1.本发明属于化学及分析检测领域，具体涉及一种一氧化氮光激活荧光探针、及其制备方法和应用。
背景技术：
：：2.一氧化氮(nitricoxide，no)是体内重要的信号分子，参与信号转导、血管舒张、平滑肌松弛等多种生理过程。它主要由一氧化氮合酶(nos)催化l-精氨酸产生no。体内no水平的异常与许多疾病密切相关，包括帕金森病、阿尔茨海默病、血管内皮功能障碍和癌症等。由于no生理浓度低、半衰期短、扩散迅速，而且很容易被含有硫醇的生物分子扩散和消耗，使得实时追踪no具有挑战性。3.检测no的常用方法主要有：griess比色法、电化学传感法和电子自旋共振(esr)光谱法。这些方法无法做到实时、原位的检测no，限制了他们的进一步应用。小分子荧光探针具有高特异性、高灵敏度和非侵入性的特点，是检测生物体内no的一种有效工具。目前，虽然已经涌现了多种no荧光探针，但是在复杂的生物环境下选择性识别no仍然充满挑战：(1)荧光信号容易受到ph、离子以及其他生物大分子等的干扰，导致荧光信号“脱靶”。(2)探针在到达细胞之前，可能与其他分子发生非特异性结合而开启荧光，从而导致检测的灵敏度和信噪比降低。4.光激活荧光探针一般由光激活保护基团(photoactivatableprotectinggroups，ppgs)、荧光团(fluorophore)、识别基团(recognitionsite)组成。以一定波段的光在指定的时间和空间照射，遇到目标物，产生荧光信号；而当只有光照射，或者只有目标物的情况下，则不能引发荧光信号的变化。光激活荧光探针作为一种新型的荧光探针，其传感和成像可以被光远程激活，实现了高时空分辨率成像。5.因此，针对no的检测方法，迫切需要开发一种新型的荧光探针，能够在特定的时间和空间开启荧光信号，实现目标物的高时空分辨成像。技术实现要素：6.本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种一氧化氮光激活荧光探针pno，该探针选用邻硝基苄基作为光敏基团，光解反应迅速，具有检测限低(13nm)，信噪比高，荧光响应倍数高(约500倍)，灵敏度高，选择性好等优势。荧光强度与no(0-20μm)浓度之间具有良好的线性关系，说明探针适合于生物体内一氧化氮的定量检测；并进一步应用探针实现了raw264.7细胞no的荧光成像。7.本发明的另一目的是提供一种上述一氧化氮光激活荧光探针的制备方法。8.本发明的又一发明目的是提供上述一氧化氮光激活荧光探针在检测一氧化氮的应用。9.本发明的技术方案如下：10.一种一氧化氮光激活荧光探针，其探针的结构式如下所示：[0011][0012]本发明在设计光激活响应型荧光探针pno，需要考虑以下几个方面：(1)荧光探针在生理ph下是稳定的；(2)无光照射时，目标物不会引起探针的荧光响应；(3)无目标物时，荧光探针探针给予光照射后也不引起荧光响应；(4)在目标物存在时，给予光照射后产生显著的荧光信号。在此基础上，选择邻硝基苄基作为光激活保护基团，具有优良的光敏感性，发生光解反应速度快。基于no诱导脱氧螺内酰胺的开环反应，构建了用于检测细胞水平no的光激活荧光探针pno，以期实现细胞水平no的高时空分辨率、高灵敏度成像，为检测no提供一种有效工具。目前，no光激活荧光探针尚未见报道。[0013]本发明根据分析物响应型荧光探针和光激活技术的优点，构建了检测no的光激活荧光探针pno，其设计思路如下：(1)荧光母核：以具有高摩尔吸光系数、高荧光量子产率的荧光素作为荧光母核；(2)识别基团：以邻苯二胺为识别基团。该荧光探针结构中，将荧光素酰胺中的羰基还原为亚甲基，由于亚甲基结构的存在，荧光探针与no反应后的苯并三氮唑衍生物不会受到水分子和硫醇分子的干扰，能够更灵敏地检测no。另外，增大了邻苯二胺中氮原子的电子密度，使得探针与no的反应加快，灵敏度增强。(3)光激活保护基团：选用邻硝基苄基作为光激活保护基团，光解反应迅速。[0014]荧光探针在uv(365nm)照射后，邻硝基苄基发生光解反应，光激活保护基团离去，得到化合物puv，化合物puv选择性识别no后，发生重排反应，生成苯并三唑衍生物puvno，产生荧光信号。荧光探针在只有uv或者只有no存在条件下，是没有荧光信号响应的；当探针在uv与no共同存在的条件下，才能开启荧光信号，反应原理如下所示。为了验证探针pno与no的反应原理，利用高分辨质谱(hrms)对探针pno与no反应后的光解产物进行分析。结果如下：探针pno与no在37℃pbs缓冲液中孵育15min，给予uv照射140s，经hrms验证，生成了化合物puvno，m/z＝420.1343[puvno h] ；探针pno经uv照射后，光解生成化合物puv，m/z＝409.1547[puv h] ；探针pno与no孵育后，在m/z＝679.2187[pno h] 处显示主峰，说明由于光保护基团的存在，探针与no不发生反应。[0015]对于本发明而言，上述用于检测一氧化氮的光激活荧光探针pno，其合成路线如下所示：[0016][0017]在一种优选方案中，上述用于检测一氧化氮的光激活荧光探针pno，其制备方法包括如下步骤：[0018][0019][0020]在一种更优选方案中，上述用于检测一氧化氮的光激活荧光探针pno，其制备方法包括如下步骤：[0021]第一步：荧光素与乙酸酐进行回流反应，制备化合物m-3；[0022]第二步：在还原剂的作用下，化合物m-3与氢气进行还原反应制备化合物m-4；[0023]第三步：化合物m-4与酰化剂进行酰化反应制备化合物1；所得化合物1与化合物2进行化学反应制备化合物3，再将得到的化合物3进行酯水解反应制备化合物m-5；[0024]第四步：化合物m-5与硼烷四氢呋喃络合物进行回流反应制备中间体，再将所得中间体继与四氯苯醌进行化学反应，制备化合物m-6；[0025]第五步：在cs2co3存在的条件下，化合物m-6与化合物4进行化学反应制备化合物m-7；[0026]第六步：在酸性条件下，化合物m-7进行水解反应制备荧光探针pno。[0027]在第二步中，化合物m-3与氢气进行还原反应反应时，采用的还原剂为钯/碳，为了获得更好的效果，在反应过程中还原剂(钯/碳)的质量为化合物m-3质量的5～15％，可以但不局限于5％、7％、8％、10％、12％或15％，在不影响本发明效果的情况下，在反应过程中还原剂(钯/碳)的质量为化合物m-3质量的10％。[0028]在第三步中，化合物m-4与酰化剂进行酰化反应制备化合物1时，采用的酰化剂为socl2。[0029]进一步地，化合物1与化合物2进行化学反应制备化合物3时，化合物2的用量可以由化合物m-4的来确定，其中，化合物m-4与化合物2的摩尔比为1:0.5～1.0，可以但不局限于1:0.5、1:0.55、1:0.6、1:0.63、1:0.65、1:0.66、1:0.67、1:0.68、1:0.69、1:0.7、1:0.8、1:0.9或1:1.0，在不影响本发明效果的情况下，在反应过程中化合物m-4与化合物2的摩尔比为1:0.67。[0030]进一步地，化合物3在氢氧化锂的存在下进行酯水解反应。[0031]在第四步中，化合物m-5与硼烷四氢呋喃络合物进行回流反应制备中间体，再将所得中间体继与四氯苯醌进行化学反应，在反应过程中，化合物m-5与四氯苯醌的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3或1:1.5，在不影响本发明效果的情况下，在反应过程中化合物m-5与四氯苯醌的摩尔比为1:1。[0032]在第五步中，化合物m-6与化合物4进行化学反应制备化合物m-7时，化合物m-6与化合物4的摩尔比为1:2～5，可以但不局限于1:2、1:2.5、1:2.8、1:3.0、1:3.2、1:3.5、1:4.0或1:5，在不影响本发明效果的情况下，在反应过程中化合物m-6与化合物4的摩尔比为1:3.0。[0033]进一步地，化合物m-6与cs2co3的摩尔比为1:1.5～3.5，可以但不局限于1:1.5、1:1.8、1:2.0、1:2.2、1:2.5、1:3.0或1:3.5，在不影响本发明效果的情况下，化合物m-6与cs2co3的摩尔比为1:2。[0034]本发明提供的光激活荧光探针pno，在光激活时可以用于定量检测一氧化氮，特别用于细胞水平的一氧化氮检测。[0035]采用本发明的技术方案，优势如下:[0036]本发明提供的荧光探针pno，选用邻硝基苄基作为光敏基团，光解反应迅速，具有检测限低(13nm)，信噪比高，荧光响应倍数高(约500倍)，灵敏度高，选择性好等优势。荧光强度与no(0-20μm)浓度之间具有良好的线性关系，说明探针适合于生物体内一氧化氮的定量检测；并进一步应用pno实现了raw264.7细胞一氧化氮的荧光成像。