一种活性肽、活性肽组合物及其在制备具有延缓衰老作用的产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种活性肽、活性肽组合物及其在制备具有延缓衰老作用的产品中的应用。


背景技术：

2.多环芳烃是森林火灾、火山爆发、化石燃料燃烧及工业产生的主要环境污染物之一。苯并芘(bap)是一种多环芳烃，香烟烟雾和汽车废气中均含有苯并芘，其亲脂性使其易于透过生物膜，也可通过不同的代谢途径吸收。大量研究发现，暴露于bap会诱发支气管上皮细胞氧化应激、炎症损伤和肺毒症等。氧化应激是由于氧化和抗氧化系统之间的平衡被破坏而引起的，氧化和抗氧化系统可通过产生氧代谢产物(包括超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢、脂质过氧化物和含氮氧化物)来增强氧化应激。bap可代谢为b[α]p-7,8-二醇-9,10-环氧化物(bpde)或邻醌，并形成大量活性氧(ros)。活性氧(如羟基自由基、超氧阴离子和过氧化氢)可与各种生物大分子(如dna、蛋白质和脂质)发生反应，导致细胞损伤，进而加速细胞衰老。然而，目前并没有针对环境污染物苯并芘导致的衰老的治疗产品。


技术实现要素：

[0003]
为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种活性肽。
[0004]
本发明的详细技术方案如下：
[0005]
本发明首先提供一种活性肽，其具有式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示的结构：
[0006]
[0007][0008]
发明人在研究中惊奇的发现：式ⅰ、式ⅱ以及式ⅲ所示的结构的活性肽具有优异的延缓衰老作用；尤其是具有优异的延缓境污染物并芘导致的衰老作用。
[0009]
其中，式ⅰ所示的结构的活性肽的氨基酸序列为leu-trp-glu-his-ser-his，以下简写为blo-1；式ⅱ所示的结构的活性肽的氨基酸序列为tyr-ser-leu-his-leu-his-gly，以下简写为blo-2；式ⅲ所示的结构的活性肽的氨基酸序列为lys-tyr-gly-his-glu-his-ser，以下简写为blo-3。
[0010]
本发明还提供一种活性肽组合物，其包含式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示结构的活性肽中的任意两种或三种的组合。
[0011]
优选地，所述的活性肽组合物，其包含式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示结构的活性肽；
[0012]
其中，式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示结构的活性肽的摩尔比为1～10:1～10:1～10。
[0013]
进一步地，发明人研究表明，将式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示结构的活性肽组合后，其延缓衰老作用，尤其是延缓境污染物苯并芘导致的衰老作用要优于式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ任意一种所示结构的活性肽。
[0014]
进一步优选地，式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示结构的活性肽的摩尔比为1～5:1～5:1～5。
[0015]
优选地，式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示结构的活性肽的摩尔比为1:1:1。
[0016]
本发明还提供了一种上述活性肽或活性肽组合物在制备化妆品、食品、膳食补充剂或药品中的应用。
[0017]
优选地，所述的化妆品、食品、膳食补充剂或药品为具有延缓衰老作用的化妆品、食品、膳食补充剂或药品。
[0018]
进一步优选地，所述的衰老是指环境污染物导致的衰老。
[0019]
最优选地，所述的衰老是指环境污染物苯并芘导致的衰老。
[0020]
由于本发明所述的活性肽和活性肽组合物具有优异的延缓衰老作用，尤其是具有优异的延缓境污染物苯并芘导致的衰老作用；因此，可以将其作为活性成分用于制备具有延缓衰老作用，尤其是用于制备具有延缓境污染物苯并芘导致的衰老作用的食品、膳食补充剂或药物。
[0021]
优选地，所述的化妆品、食品、膳食补充剂或药品为具有抑制脂褐素生成作用的化
妆品、食品、膳食补充剂或药品。
[0022]
进一步地，本发明研究人员还发现，所述的活性肽和活性肽组合物还能抑制脂褐素生成；因此，可以将本发明所述的活性肽或活性肽组合物用于制备具有抑制脂褐素生成作用的化妆品、食品、膳食补充剂或药品。
