一种白木香倍半萜合酶基因ASS15及其编码产物和应用

一种白木香倍半萜合酶基因ass15及其编码产物和应用
技术领域
1.本发明涉及生物基因工程技术领域，特别涉及一种白木香倍半萜合酶基因ass15及其编码产物和应用。


背景技术：

2.白木香是瑞香科沉香属热带亚热带常绿林木，是国产沉香的唯一基原植物。健康白木香树不产沉香，只有受伤害后才会在茎干内形成沉香。沉香是传统名贵香药，《中国药典》记载沉香入药具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效。现代医学研究也证明沉香可用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐、肾虚、气喘等病症的治疗，具有很好的镇痛、抗炎、抗肿瘤等功效。近年来，多采用人工伤害诱导白木香结香的方式生产沉香，在采用钻孔结香过程中发现一种伤害后较易结香且所产沉香品质较优、结香性能优良的野生树种。该树种经嫁接繁育后，能很好的保持其结香性状，可大量繁育，被命名为奇楠种质。传统种质选育方法很难从众多白木香种质中选育出具有优良结香性能的奇楠种质，在我们此前的工作中通过rapd分子标记建立的mcid(manual cultivar identification diagram)法可以很好的将几种奇楠种质与白木香种质鉴定开来，但是该方法需要大量的样品来构建mcid图，且不能鉴定种质结香的优劣性，严重制约了奇楠种质的培育和高效利用。
3.倍半萜是沉香的主要成分之一，健康白木香茎干中没有倍半萜类物质，只有伤害后才会合成和积累。奇楠种质结香性能优于普通白木香种质，说明伤害后奇楠种质中倍半萜合成调控机制显著优于普通白木香种质，但关于两种种质结香中倍半萜合成差异分子调控机制至今没有报道。倍半萜合酶是沉香倍半萜伤害诱导合成的关键催化酶，在植物中可催化法呢烯焦磷酸(fpp)形成倍半萜骨架。因此，研究倍半萜合酶基因在奇楠种质与普通白木香种质中的表达差异，可揭示二种种质伤害诱导倍半萜合成差异的分子调控机制，为新的鉴定和选育白木香优良结香种质方法开发奠定基础。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于研究沉香倍半萜合酶基因在沉香挥发性产物合成过程中的作用及在奇楠种质和普通白木香种质中的伤害诱导表达差异，提供了一种白木香倍半萜合酶基因ass15及其编码产物和在奇楠种质中的应用。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种白木香倍半萜合酶基因ass15，所述ass15基因来源于白木香(aquilaria sinensis(lour.)spreng.)的奇楠种质，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，ass15基因的编码产物的氨基酸序列如seq id no.2中第11～613位所示。
8.本发明还提供了所述ass15基因及其编码产物在奇楠种质中的应用。
9.优选的，所述应用包括在筛选奇楠种质或调控沉香形成中的应用。
10.优选的，所述筛选奇楠种质为对白木香树种进行伤害诱导，在诱导后0～24h，检测ass15基因的表达情况，筛选出奇楠种质。
11.优选的，所述筛选的标准为与伤害诱导前相比，若伤害诱导后ass15基因显著表达的树种，则为奇楠种质，反之，则为其他白木香种质。
12.优选的，所述调控沉香形成中的沉香为奇楠种质所产的沉香。
13.本发明所述白木香倍半萜合酶基因ass15在奇楠种质中基因表达量显著高于普通白木香种质，在奇楠种质受到伤害诱导时，会大量表达并诱导奇楠沉香形成。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
15.本发明提供了一种白木香倍半萜合酶基因ass15及其编码的产物和应用，该基因可以对奇楠种质进行鉴别筛选，可用于奇楠种质的鉴定以及选育，节省奇楠种质的选育时间，可为白木香种质功能性分子标记开发和优良结香种质选育奠定基础，为培育优质奇楠新品种提供理论依据和基因来源，有助于开拓奇楠种质的来源。
16.本发明的白木香倍半萜合酶基因ass15，在奇楠种质受到伤害诱导时，会大量表达并诱导奇楠沉香形成，可通过调控ass15基因的表达来控制奇楠沉香的形成，对优质奇楠沉香的人工结香技术的研究具有重大意义。
附图说明
17.图1为本发明实施例1中ass15基因的扩增条带；
18.图2为本发明实施例2中ass15基因表达蛋白的结构预测图；
19.图3为本发明实施例2中ass15基因保守序列分析；
20.图4为本发明实施例2中ass15基因的系统进化树；
21.图5为本发明实施例3中ass15原核克隆载体切割后的电泳图；
22.图6为本发明实施例3中ass15重组蛋白诱导表达的考马斯亮蓝染色结果；
23.图7为本发明实施例3中ass15重组蛋白原核表达中的凝胶成像仪成像图；
24.图8为本发明实施例3中ass15体外酶功能验证的gc-ms图谱；
25.图9为本发明实施例4中ass15基因在白木香不同组织中的表达情况；
26.图10为本发明实施例4中伤害诱导不同时间的ass15基因表达情况；
27.图11为本发明实施例4中ass15基因在不同品种的白木香中的表达情况；
28.图12为本发明实施例5中不同倍半萜合酶基因在普通白木香种质和奇楠种质中的表达情况；