附图说明[0037]图1是探针pno在uv和/或no存在条件下的反应原理示意图；[0038]图2是化合物m-7的1hnmr图谱；[0039]图3是化合物m-7的13cnmr图谱；[0040]图4是化合物m-7的hrms图谱，calculatedforc45h37n4o9[m-h] 777.2566found777.2559；[0041]图5是荧光探针pno的1hnmr图谱；[0042]图6是荧光探针pno的13cnmr图谱；[0043]图7是荧光探针pno与no反应的hrms图谱，其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)孵育后，给予uv(365nm，20w)照射140s反应产物的hrms(calculatedforc26h18n3o3[m h] 420.1343found420.1343)；(b)探针pno(10μm)给予uv(365nm，20w)照射140s反应产物的hrms(calculatedforc26h21n2o3[m h] 409.1547found409.1547)；(c)探针pno(10μm)与no(100μm)孵育后，反应产物的hrms(calculatedforc40h31n4o7[m h] 679.2187found679.2187)；[0044]图8是探针pno光解动力学荧光光谱变化，探针pno(10μm)与no(100μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)中孵育15min，uv照射时间分别为0,20,40,60,80,100,120,140,160s时的荧光光谱；[0045]图9是探针pno与no反应后的荧光光谱与紫外光谱，其中，(a)pno，pno uv，pno no和pno(10μm) uv(365nm，20w，140s) no(100μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)中的荧光光谱；其中，在520nm处，最高的曲线代表pno uv no，次之为pno uv，最低的曲线为pno no和pno，两条曲线基本重合；(b)pno，pno uv，pno no和pno uv no在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)中的吸收光谱；其中，在500nm处，出现最高峰值的曲线代表pno uv no，其次在400nm处，另外三条曲线中，最高的曲线代表pno no，次之为pno，最低的曲线为pno uv；[0046]图10是探针pno与no反应的时间；其中，(a)pno(10μm)与no(100μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)37℃下分别孵育0，1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，25和30min后，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)pno(10μm)与no(100μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)37℃下分别孵育0，1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，25和30min后，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应；[0047]图11是探针pno与no反应的线性关系及检测限；其中，(a)探针pno(10μm)与不同浓度no(0-160μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与不同浓度no(0-160μm)在pbs缓冲液孵育后，uv(365nm，20w)照射140s的荧光强度变化，插图：荧光强度与不同浓度no(0-20μm)的线性关系.数据以mean±sd表示(n＝3)；[0048]图12是探针pno与no反应的ph影响；其中，(a)pno(10μm)与no(100μm)在不同ph缓冲液(20mm，ph4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.4，7.5，8.0，8.5，9.0，1％dmso)37℃下孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)pno(10μm)、pno(10μm) uv(140s)或pno(10μm) uv(140s) no(100μm)在不同ph缓冲液(20mm，ph4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.4，7.5，8.0，8.5，9.0，1％dmso)37℃下孵育15min的荧光响应；[0049]图13是探针pno对no的选择性；其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)、氨基酸在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,1％dmso)中37℃孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与no(100μm)以及氨基酸孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应,每组分别代表探针pno与氨基酸以及氨基酸和100μmno混合物孵育，uv照射后的响应.1.thr(1mm) no、2.arg(1mm) no、3.lys(1mm) no、4.his(1mm) no、5.trp(1mm) no、6.gly(1mm) no、7.ala(1mm) no、8.glu(1mm) no、9.ser(1mm) no、10.val(1mm) no、11.tyr(1mm) no、12.phe(1mm) no、13.空白 no(100μm)；数据以mean±sd表示(n＝3)；[0050]图14是探针pno对no的选择性；其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)、无机盐离子在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,1％dmso)中37℃孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与no(100μm)以及无机盐离子孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应，每组分别代表探针pno与无机盐离子以及无机盐离子和100μmno混合物孵育，uv照射后的响应.1.na (1mm) no、2.zn2 (1mm) no、3.cu2 (1mm) no、4.ca2 (1mm) no、5.mg2 (1mm) no、6.k (1mm) no、7.cl-(1mm) no、8.br-(1mm) no、9.i-(1mm) no、10.fe3 (1mm) no、11.fe2 (1mm) no、12.h2po4-(1mm) no、13.hpo42-(1mm) no、14.hco3-(1mm) no、15.co32-(1mm) no、16.空白 no(100μm)；数据以mean±sd表示(n＝3)；[0051]图15是探针pno对no的选择性；其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)、活性硫在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,1％dmso)中37℃孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与no(100μm)以及活性硫孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应，每组分别代表探针pno与活性硫以及活性硫和100μmno混合物孵育，uv照射后的响应.1.gsh(1mm) no、2.gsh(10mm) no、3.gssg(1mm) no、4.hcy(1mm) no、5.na2s(1mm) no、6.hso3-(1mm) no、7.so32-(1mm) no、8.so42-(1mm) no、9.s2o32-(1mm) no、10.ch3sssch3(1mm) no、11.cys(1mm) no、12.空白 no(100μm)；数据以mean±sd表示(n＝3)；[0052]图16是探针pno对no的选择性；其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)、活性氧、活性氮、mgo、aa、dha在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,1％dmso)中37℃孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与no(100μm)以及活性氧、活性氮、mgo、aa、dha孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应，每组分别代表探针pno与活性氧、活性氮、mgo、aa、dha以及活性氧、活性氮、mgo、aa、dha与100μmno混合物的响应；1.clo-(200μm) no、2.h2o2(200μm) no、3.