探针进行胚胎染色体性别鉴定的方法，操作简单、检测周期短、成本低，无需进行高通量基因测序，借助荧光定量pcr仪即可完成鉴定过程，结果判断方法简单，省去大量高昂的仪器设备和繁琐的试验操作，易于推广应用。
22.优选的，骤b中，所述荧光定量pcr反应体系a为23ul，包括：
[0023][0024]
所述荧光定量pcr反应体系b为23ul，包括：
[0025][0026]
所述荧光定量pcr反应体系a和荧光定量pcr反应体系b中的引物和探针的浓度均为10um；所述模板的浓度≥10ng/ul。
[0027]
优选的，所述荧光定量多重pcr反应的条件为：预变性：95℃、5min；预扩增：94℃、20s，57℃、20s，72℃、60s，所述预扩增共4个循环；检测扩增：94℃、15s，56℃、60s，所述检测扩增共35个循环。
[0028]
本发明还提供了一种鉴定植入前胚胎染色体性别的试剂盒，该试剂盒包括所述的引物和探针。
[0029]
优选的，所述试剂盒还包括pcr缓冲液和dna聚合酶。
附图说明
[0030]
图1是本发明实施例2中胚胎含有y染色体时fam通道检测的扩增曲线图；
[0031]
图2是本发明实施例2中胚胎含有y染色体时vic通道检测的扩增曲线图；
[0032]
图3是本发明实施例2中胚胎不含有y染色体时vic通道检测的扩增曲线图；
[0033]
图4是本发明实施例2中胚胎不含有y染色体时fam通道检测的扩增曲线图。
具体实施方式
[0034]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0035]
实施例1
[0036]
用于鉴定胚胎染色体性别的引物和探针，包括：
[0037]
根据基因sry设计的上游引物seq id no:1、下游引物seq id no:2及探针seq id no:3；
[0038]
根据y染色体特异性区域设计的上游引物seq id no:4、下游引物seq id no:5及探针seq id no:6；以及上游引物seq id no:7、下游引物seq id no:8及探针seq id no:9；
[0039]
内标基因β
‑
actin的特异性引物和探针：上游引物seq id no:10、下游引物seq id no:11及探针seq id no:12。
[0040]
其中，探针seq id no:3和探针seq id no:9携带fam荧光基团；探针seq id no:6和探针seq id no:12携带vic荧光基团。
[0041]
利用上述引物和探针进行胚胎染色体性别鉴定的方法包括以下步骤：
[0042]
a、对于辅助生殖助孕患者，采用单精子胞浆内注射方式获得的受精卵，使用囊胚培养液将培养第3天的胚胎清洗后，转移至新制备的10ul囊胚培养微滴中持续培养至第5天，使囊胚完全扩张，将形成囊胚的胚胎取出冻存，收集10ul剩余的胚胎培养液作为待检样本，提取待检样本中的游离dna。利用微量基因组快速扩增试剂盒通过全基因组dna体外扩增技术，增大待检样本游离dna拷贝数，再使用tiangen普通dna产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，去除体系中剩余的dna聚合酶、引物、dntp、mg
2
等杂质，纯化后的dna作为模板进行检测；
[0043]
上述纯化的方法为：
[0044]
使用dna纯化柱，去除全基因组扩增反应体系中剩余的dna聚合酶、引物、dntp、mg
2
等杂质，具体步骤如下：
[0045]
1)向dna纯化柱中加入500ul平衡液，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管；
[0046]
2)取新的1.5ml无酶离心管，加入500ul结合液，将待纯化的dna加入结合液，充分混匀，得到混合液；
[0047]
3)将混合液加入到步骤(1)准备的吸附柱中，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管；
[0048]
4)向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管；
[0049]
5)重复操作步骤(4)，以充分洗涤产物；
[0050]
6)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，除去漂洗液，室温放置5min，彻底晾干吸附柱；
[0051]
7)将晾干后的吸附柱放入新的1.5ml无酶离心管中，向吸附膜中心位置悬空滴加30ul洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集纯化好的dna溶液。
[0052]
8)每个样品取出2ul，检测样品dna浓度，浓度≥10ng/ul为合格样本，可作为模板进行荧光定量pcr检测。
[0053]
b、在荧光定量pcr反应体系a中，以所述dna为模板，加入引物和探针seq id no:1
‑
6，进行荧光定量多重pcr反应；在荧光定量pcr反应体系b中，以所述dna为模板，加入引物和探针seq id no:7
‑
12，进行荧光定量多重pcr反应；pcr反应体系a和b同时进行荧光定量pcr反应程序；
[0054]
c、分别用fam、vic荧光检测通道监测荧光定量多重pcr反应过程；若所述探针seq id no:3、12检测出荧光信号，且所述探针seq id no:6、9中至少有一个检测出荧光信号，则所述胚胎含有y染色体；若所述探针seq id no:3、6、9都无荧光信号检出，且所述探针seq id no:12检测出荧光信号，则所述胚胎不含y染色体；若所述探针seq id no:3、6、9、12都无荧光信号检出，则检测失败。
[0055]
上述荧光定量pcr反应体系a为23ul，包括：
[0056][0057][0058]
上述荧光定量pcr反应体系b为23ul，包括：
id no:1
‑
12、pcr缓冲液和dna聚合酶。
[0069]
利用上述试剂盒检测移植前胚胎染色体性别的方法同实施例1。
[0070]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。