具体实施方式
29.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，并对本发明做进一步的说明。
30.实施例1 ass15基因克隆获取
31.选取3年生健康奇楠种质，直径(d)＝(1.2
±
0.2)cm，对茎干进行全断干伤害处理，并分别在伤害后0、2、6、24h截取伤口处2cm茎干，用液氮冷冻研磨成粉，提取茎干总rna。
32.取1μg rna利用first-strand cdna synthesis supermix(trans，china)反转录合成cdna第一条链，以此为pcr扩增模板，根据转录组数据中ass15 cds全长序列设计特异引物(f：atgtcttgcttccaagctctt；r：ataagggattggatctacaagtatg)，用premix primestar hs(takara，japan)进行扩增，终体系为20μl；扩增程序：94℃预变性
5min；94℃变性20s,56℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次；最后72℃，10min。扩增产物用胶回收试剂盒(tiangen，china)回收，连接到blunt simple t载体上(trans，china)，转化e.coli trans1-t1感受态(trans，china)，对单菌落进行测序(广州艾基生物技术有限公司)。
33.从奇楠种质伤害茎干内克隆到1条1812bp的基因序列，编码603个氨基酸，经ncbi的blastp比对，其与多种植物的大根香叶烯合成酶序列相似，表明该扩增基因为白木香倍半萜合酶基因，命名为ass15，ass15基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，ass15基因编码的蛋白的氨基酸如seq id no.2中第11～613位所示。
34.实施例2 ass15生物信息学分析
35.针对测序正确的ass15基因序列进行功能结构域、蛋白理化性质和同源进化分析，利用在线工具interproscan对该基因编码的蛋白功能域进行分析，使用expasy proteomics server提供的在线工具protparam对ass15蛋白特性进行预测，推测ass15蛋白分子式为c
3118h4858n834o903s24
，相对分子质量为69.16kd，等电点5.92，平均亲水性系数为-0.301，预测为亲水性蛋白；计算不稳定系数为45.35，该蛋白为不稳定蛋白。采用trmhmm server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm)跨膜预测ass15编码蛋白没有跨膜结构域，为胞外蛋白；使用signalp 4.1server预测显示ass15蛋白氨基酸序列中没有信号肽，为非分泌蛋白，plant-mploc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)预测该蛋白定位于叶绿体；
36.将ass15的氨基酸序列在ncbi中的blastp工具中进行序列比对，发现ass15具备高等植物倍半萜合酶的保守结构域rpx8w(59～69)和ddxxd(352～356)，与桉树(eucalyptus crandis)、木棉(gossypium arboreum)、毛叶杨(populus trichocarpa)、川桑(morus notabilis)的同源性达62.66％。通过mega7.0软件的相邻连接法构建ass15系统发育树，进行聚类关系分析，如图3所示，在17个植物系统发育树中，ass15单独聚类为一支，后与青蒿(artemisia annua)、向日葵(helianthus annuus)、一枝黄花(solidago canadensis)的聚类分支及木本棉(gossypium arboreum)麻风树(jatropha curcas)聚类的分支聚类在一起，说明ass15蛋白与这五种植物的倍半萜合酶蛋白的亲缘关系相对较近，可能具有类似功能。
37.实施例3 ass15的表达及其功能验证
38.3.1 ass15的原核表达
39.(1)经原核表达密码子优化软件对测序正确的ass15序列进行密码子优化，在不改变氨基酸序列前提下根据大肠杆菌表达偏好性优化ass15序列中8个稀有密码子，并引入ndei和xba i两个限制性酶切位点，该优化序列由南京钟鼎生物科技公司合成。将优化的ass15与pczn1载体进行连接，然后将连接产物转入bl21(de)3plyss
tm
大肠杆菌感受态中进行诱导表达，挑取单克隆菌液pcr鉴定，进一步提取重组质粒进行双酶切验证。如图5所示，重组质粒被切成2条片段，且与目的片段和载体的大小一致，表明目的片段已成功插入pczn1载体中。
40.(2)将过夜震荡的含有重组质粒的bl21(de)3plyss
tm
菌液，按1：100接种于50μg/ml amp的30ml lb培养液中，37℃220r/min振荡培养至od
600
为0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为0.4mm，分别于37℃220r/min振摇4h，11℃220r/min振摇过夜，诱导融合蛋白表达。10000r/