·oh(200μm) no、4.o2.-(200μm) no、5.1o2(200μm) no、6.tbhp(200μm) no、7.onoo-(200μm) no、8.no2-(200μm) no、9.no3-(200μm) no、10.mgo(1mm) no、11.aa(1mm) no、12.dha(1mm) no、13.空白 no(100μm)；数据以mean±sd表示(n＝3)；[0053]图17是探针pno对细胞存活率的影响；其中，(a)raw264.7细胞与pno(0,10,20,30,50,100μm)孵育24h细胞的存活率；(b)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育不同时间(0,6,12,18,24h)细胞的存活率；[0054]图18是紫外光照射对细胞存活率的影响，raw264.7细胞给予uv(365nm，20w)照射不同时间(0,1,2,4,6min)细胞的存活率；[0055]图19是探针pno检测外源性no的荧光成像；其中，(a-a2)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育30min，与dea·nonoate(100μm)孵育15min后的荧光图像；(b-b2)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育30min后，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；(c-c2)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育30min，再与dea·nonoate(50μm)孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；(d-d2)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育30min，再与dea·nonoate(100μm)孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；[0056]图20代表图19中细胞的平均荧光强度，数据以mean±sd表示(n＝3)；*p《0.001vsa1和b1；[0057]图21是探针pno检测内源性no的荧光成像；其中，(a-a2)raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min后，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；(b-b2)raw264.7细胞与lps(终浓度20μg/ml)和l-arg(终浓度5mg/ml)预孵育12h，再与探针pno(20μm)孵育30min后的荧光图像；(c-c2)raw264.7细胞与lps(终浓度20μg/ml)和l-arg(终浓度5mg/ml)预孵育12h，再与探针pno(20μm)孵育30min后，uv(365nm，20w)照射140s的荧光图像；(d-d2)raw264.7细胞与n-硝基-l-精氨酸甲酯(l-name，nos抑制剂)(20μm)预孵育2h，然后与lps(终浓度20μg/ml)和l-arg(终浓度5mg/ml)孵育12h，再与探针pno(20μm)孵育30min，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；[0058]图22代表图21中细胞的平均荧光强度，数据以mean±sd表示(n＝3).*p《0.001vsa1和b1.#p《0.001vsc1。具体实施方式[0059]通过以下实施例并结合附图对本发明的荧光探针作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。[0060]一、实施方法[0061]1.溶液的配置[0062](1)探针pno溶液的配制：pno(6.78mg,0.01mmol)溶解于dmso(10ml)中得到1mm的探针溶液。探针溶液需要现配现用。[0063](2)no储备液的配制：2-(n,n-二乙基氨基)-二氮烯-2-氧钠盐水合物(dea·nonoate)溶解于0.01mmnaoh溶液中得到10mm的no储备液。将其稀释成1.0mm-100μm的溶液备用。no储备液需要现用现配。[0064](3)na2s储备液的配制(作为h2s的来源)：在氮气条件下，将na2s·9h2o(24mg，0.1mmol)溶于溶液中，配成10mmna2s储备液，根据实验需要将na2s储备液稀释到所需浓度。[0065](4)cys(l-半胱氨酸)储备液的配制：cys(12.1mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10ml)中得到10.0mm的储备液，将储备液稀释成1.0mm的溶液备用。[0066](5)hcy(同型半胱氨酸)储备液的配制：hcy(13.5mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10ml)中得到10.0mm的储备液，将储备液稀释成100μm的溶液备用。[0067](6)gsh(谷胱甘肽)储备液的配制:gsh(30.7mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10ml)中得到10.0mm储备液，将储备液稀释成1.0mm和10.0mm的溶液备用。[0068](7)其他生物分析物的储备溶液，包括ala,glu,trp,tyr,val,ser,pro,arg,gly,phe,his,lys等氨基酸；zn2 ,na ,k ,mg2 ,cu2 ,ca2 ,cl-,br-,i-,fe3 ,fe2 ,hpo42-,h2po4-,co32-,hco3-等无机盐离子；活性硫类化合物如gsh,gssg,ch3sssch3,hcy,s2o32-,so42-,so32-,hso3-,na2s,cys；活性氧类化合物如h2o2,ocl-,o2-,1o2,·oh,tbuooh；活性氮类化合物如no2-,no,no3-,onoo-,都在双蒸水中制备，配制成1.0mm的储存液，避光保存于4℃冰箱中。[0069](8)超氧阴离子自由基(o2-)根据文献报道的方法制备。·oh通过feii(edta)与等当量的h2o2之间的fenton反应产生。no从3-(氨基丙基)-1-3-羟基-3-异丙基-2‑ꢀ代-1-三氮烯(noc-5,50μmol/ml)产生。[0070]2.细胞[0071]种属和品系：小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7细胞株。来源：上海盖宁生物科技有限公司。[0072]二、实施例[0073]2.1荧光探针pno制备[0074]2.1.1化合物m-3的合成[0075][0076]荧光素(1g,3mmol)溶于乙酸酐(20ml)溶液中，加热进行回流反应，直到溶液中的荧光消失。反应完毕后，将反应混合物冷却至70℃-80℃后倒入200ml冰水中，边倒入边搅拌，静置过夜。收集沉淀，用水洗涤并干燥。然后用乙醇对粗品进行重结晶，得白色固体906mg，产率为72.6％。tlc(silica,pe:ea,2:1v/v)：rf＝0.5。[0077]2.1.2化合物m-4的合成[0078][0079]将化合物m-3(153mg,0.367mmol)溶于15ml乙酸乙酯中，加入10％钯/碳(15mg)，通入氢气，在室温下反应18h，抽滤，滤液减压浓缩得粗品。粗品通过柱层析(dcm:meoh，30:1v/v)纯化得白色固体130mg，产率为85％。tlc(silica,dcm:meoh,40:1v/v)：rf＝0.3。[0080]2.1.3化合物m-5的合成[0081][0082]将化合物m-4(418mg,1mmol)溶于socl2(3ml)中，在氮气保护下回流反应2h。反应完毕后，冷却到室温，减压除去socl2。将浓缩后的残留物溶解在无水ch3cn(20ml)中，加入到et3n(405mg,4mmol)和n-boc-1,2-苯二胺(140mg，0.67mmol)的混合溶液中。所得混合物在0℃下反应0.5h后，再室温反应3h。向上述反应液中加入水(100ml)淬灭反应，用乙酸乙酯萃取(3×30ml)。有机相用无水na2so4干燥，减压浓缩。[0083]将上述减压浓缩后所得产物溶于thf(20ml)中，用0.3mol/l氢氧化锂水溶液(20ml)处理。所得混合溶液在室温下反应4h，用1mol/l盐酸将混合物的ph调至1-2，然后用盐水洗涤，乙酸乙酯萃取(3×30ml)，有机相用无水na2so4干燥，减压浓缩。粗品通过柱层析(dcm:meoh,60:1v/v)纯化得橘黄色油状物105mg，产率为20％。tlc(silica,dcm:meoh,30:1v/v)：rf＝0.3。[0084]2.1.4化合物m-6的合成[0085][0086]将化合物m-5(524.5mg,1mmol)溶于无水thf(15ml)中，逐滴滴加1m硼烷四氢呋喃络合物溶液(5ml)，氮气保护下回流反应4h。