[0023]
有益效果：(1)本发明提供的活性肽或其组合物，具有优异的延缓衰老活性，在化妆品、食品、膳食补充剂或药物中具有广泛的应用前景。(2)本发明所述具有延缓衰老活性的活性肽为活性分子化合物，制备工艺简单、操作方便，有利于其在化妆品、食品、膳食补充剂或药物中的应用。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]
图1为blo-1的质谱图。
[0026]
图2为blo-1的高效液相测定结果图。
[0027]
图3为blo-2的质谱图。
[0028]
图4为blo-2的高效液相测定结果图。
[0029]
图5为blo-3的质谱图。
[0030]
图6为blo-3的高效液相测定结果图。
[0031]
图7为blo-1、blo-2、blo-3及其组合物对bap暴露诱导的秀丽隐杆线虫活动能力降低的影响实验结果图。
[0032]
图8为长双歧杆菌寡肽或其组合物对bap暴露诱导的秀丽隐杆线虫mda、sod活性及ros含量影响实验结果图。
具体实施方式
[0033]
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034]
实施例1活性肽的制备
[0035]
(1)取200mg fmoc-his wang resin置于固相合成管中，加入n，n-二甲基甲酰胺(dmf)后静置40分钟使树脂充分溶胀，滤去溶剂，再加入哌啶dmf溶液，振荡后滤出溶剂。将fmoc-ser-oh、1-羟基苯并三唑、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯溶于dmf中，在加入n,n-二异丙基乙胺混匀后避光即已被活化，并加入树脂中，25℃下氮气吹动搅拌2小时，经抽滤后用dmf和二氯甲烷依次洗涤并抽干溶剂。重复上述步骤，将活化好的fmoc-his-oh、fmoc-glu-oh、fmoc-trp-oh、fmoc-leu-oh依次加入树脂中，25℃下氮气吹动搅拌，反应完全后洗涤树脂，将得到的滤液进行旋蒸并得到沉淀，经冷冻干燥后即可得到blo-1。
[0036]
(2)取200mg fmoc-gly wang resin置于固相合成管中，加入n，n-二甲基甲酰胺
(dmf)后静置40分钟使树脂充分溶胀，滤去溶剂，再加入哌啶dmf溶液，振荡后滤出溶剂。将fmoc-his-oh、1-羟基苯并三唑、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯溶于dmf中，在加入n,n-二异丙基乙胺混匀后避光即已被活化，并加入树脂中，25℃下氮气吹动搅拌2小时，经抽滤后用dmf和二氯甲烷依次洗涤并抽干溶剂。重复上述步骤，将活化好的fmoc-leu-oh、fmoc-his-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ser-oh、fmoc-tyr-oh依次加入树脂中，25℃下氮气吹动搅拌，反应完全后洗涤树脂，将得到的滤液进行旋蒸并得到沉淀，经冷冻干燥后即可得到blo-2。
[0037]
(3)取200mg fmoc-lys wang resin置于固相合成管中，加入n，n-二甲基甲酰胺(dmf)后静置40分钟使树脂充分溶胀，滤去溶剂，再加入哌啶dmf溶液，振荡后滤出溶剂。将fmoc-ser-oh、1-羟基苯并三唑、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯溶于dmf中，在加入n,n-二异丙基乙胺混匀后避光即已被活化，并加入树脂中，25℃下氮气吹动搅拌2小时，经抽滤后用dmf和二氯甲烷依次洗涤并抽干溶剂。重复上述步骤，将活化好的fmoc-his-oh、fmoc-glu-oh、fmoc-his-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-tyr-oh、fmoc-lys-oh依次加入树脂中，25℃下氮气吹动搅拌，反应完全后洗涤树脂，将得到的滤液进行旋蒸并得到沉淀，经冷冻干燥后即可得到blo-3。
[0038]
活性肽的结构分析和分子量测定：在sciex x500r四极飞行时间(q-tof)质谱仪上进行电喷雾电离质谱(hplc-esi-ms)。质量范围设置为m/z 50-1500。在正模式下获得q-tof质谱数据，质谱分析条件为：cad气体流量，7l/min；干燥气体温度，550℃；离子喷涂电压，5500v；和去聚集电位，80v。
[0039]
blo-1的解析如下：基于质谱数据分析得：808.3743是[m h]

离子，790.3669是[m-h2o h]