min，2min离心收集菌体，用0.2m pbs缓冲液重悬菌体沉淀。重悬液进行超声波破碎，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。进行12％sds-page检测分析，使用考马斯亮蓝染色显条带，在66.2kd偏上出现一条特异性蛋白条带，但目的蛋白沉降于菌体沉淀中，为包涵体蛋白。通过对包涵体蛋白的变复性处理和纯化，得到重组蛋白。
41.(3)为了验证表达重组蛋白的准确性，利用his标签蛋白抗体进行western blot检测。配置相应浓度sds-page凝胶胶，取0.5ml重组蛋白，加入5
×
上样缓冲液，充分混匀后100℃煮沸10min，上样，电泳。电泳结束后，300ma恒流转膜1h，将凝胶中的蛋白转到pvdf膜上，取出膜用tbst洗涤4次，每次5min。5％脱脂奶粉封闭1h。使用tbst 1：1000稀释his标签鼠单克隆抗体，将pvdf膜置于稀释的his抗体中，4℃孵育过夜。次日，tbst洗涤4次，兔抗鼠igg抗体(1∶10000)孵育1h，二抗孵育后用tbst洗膜4次。使用ecl显色，使用凝胶成像仪成像。结果显示，该重组蛋白可与his抗体发生特异性结合，证明ass15原核蛋白表达成功，氨基酸序列如seq id no.2所示。
42.3.2体外酶功能验证
43.在2ml离心管中配制200ul反应体系(25mmol/l tirs-hcl ph7.0,10％甘油，10mmol/l mgso4,5mmol/l dtt,46umol/l fpp,50umol/l重组蛋白)涡旋混匀，30℃水浴2h催化反应。
44.使用固相微萃取检测催化产物，cg-ms条件：电离方式ei，电子能量70ev，载气ne,流速1ml/min，进样口温度250℃，起始温度80℃，以5℃/min升至220℃，保持10min，再以10℃/min升至240℃，保持3min，扫描质量范围30-50amu。
45.经gc-ms对体外催化反应产物进行检测，对比空白样本催化产物在15.907min处出现峰，经nist数据库比对为nerolidol(橙化叔醇)，说明ass15基因编码生成的酶是一种可以催化fpp生成倍半萜类物质的功能性酶基因。
46.实施例4 ass15的表达特性分析
47.ass15的表达情况的测定方法：利用qrt-pcr明确ass15基因表达特性。采用lightcycle 96(roche switzerland)检测系统，20μl反应体系：cdna模板1ul,ass15特异性正反向引物均为1ul,2
×
sybr premix ex taqtm(trans，china)10ul,ddh2o 7ul,每个样本重复扩增3次。反应均以三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gadph)为内参基因，引物序列为f：tgctaaagaagaggtgaaaaggg；r：ccgcaaggtcgtcatagagc。qrt-pcr程序如下：95℃、5min；95℃、10s，56℃、15s，72℃、20s,循环40次。
48.a.取普通白木香种质和奇楠种质不同组织的样品，提取总rna，测定ass15基因在不同组织(根、茎、叶、种子、果实)中的表达情况；
49.b.采用物理剥皮划痕法对普通白木香种质和奇楠种质(透顶绿种质、凹身种质)进行伤害诱导，分别在诱导的0h、6h和24h后取茎干，提取总rna，测定ass15基因在不同种质中伤害诱导后的表达情况；
50.c.取健康的普通白木香品种与奇楠种质品种(“糖结”、“热科1号沉香”、“波浪仔”、“金莎叶”和“汝湖”)的茎干，提取总rna，测定在不同种质、品种中ass15基因的表达情况。
51.如图9～11所示，对比普通白木香和奇楠种质茎干内表达情况发现，在多种奇楠种质的健康茎干内ass15基因表达均高于普通白木香种质，且健康的普通白木香品种中ass15基因明显低于其余奇楠种质。
52.在剥皮划痕伤害后透顶绿和凹身两个奇楠种质的ass15表达量在24h内逐渐增加，而普通白木香中没有显著变化，伤害处理后奇楠种质中ass15基因表达显著高于白木香，说明在伤害诱导后可以通过检测ass15基因的表达情况鉴别奇楠种质和普通白木香种质。
53.实施例5不同倍半萜合酶基因的表达特性分析
54.利用qrt-pcr测定健康的普通白木香种质和奇楠种质(凹身)中ass1、ass2、ass15、ass17、ass20、ass23基因的表达情况，在进行剥皮划痕伤害诱导30d后再次测定各基因的表达量。
55.各基因的pcr引物及退火温度：
[0056][0057]
注：除表中记载的退火温度为，其余pcr条件均与ass15的pcr条件相同，具体见实施例4；
[0058]
在白木香种质中倍半萜合酶表达较少，在伤害诱导后表达量会大幅上升。白木香中存在多种倍半萜合酶，在普通白木香和奇楠种质对其伤害诱导表达情况进行对比，6个倍半萜合酶在两种种质中伤害诱导表达模式显著不同(图12)，但只有ass15在健康和伤害的奇楠茎干中相对表达量均显著高于普通白木香种质，表明ass15基因的表达可以有效区分，普通白木香种质和奇楠种质，研究ass15基因的克隆和功能鉴定及表达特性差异可为白木香种质功能性分子标记开发和优良结香种质选育奠定基础。
[0059]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。