冷却到室温后，向上述反应液中加入甲醇(30ml)淬灭反应，减压除去溶剂，得到粗中间体。[0087]将所得粗中间体溶解在20mlch2cl2中，加入四氯苯醌(245.8mg,1mmol)，混合物在室温下反应2h。然后将反应混合物减压浓缩。所得粗品经快速柱层析(dcm:meoh,10:1v/v)纯化得到橘黄色油状液体407mg，产率为70％。tlc(silica,dcm:meoh,30:1v/v)：rf＝0.5。[0088]2.1.5化合物m-7的合成[0089][0090]将1-(1-溴乙基)-2-硝基苯(131mg,0.57mmol)和化合物m-6(97mg,0.19mmol)溶于dmf(1ml)中，在氮气保护下反应15min，快速加入cs2co3(124mg,0.38mmol)，室温反应6h。反应完毕后，将反应液倒入饱和氯化铵水溶液(10ml)中，乙酸乙酯萃取(3×30ml)，用无水na2so4干燥，减压浓缩，粗品通过柱层析(pe:ea,4:1v/v)纯化得到黄色固体150mg，产率52％。tlc(silica,pe:ea,4:1v/v)：rf＝0.5。1hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.18(d,j＝8.0hz,2h),7.96(d,j＝7.6hz,1h),7.83(d,j＝7.6hz,2h),7.70(t,j＝7.2,8.0hz,2h),7.51-7.37(m,7h),7.12(d,j＝7.2hz,1h),7.02(t,j＝7.2,8.4hz,1h),6.91(d,j＝8.4hz,2h),6.78(dd,j＝8.4,2.4hz,2h),6.55-6.51(m,3h),6.11(d,j＝8.8hz,1h),5.48(d,j＝2.4hz,4h),4.42(s,2h),1.41(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)：δ158.45,153.30,152.34,146.94,144.52,140.92,138.18,134.14,133.54,131.88,129.82,128.53,128.49,128.30,128.04,127.76,127.28,125.16,124.98,122.18,121.03,116.88,116.56,111.97,101.71,79.46,70.25,67.02,57.64,28.39.具体如图2-4所示。[0091]2.1.6探针pno的合成[0092][0093]化合物m-7(555mg,0.71mmol)溶于ch2cl2(15ml)中，滴加浓盐酸2.5ml，溶液由黄色变为黄褐色，室温反应2h，然后用三乙胺调ph至8.0，所得混合物用ch2cl2萃取(3×30ml)，减压浓缩除去溶剂。将得到的粗品经快速柱层析(dcm:meoh,10:1v/v)纯化得淡黄色固体450mg，化合物pno的产率为80％。tlc(silica,pe:ea,2:1v/v)：rf＝0.5。1hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.17(dd,j＝8.0,0.8hz,2h),7.87(d,j＝7.6hz,2h),7.69(t,j＝8.0hz,2h),7.50(t,j＝8.4,7.2hz,2h),7.43-7.42(m,2h),7.38-7.34(m,1h),7.06(d,j＝7.6hz,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.85-6.81(m,1h),6.74(dd,j＝8.4,2.4hz,2h),6.58(d,j＝2.4hz,2h),6.49(dd,j＝8.0,1.2hz,1h),6.31-6.27(m,1h),6.06(dd,j＝8.0,1.2hz,1h),5.48(s,4h),4.48(s,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)：δ158.40,153.32,147.06,146.27,145.26,141.06,134.03,133.61,130.61,130.22,128.63,128.54,128.50,128.04,127.82,127.01,125.13,124.84,122.12,118.01,117.71,115.42,111.27,101.85,69.72,67.04,57.18.具体如图5-6所示。荧光探针pno的hrms图谱，calculatedforc40h31n4o7[m-h] 679.2187found679.2181。[0094]2.2探针pno识别no的原理[0095]pno(68mg，0.10mmol)溶于dmso(15ml)中，加入含有dea·nonoate(310mg，2.0mmol)的pbs缓冲液(30ml，20mm，ph＝7.4)，在37℃反应30min。二氯甲烷(3×10ml)萃取，减压浓缩，将产物进行提取分离，通过hrms确认反应产物，从而确认探针pno与no的反应原理。具体如图7所示。[0096]2.3光谱性能的测定[0097]2.3.1体外光解动力学实验[0098]记录探针pno在紫外光(uv365nm,20w)下连续照射不同时间后，与no反应的荧光光谱和紫外吸收光谱的变化，确定最佳的光解时间。[0099]2.3.2紫外光谱的测定[0100]uv光谱采用岛津uv-2600紫外-可见分光光度计测定。将探针pno、探针pno uv照射、探针pno no、探针pno no uv照射后的溶液进行全波长扫描，测定其吸收光谱。[0101]2.3.3荧光光谱的测定[0102]将探针pno用溶剂dmso溶解，加入到石英比色皿中。将探针pno用pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4)进行稀释，加入不同浓度的dea·nonoate(dea·nonoate作为no的供体)孵育，测定其荧光强度。每组数据至少平行三次，结果以mean±sd表示。[0103]测试条件：荧光测量实验均在室温下用安捷伦caryeclipse荧光分光光度计测定。激发波长为495nm，激发狭缝宽度5nm，发射狭缝宽度5nm，扫描速度600nm/min，发射光谱范围在500-750nm。光电倍增管的电压设为600v。[0104]2.3.4检测限的测定[0105]最低检测限按文献报道方法计算。探针pno自身的荧光强度比值测定10次，计算10次测定的荧光强度比值的标准偏差，再将探针与no反应，得到no浓度与荧光强度的线性方程。检测限的计算公式为：3σ/k。k代表荧光强度与no浓度线性方程的斜率，σ代表空白样的标准偏差。[0106]2.4raw264.7细胞的复苏、培养、传代和冻存[0107]2.5细胞毒性的测定[0108]采用mtt法测定探针pno的细胞毒性。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。raw264.7细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，然后在5％co2培养箱进行培养。将细胞分别与不同浓度的pno(0,10,20,30,50,100μm)孵育24h。24h后，每个孔中加入20μlmtt染料(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物，5mg/ml，溶于pbs缓冲液中)，继续在37℃条件下孵育4h。随后除去剩余的mtt溶液，并向各孔中加150μl的dmso以溶解甲瓒结晶。摇床震荡10min后，用酶标仪测量570nm的吸光度。在相同处理条件下，以没有添加探针的作为对照孔，用调零孔(dmso mtt)校准吸光度值，各组细胞存活率计算公式为：细胞相对存活率＝(实验孔od值-调零孔od值)/(对照孔od值-调零孔od值)×100％。最终处理数据，绘制柱状图。每个样品重复三次，整个实验重复三次。[0109]2.6细胞水平荧光成像[0110]2.6.1外源性no的细胞成像[0111]为检测探针pno对细胞内no的特异性识别能力以及探针的生物相容性，本专利进行raw264.7细胞的激光共聚焦显微镜成像。倒置显微镜下观察细胞，生长状态良好且达到60％-80％融合时(处于对数生长期)，以2×104cells/ml的密度接种于共聚焦培养皿内，待细胞长至60％-80％密度且状态良好时，将raw264.7细胞与探针pno溶液(终浓度为20μm)孵育30min，再与no(终浓度100μm)孵育15min，uv照射140s成像。在成像前，用磷酸盐缓冲液(3×1ml)洗涤细胞三次，使用超高分辨激光扫描共聚焦显微镜(徕卡stellaris5)进行成像。[0112]2.6.2内源性no的细胞成像[0113]将raw264.7细胞与lps(终浓度20μg/ml)和l-arg(终浓度5mg/ml)孵育12h后，用磷酸盐缓冲液(3×1ml)缓和洗涤，再加入探针pno溶液(终浓度为20μm)孵育30min，然后用uv照射140s。