离子，653.3066是y5离子，566.2742是y4离子，509.2111是b4离子，380.1681是b3离子，225.0982是b3-b1，离子110.0709是[his-cooh h]

离子。最终，根据上述质谱数据可以确定blo-1的氨基酸序列为leu-trp-glu-his-ser-his，即式ⅰ所示的结构的活性肽。
[0040]
blo-2的解析如下：基于质谱数据分析得:826.4213是[m h2o h]

离子，751.3910是y6离子，614.3317是y5离子，501.2470是y4离子，463.2436是b4离子，251.1508是y2离子，213.0988是b2离子，110.0712是[his-cooh h]

离子；最终，根据上述质谱数据可以确定blo-2的氨基酸序列为tyr-ser-leu-his-leu-his-gly，即式ⅱ所示的结构的活性肽。
[0041]
blo-3的解析如下：基于质谱数据分析得：857.3913是[m h]

离子，839.3836是[m-h2o h]

离子，752.3515是y6离子，615.2899是y5离子，486.2475是y4离子，324.1320是b5-b2离子，243.1092是b2离子。最终，根据上述质谱数据可以确定blo-3的氨基酸序列为lys-tyr-gly-his-glu-his-ser，即式ⅲ所示结构的活性肽。
[0042]
实验例
[0043]
为了评估本发明实施例1制备得到的blo-1、blo-2、blo-3以及活性肽组合物(blo-1、blo-2和blo-3按摩尔比1:1:1组成的组合物，简称tblo)的生物活性，进行如下效果实验例。以下实验例中的bap采用的是苯并[a]芘。
[0044]
(1)将10只妊娠成体线虫置于ngm平板上，接种大肠杆菌菌株op50并产卵约5小时，获得同步种群。然后，使用l4幼虫线虫在20℃下评估blo-1、blo-2、blo-3、tblo增强线虫抗氧化应激能力。线虫在含有0.10mm bap的处理板上孵育1天，然后转移到含有5mg/ml blo-1或blo-2或blo-3或tblo的ngm/op50板上。
[0045]
(2)使用1天大的成年秀丽隐杆线虫在20℃下评估运动能力。将秀丽隐杆线虫在含有0.10mm bap的处理板上培养1天，并转移到含有5mg/ml blo-1或blo-2或blo-3或tblo的ngm/op50板上。在第6、9和13天，观察到秀丽隐杆线虫。a类：线虫自发平稳移动，留下正弦对称轨迹；c类：秀丽隐杆线虫仅在用软电线戳时移动头部或尾部；b类：秀丽隐杆线虫代表a和c。n之间的每一个行为类≥每组60条线虫。
[0046]
(3)将3天龄的秀丽隐杆线虫与0.10mm bap孵育12h，然后转移到含有5mg/ml blo-1或blo-2或blo-3或tblo的新制备的ngm/op50平板上24h。然后收集所有线虫，用pbs洗涤3次。然后，使用试剂盒测定sod活性和丙二醛(mda)含量。使用活性氧特异性荧光探针dcfh-da测定细胞内活性氧含量。
[0047]
实验结果如下：
[0048]
如表1所示：bap暴露使线虫寿命显著缩短；而tblo能够抑制bap暴露导致的线虫寿命缩短，提高秀丽隐杆线虫的平均寿命。与活性肽blo-1或blo-2或blo-3单独作用相比，活性肽组合物tblo具有更佳的保护活性。这说明活性肽具有延缓衰老作用；其中blo-1、blo-2以及blo-3组合后得到的活性肽组合物，其延缓衰老的作用最佳。
[0049]
表1活性肽及其组合物抗bap诱导的寿命降低活性
[0050][0051]
此外，如图7所示，bap暴露使线虫活动力显著下降；而tblo能够抑制bap暴露导致的线虫活动力降低；与活性肽blo-1或blo-2或blo-3作用相比，活性肽组合物tblo具有更佳的保护活性。
[0052]
如图8所示，tblo能够抑制秀丽隐杆线虫体内ros的生成(图8a)，提高sod活力(图8b)，降低mda含量(图8c)。同时本研究发现，tblo与blo-1，blo-2或blo-3单独作用相比，活性肽组合物tblo具有更佳的保护活性。
[0053]
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。