抑制剂组：将raw264.7细胞与n-硝基-l-精氨酸甲酯(10μm，l-name，no合成酶抑制剂)预孵育2h，再与lps和l-arg孵育12h后，加入探针pno溶液(终浓度为20μm)孵育30min，然后用uv照射140s。在成像前，用磷酸盐缓冲液(3×1ml)洗涤细胞三次，使用超高分辨激光扫描共聚焦显微镜(徕卡stellaris5)进行成像。[0114]2.7数据处理[0115]数据以均数±标准差(mean±sd)表示，使用spss22.0软件进行统计分析。多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-wayanova)。p＜0.05表示差异有统计学意义。[0116]三、效果验证[0117]3探针pno的光学性能检测[0118]3.1荧光探针pno的光解动力学[0119]为了进一步考察探针pno对no的响应性能。首先，进行了探针pno的光解动力学实验。探针pno与no(100μm)孵育15min后，紫外光(365nm，20w)照射不同的时间。如图8所示，经过140s的紫外光照射，518nm处的荧光强度达到峰值，说明探针pno完全光解。因此，选择140s紫外光照射时间进一步考察pno对no的灵敏度和选择性。[0120]3.2荧光探针pno与no反应的荧光光谱与紫外光谱[0121]本专利中考察了探针pno在紫外光(365nm，20w，140s)照射前后的荧光光谱和吸收光谱。脱氧螺内酰胺处于闭环状态，探针pno是无荧光的；由于光激活保护基团邻硝基苄基的存在，探针被关在“笼子”中，与识别物no孵育，没有明显的紫外吸收，也不能引起探针的荧光开启，这使得探针的背景荧光较低；探针pno经紫外光照射后，几乎没有荧光产生；探针pno经紫外光照射后，邻硝基苄基离去，与识别物no反应，最大吸收峰为499nm，同时在518nm处荧光显著增强(图9)。结合荧光光谱及紫外吸收光谱，可以进一步验证图7所示的探针pno的识别机理。[0122]3.3荧光探针pno与no的反应时间[0123]探针pno(10μm)与no(100μm)孵育不同的时间后，紫外光(365nm，20w)照射140s，观察到荧光强度在15min左右达到峰值，说明15min左右pno与no(100μm)反应完全。反应时间延长至30min，荧光强度未见减弱，荧光强度较稳定(图10)。[0124]3.4荧光探针pno与no反应的线性关系以及检测限[0125]将探针pno与不同浓度的no(0-160μm)孵育，考察探针pno对生物样本中no进行定量检测的适用性。无论是否存在no，探针pno在未给予紫外光(365nm，20w，140s)照射之前，反应液无荧光；当探针pno给予紫外光照射之后，与不同浓度的no(0-160μm)孵育后，在518nm处的荧光强度随着no浓度的增加而逐渐增强，当no浓度达到100μm及以上时，荧光强度达到峰值，该峰值是探针pno只与no(0-160μm)孵育荧光强度的500倍。no在0-20μm范围内与荧光强度呈现出良好的线性关系，在pbs缓冲液中，探针pno检测no的检测限为13nm。当探针pno与no的反应比例为1:10时，荧光强度达到峰值，反应趋于饱和(图11)。上述结果显示探针pno具有较好的检测灵敏度，适合定量检测复杂生物体内no水平。[0126]3.5荧光探针pno与no反应ph的影响[0127]为了探究ph对探针pno检测no的影响，将探针与no在不同ph的pbs缓冲液中进行孵育。探针在ph6.5-9.0时荧光响应较高(图12)，但在ph4.0-6.0范围内荧光响应较低并且荧光强度随着酸性增加逐渐下降，原因是酸性条件下，荧光素衍生物的脱氧内酰胺环处于闭环状态，几乎没有荧光。上述结果表明，探针pno适用于生理条件下(ph7.4)no的定量检测。[0128]3.6荧光探针pno检测no的选择性[0129]由于生物体内环境的复杂性，探针需要有较高的选择性，来实现对no的精准检测。如图13-16所示，只有当no存在时，荧光强度才会大幅度增加。其他不含巯基的氨基酸(包括ala,glu,trp,tyr,val,ser,arg,gly,phe,his,lys)、无机盐离子(包括zn2 ,na ,k ,mg2 ,cu2 ,ca2 ,cl-,br-,i-,fe3 ,fe2 ,hpo42-,h2po4-,co32-,hco3-)、活性硫(包括gsh,gssg,ch3sssch3,hcy,s2o32-,so42-,so32-,hso3-,na2s,cys)、活性氧及活性氮(包括h2o2,ocl-,o2-,1o2,·oh,tbuooh,no2-,no,no3-,onoo-)、mgo/aa/dha仅引起了微弱的荧光变化。此外，竞争性实验结果表明，no与上述多种物质共同孵育也不影响探针pno与no的荧光响应。由上述结果可知，探针pno可以特异性识别no，不受其他活性物质的干扰。[0130]4细胞水平一氧化氮的荧光成像[0131]4.1荧光探针pno的mtt细胞毒性实验[0132]在进行探针pno检测细胞内no的荧光成像实验之前，需要进行细胞毒性实验，确定对细胞无影响的合适探针浓度。如图17a图所示，不同浓度的探针pno(0,10,20,30,50,100μm)与raw264.7细胞孵育24h后，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7的存活率较高，即使浓度为100μm时，细胞的存活率也超过90％。如图17b图所示，将20μmpno与raw264.7细胞孵育6,12,18,24h后，细胞存活率仍在90％以上。由此说明pno对raw264.7细胞存活率几乎没有影响，具有低毒性。[0133]另外，进行光毒性研究。如图18所示，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7给予不同时间的紫外光(365nm，20w)照射，结果表明，当紫外光照射6min时，细胞的存活率超过90％。由此说明紫外光对raw264.7细胞几乎没有影响。[0134]4.2外源性一氧化氮的细胞荧光成像[0135]探针pno在体外测试条件下具有良好的灵敏度与选择性，随后我们继续探究探针能否检测细胞中的no。先将raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min，然后与100μmdea·nonoate(no供体)孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s，细胞内可见明亮的绿色荧光(图19c1，图20)。然而，raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min后，与100μmdea·nonoate(no供体)孵育15min，未经紫外光照射，细胞内几乎观察不到荧光(图19a1，图20)；raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min，uv(365nm，20w)照射140s，细胞内也没有明显的荧光增强(图19b1，图20)。综上所述，该探针可以用于活细胞中外源no的细胞成像。由图19可知，细胞在整个拍摄过程中形态良好。[0136]4.3内源性一氧化氮的细胞荧光成像[0137]本专利继续考察探针pno能否在活细胞中进行内源性no的荧光成像。由于no是巨噬细胞产生的炎症因子，lps和l-arg刺激raw264.7细胞产生内源性no，可达到纳摩尔到微摩尔水平。因此，本实验采用lps(20μg/ml)和l-arg(5mg/ml)与细胞孵育的方法来诱导内源性no的产生。raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min，uv(365nm，20w)照射140s后，细胞内未见荧光(图21a1，图22)；raw264.7细胞与lps和l-arg预孵育12h，与探针pno(20μm)孵育30min，没有uv照射时，细胞内几乎观察不到荧光(图21b1，图22)；raw264.7细胞与lps和l-arg预孵育12h，再与探针pno(20μm)孵育30min后，uv(365nm，20w)照射140s，细胞内显示出明亮的绿色荧光(图21c1，图22)；此外，将细胞用n-硝基-l-精氨酸甲酯(l-name，nos抑制剂)(20μm)预孵育2h，与lps和l-arg孵育12h，再与探针pno孵育30min，然后给予uv(365nm，20w)照射140s，可见细胞内的荧光显著减弱(图21d1，图22)，说明c1图中的荧光是由no引起的。上述结果说明探针pno可以进行细胞内源性no荧光成像。[0138]综上所述，本发明提供的基于荧光素的no光激活荧光探针pno，该探针在uv照射后，邻硝基苄基发生光解反应，光激活保护基团离去，然后探针与no反应，发生重排反应，释放出化合物puvno，产生荧光信号。探针在只有uv或者只有no存在条件下，是没有荧光信号响应的；当探针在uv与no共同存在的条件下，才能开启荧光信号。该探针检测限低(13nm)，信噪比高，荧光响应倍数高(约500倍)，灵敏度高，选择性好。荧光强度与no(0-20μm)浓度之间具有良好的线性关系，说明探针适合于生物体内一氧化氮的定量检测，并进一步应用pno实现了raw264.7细胞中外源性和内源性no的荧光成像。[0139]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：2.一氧化氮(nitricoxide，no)是体内重要的信号分子，参与信号转导、血管舒张、平滑肌松弛等多种生理过程。它主要由一氧化氮合酶(nos)催化l-精氨酸产生no。体内no水平的异常与许多疾病密切相关，包括帕金森病、阿尔茨海默病、血管内皮功能障碍和癌症等。由于no生理浓度低、半衰期短、扩散迅速，而且很容易被含有硫醇的生物分子扩散和消耗，使得实时追踪no具有挑战性。3.检测no的常用方法主要有：griess比色法、电化学传感法和电子自旋共振(esr)光谱法。这些方法无法做到实时、原位的检测no，限制了他们的进一步应用。小分子荧光探针具有高特异性、高灵敏度和非侵入性的特点，是检测生物体内no的一种有效工具。目前，虽然已经涌现了多种no荧光探针，但是在复杂的生物环境下选择性识别no仍然充满挑战：(1)荧光信号容易受到ph、离子以及其他生物大分子等的干扰，导致荧光信号“脱靶”。(2)探针在到达细胞之前，可能与其他分子发生非特异性结合而开启荧光，从而导致检测的灵敏度和信噪比降低。4.光激活荧光探针一般由光激活保护基团(photoactivatableprotectinggroups，ppgs)、荧光团(fluorophore)、识别基团(recognitionsite)组成。以一定波段的光在指定的时间和空间照射，遇到目标物，产生荧光信号；而当只有光照射，或者只有目标物的情况下，则不能引发荧光信号的变化。光激活荧光探针作为一种新型的荧光探针，其传感和成像可以被光远程激活，实现了高时空分辨率成像。5.因此，针对no的检测方法，迫切需要开发一种新型的荧光探针，能够在特定的时间和空间开启荧光信号，实现目标物的高时空分辨成像。技术实现要素：6.本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种一氧化氮光激活荧光探针pno，该探针选用邻硝基苄基作为光敏基团，光解反应迅速，具有检测限低(13nm)，信噪比高，荧光响应倍数高(约500倍)，灵敏度高，选择性好等优势。荧光强度与no(0-20μm)浓度之间具有良好的线性关系，说明探针适合于生物体内一氧化氮的定量检测；并进一步应用探针实现了raw264.7细胞no的荧光成像。7.本发明的另一目的是提供一种上述一氧化氮光激活荧光探针的制备方法。8.本发明的又一发明目的是提供上述一氧化氮光激活荧光探针在检测一氧化氮的应用。9.本发明的技术方案如下：10.一种一氧化氮光激活荧光探针，其探针的结构式如下所示：[0011][0012]本发明在设计光激活响应型荧光探针pno，需要考虑以下几个方面：(1)荧光探针在生理ph下是稳定的；(2)无光照射时，目标物不会引起探针的荧光响应；(3)无目标物时，荧光探针探针给予光照射后也不引起荧光响应；(4)在目标物存在时，给予光照射后产生显著的荧光信号。在此基础上，选择邻硝基苄基作为光激活保护基团，具有优良的光敏感性，发生光解反应速度快。基于no诱导脱氧螺内酰胺的开环反应，构建了用于检测细胞水平no的光激活荧光探针pno，以期实现细胞水平no的高时空分辨率、高灵敏度成像，为检测no提供一种有效工具。目前，no光激活荧光探针尚未见报道。[0013]本发明根据分析物响应型荧光探针和光激活技术的优点，构建了检测no的光激活荧光探针pno，其设计思路如下：(1)荧光母核：以具有高摩尔吸光系数、高荧光量子产率的荧光素作为荧光母核；(2)识别基团：以邻苯二胺为识别基团。该荧光探针结构中，将荧光素酰胺中的羰基还原为亚甲基，由于亚甲基结构的存在，荧光探针与no反应后的苯并三氮唑衍生物不会受到水分子和硫醇分子的干扰，能够更灵敏地检测no。另外，增大了邻苯二胺中氮原子的电子密度，使得探针与no的反应加快，灵敏度增强。(3)光激活保护基团：选用邻硝基苄基作为光激活保护基团，光解反应迅速。[0014]荧光探针在uv(365nm)照射后，邻硝基苄基发生光解反应，光激活保护基团离去，得到化合物puv，化合物puv选择性识别no后，发生重排反应，生成苯并三唑衍生物puvno，产生荧光信号。荧光探针在只有uv或者只有no存在条件下，是没有荧光信号响应的；当探针在uv与no共同存在的条件下，才能开启荧光信号，反应原理如下所示。为了验证探针pno与no的反应原理，利用高分辨质谱(hrms)对探针pno与no反应后的光解产物进行分析。结果如下：探针pno与no在37℃pbs缓冲液中孵育15min，给予uv照射140s，经hrms验证，生成了化合物puvno，m/z＝420.1343[puvno h] ；探针pno经uv照射后，光解生成化合物puv，m/z＝409.1547[puv h] ；探针pno与no孵育后，在m/z＝679.2187[pno h] 处显示主峰，说明由于光保护基团的存在，探针与no不发生反应。[0015]对于本发明而言，上述用于检测一氧化氮的光激活荧光探针pno，其合成路线如下所示：[0016][0017]在一种优选方案中，上述用于检测一氧化氮的光激活荧光探针pno，其制备方法包括如下步骤：[0018][0019][0020]在一种更优选方案中，上述用于检测一氧化氮的光激活荧光探针pno，其制备方法包括如下步骤：[0021]第一步：荧光素与乙酸酐进行回流反应，制备化合物m-3；[0022]第二步：在还原剂的作用下，化合物m-3与氢气进行还原反应制备化合物m-4；[0023]第三步：化合物m-4与酰化剂进行酰化反应制备化合物1；所得化合物1与化合物2进行化学反应制备化合物3，再将得到的化合物3进行酯水解反应制备化合物m-5；[0024]第四步：化合物m-5与硼烷四氢呋喃络合物进行回流反应制备中间体，再将所得中间体继与四氯苯醌进行化学反应，制备化合物m-6；[0025]第五步：在cs2co3存在的条件下，化合物m-6与化合物4进行化学反应制备化合物m-7；[0026]第六步：在酸性条件下，化合物m-7进行水解反应制备荧光探针pno。[0027]在第二步中，化合物m-3与氢气进行还原反应反应时，采用的还原剂为钯/碳，为了获得更好的效果，在反应过程中还原剂(钯/碳)的质量为化合物m-3质量的5～15％，可以但不局限于5％、7％、8％、10％、12％或15％，在不影响本发明效果的情况下，在反应过程中还原剂(钯/碳)的质量为化合物m-3质量的10％。[0028]在第三步中，化合物m-4与酰化剂进行酰化反应制备化合物1时，采用的酰化剂为socl2。[0029]进一步地，化合物1与化合物2进行化学反应制备化合物3时，化合物2的用量可以由化合物m-4的来确定，其中，化合物m-4与化合物2的摩尔比为1:0.5～1.0，可以但不局限于1:0.5、1:0.55、1:0.6、1:0.63、1:0.65、1:0.66、1:0.67、1:0.68、1:0.69、1:0.7、1:0.8、1:0.9或1:1.0，在不影响本发明效果的情况下，在反应过程中化合物m-4与化合物2的摩尔比为1:0.67。[0030]进一步地，化合物3在氢氧化锂的存在下进行酯水解反应。[0031]在第四步中，化合物m-5与硼烷四氢呋喃络合物进行回流反应制备中间体，再将所得中间体继与四氯苯醌进行化学反应，在反应过程中，化合物m-5与四氯苯醌的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3或1:1.5，在不影响本发明效果的情况下，在反应过程中化合物m-5与四氯苯醌的摩尔比为1:1。[0032]在第五步中，化合物m-6与化合物4进行化学反应制备化合物m-7时，化合物m-6与化合物4的摩尔比为1:2～5，可以但不局限于1:2、1:2.5、1:2.8、1:3.0、1:3.2、1:3.5、1:4.0或1:5，在不影响本发明效果的情况下，在反应过程中化合物m-6与化合物4的摩尔比为1:3.0。[0033]进一步地，化合物m-6与cs2co3的摩尔比为1:1.5～3.5，可以但不局限于1:1.5、1:1.8、1:2.0、1:2.2、1:2.5、1:3.0或1:3.5，在不影响本发明效果的情况下，化合物m-6与cs2co3的摩尔比为1:2。[0034]本发明提供的光激活荧光探针pno，在光激活时可以用于定量检测一氧化氮，特别用于细胞水平的一氧化氮检测。[0035]采用本发明的技术方案，优势如下:[0036]本发明提供的荧光探针pno，选用邻硝基苄基作为光敏基团，光解反应迅速，具有检测限低(13nm)，信噪比高，荧光响应倍数高(约500倍)，灵敏度高，选择性好等优势。荧光强度与no(0-20μm)浓度之间具有良好的线性关系，说明探针适合于生物体内一氧化氮的定量检测；并进一步应用pno实现了raw264.7细胞一氧化氮的荧光成像。附图说明[0037]图1是探针pno在uv和/或no存在条件下的反应原理示意图；[0038]图2是化合物m-7的1hnmr图谱；[0039]图3是化合物m-7的13cnmr图谱；[0040]图4是化合物m-7的hrms图谱，calculatedforc45h37n4o9[m-h] 777.2566found777.2559；[0041]图5是荧光探针pno的1hnmr图谱；[0042]图6是荧光探针pno的13cnmr图谱；[0043]图7是荧光探针pno与no反应的hrms图谱，其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)孵育后，给予uv(365nm，20w)照射140s反应产物的hrms(calculatedforc26h18n3o3[m h] 420.1343found420.1343)；(b)探针pno(10μm)给予uv(365nm，20w)照射140s反应产物的hrms(calculatedforc26h21n2o3[m h] 409.1547found409.1547)；(c)探针pno(10μm)与no(100μm)孵育后，反应产物的hrms(calculatedforc40h31n4o7[m h] 679.2187found679.2187)；[0044]图8是探针pno光解动力学荧光光谱变化，探针pno(10μm)与no(100μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)中孵育15min，uv照射时间分别为0,20,40,60,80,100,120,140,160s时的荧光光谱；[0045]图9是探针pno与no反应后的荧光光谱与紫外光谱，其中，(a)pno，pno uv，pno no和pno(10μm) uv(365nm，20w，140s) no(100μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)中的荧光光谱；其中，在520nm处，最高的曲线代表pno uv no，次之为pno uv，最低的曲线为pno no和pno，两条曲线基本重合；(b)pno，pno uv，pno no和pno uv no在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)中的吸收光谱；其中，在500nm处，出现最高峰值的曲线代表pno uv no，其次在400nm处，另外三条曲线中，最高的曲线代表pno no，次之为pno，最低的曲线为pno uv；[0046]图10是探针pno与no反应的时间；其中，(a)pno(10μm)与no(100μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)37℃下分别孵育0，1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，25和30min后，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)pno(10μm)与no(100μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)37℃下分别孵育0，1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，25和30min后，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应；[0047]图11是探针pno与no反应的线性关系及检测限；其中，(a)探针pno(10μm)与不同浓度no(0-160μm)在pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4，1％dmso)孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与不同浓度no(0-160μm)在pbs缓冲液孵育后，uv(365nm，20w)照射140s的荧光强度变化，插图：荧光强度与不同浓度no(0-20μm)的线性关系.数据以mean±sd表示(n＝3)；[0048]图12是探针pno与no反应的ph影响；其中，(a)pno(10μm)与no(100μm)在不同ph缓冲液(20mm，ph4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.4，7.5，8.0，8.5，9.0，1％dmso)37℃下孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)pno(10μm)、pno(10μm) uv(140s)或pno(10μm) uv(140s) no(100μm)在不同ph缓冲液(20mm，ph4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.4，7.5，8.0，8.5，9.0，1％dmso)37℃下孵育15min的荧光响应；[0049]图13是探针pno对no的选择性；其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)、氨基酸在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,1％dmso)中37℃孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与no(100μm)以及氨基酸孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应,每组分别代表探针pno与氨基酸以及氨基酸和100μmno混合物孵育，uv照射后的响应.1.thr(1mm) no、2.arg(1mm) no、3.lys(1mm) no、4.his(1mm) no、5.trp(1mm) no、6.gly(1mm) no、7.ala(1mm) no、8.glu(1mm) no、9.ser(1mm) no、10.val(1mm) no、11.tyr(1mm) no、12.phe(1mm) no、13.空白 no(100μm)；数据以mean±sd表示(n＝3)；[0050]图14是探针pno对no的选择性；其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)、无机盐离子在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,1％dmso)中37℃孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与no(100μm)以及无机盐离子孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应，每组分别代表探针pno与无机盐离子以及无机盐离子和100μmno混合物孵育，uv照射后的响应.1.na (1mm) no、2.zn2 (1mm) no、3.cu2 (1mm) no、4.ca2 (1mm) no、5.mg2 (1mm) no、6.k (1mm) no、7.cl-(1mm) no、8.br-(1mm) no、9.i-(1mm) no、10.fe3 (1mm) no、11.fe2 (1mm) no、12.h2po4-(1mm) no、13.hpo42-(1mm) no、14.hco3-(1mm) no、15.co32-(1mm) no、16.空白 no(100μm)；数据以mean±sd表示(n＝3)；[0051]图15是探针pno对no的选择性；其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)、活性硫在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,1％dmso)中37℃孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与no(100μm)以及活性硫孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应，每组分别代表探针pno与活性硫以及活性硫和100μmno混合物孵育，uv照射后的响应.1.gsh(1mm) no、2.gsh(10mm) no、3.gssg(1mm) no、4.hcy(1mm) no、5.na2s(1mm) no、6.hso3-(1mm) no、7.so32-(1mm) no、8.so42-(1mm) no、9.s2o32-(1mm) no、10.ch3sssch3(1mm) no、11.cys(1mm) no、12.空白 no(100μm)；数据以mean±sd表示(n＝3)；[0052]图16是探针pno对no的选择性；其中，(a)探针pno(10μm)与no(100μm)、活性氧、活性氮、mgo、aa、dha在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,1％dmso)中37℃孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光光谱；(b)探针pno(10μm)与no(100μm)以及活性氧、活性氮、mgo、aa、dha孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s的荧光响应，每组分别代表探针pno与活性氧、活性氮、mgo、aa、dha以及活性氧、活性氮、mgo、aa、dha与100μmno混合物的响应；1.clo-(200μm) no、2.h2o2(200μm) no、3.·oh(200μm) no、4.o2.-(200μm) no、5.1o2(200μm) no、6.tbhp(200μm) no、7.onoo-(200μm) no、8.no2-(200μm) no、9.no3-(200μm) no、10.mgo(1mm) no、11.aa(1mm) no、12.dha(1mm) no、13.空白 no(100μm)；数据以mean±sd表示(n＝3)；[0053]图17是探针pno对细胞存活率的影响；其中，(a)raw264.7细胞与pno(0,10,20,30,50,100μm)孵育24h细胞的存活率；(b)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育不同时间(0,6,12,18,24h)细胞的存活率；[0054]图18是紫外光照射对细胞存活率的影响，raw264.7细胞给予uv(365nm，20w)照射不同时间(0,1,2,4,6min)细胞的存活率；[0055]图19是探针pno检测外源性no的荧光成像；其中，(a-a2)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育30min，与dea·nonoate(100μm)孵育15min后的荧光图像；(b-b2)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育30min后，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；(c-c2)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育30min，再与dea·nonoate(50μm)孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；(d-d2)raw264.7细胞与pno(20μm)孵育30min，再与dea·nonoate(100μm)孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；[0056]图20代表图19中细胞的平均荧光强度，数据以mean±sd表示(n＝3)；*p《0.001vsa1和b1；[0057]图21是探针pno检测内源性no的荧光成像；其中，(a-a2)raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min后，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；(b-b2)raw264.7细胞与lps(终浓度20μg/ml)和l-arg(终浓度5mg/ml)预孵育12h，再与探针pno(20μm)孵育30min后的荧光图像；(c-c2)raw264.7细胞与lps(终浓度20μg/ml)和l-arg(终浓度5mg/ml)预孵育12h，再与探针pno(20μm)孵育30min后，uv(365nm，20w)照射140s的荧光图像；(d-d2)raw264.7细胞与n-硝基-l-精氨酸甲酯(l-name，nos抑制剂)(20μm)预孵育2h，然后与lps(终浓度20μg/ml)和l-arg(终浓度5mg/ml)孵育12h，再与探针pno(20μm)孵育30min，uv(365nm，20w)照射140s后的荧光图像；[0058]图22代表图21中细胞的平均荧光强度，数据以mean±sd表示(n＝3).*p《0.001vsa1和b1.#p《0.001vsc1。具体实施方式[0059]通过以下实施例并结合附图对本发明的荧光探针作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。[0060]一、实施方法[0061]1.溶液的配置[0062](1)探针pno溶液的配制：pno(6.78mg,0.01mmol)溶解于dmso(10ml)中得到1mm的探针溶液。探针溶液需要现配现用。[0063](2)no储备液的配制：2-(n,n-二乙基氨基)-二氮烯-2-氧钠盐水合物(dea·nonoate)溶解于0.01mmnaoh溶液中得到10mm的no储备液。将其稀释成1.0mm-100μm的溶液备用。no储备液需要现用现配。[0064](3)na2s储备液的配制(作为h2s的来源)：在氮气条件下，将na2s·9h2o(24mg，0.1mmol)溶于溶液中，配成10mmna2s储备液，根据实验需要将na2s储备液稀释到所需浓度。[0065](4)cys(l-半胱氨酸)储备液的配制：cys(12.1mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10ml)中得到10.0mm的储备液，将储备液稀释成1.0mm的溶液备用。[0066](5)hcy(同型半胱氨酸)储备液的配制：hcy(13.5mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10ml)中得到10.0mm的储备液，将储备液稀释成100μm的溶液备用。[0067](6)gsh(谷胱甘肽)储备液的配制:gsh(30.7mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10ml)中得到10.0mm储备液，将储备液稀释成1.0mm和10.0mm的溶液备用。[0068](7)其他生物分析物的储备溶液，包括ala,glu,trp,tyr,val,ser,pro,arg,gly,phe,his,lys等氨基酸；zn2 ,na ,k ,mg2 ,cu2 ,ca2 ,cl-,br-,i-,fe3 ,fe2 ,hpo42-,h2po4-,co32-,hco3-等无机盐离子；活性硫类化合物如gsh,gssg,ch3sssch3,hcy,s2o32-,so42-,so32-,hso3-,na2s,cys；活性氧类化合物如h2o2,ocl-,o2-,1o2,·oh,tbuooh；活性氮类化合物如no2-,no,no3-,onoo-,都在双蒸水中制备，配制成1.0mm的储存液，避光保存于4℃冰箱中。[0069](8)超氧阴离子自由基(o2-)根据文献报道的方法制备。·oh通过feii(edta)与等当量的h2o2之间的fenton反应产生。no从3-(氨基丙基)-1-3-羟基-3-异丙基-2‑ꢀ代-1-三氮烯(noc-5,50μmol/ml)产生。[0070]2.细胞[0071]种属和品系：小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7细胞株。来源：上海盖宁生物科技有限公司。[0072]二、实施例[0073]2.1荧光探针pno制备[0074]2.1.1化合物m-3的合成[0075][0076]荧光素(1g,3mmol)溶于乙酸酐(20ml)溶液中，加热进行回流反应，直到溶液中的荧光消失。反应完毕后，将反应混合物冷却至70℃-80℃后倒入200ml冰水中，边倒入边搅拌，静置过夜。收集沉淀，用水洗涤并干燥。然后用乙醇对粗品进行重结晶，得白色固体906mg，产率为72.6％。tlc(silica,pe:ea,2:1v/v)：rf＝0.5。[0077]2.1.2化合物m-4的合成[0078][0079]将化合物m-3(153mg,0.367mmol)溶于15ml乙酸乙酯中，加入10％钯/碳(15mg)，通入氢气，在室温下反应18h，抽滤，滤液减压浓缩得粗品。粗品通过柱层析(dcm:meoh，30:1v/v)纯化得白色固体130mg，产率为85％。tlc(silica,dcm:meoh,40:1v/v)：rf＝0.3。[0080]2.1.3化合物m-5的合成[0081][0082]将化合物m-4(418mg,1mmol)溶于socl2(3ml)中，在氮气保护下回流反应2h。反应完毕后，冷却到室温，减压除去socl2。将浓缩后的残留物溶解在无水ch3cn(20ml)中，加入到et3n(405mg,4mmol)和n-boc-1,2-苯二胺(140mg，0.67mmol)的混合溶液中。所得混合物在0℃下反应0.5h后，再室温反应3h。向上述反应液中加入水(100ml)淬灭反应，用乙酸乙酯萃取(3×30ml)。有机相用无水na2so4干燥，减压浓缩。[0083]将上述减压浓缩后所得产物溶于thf(20ml)中，用0.3mol/l氢氧化锂水溶液(20ml)处理。所得混合溶液在室温下反应4h，用1mol/l盐酸将混合物的ph调至1-2，然后用盐水洗涤，乙酸乙酯萃取(3×30ml)，有机相用无水na2so4干燥，减压浓缩。粗品通过柱层析(dcm:meoh,60:1v/v)纯化得橘黄色油状物105mg，产率为20％。tlc(silica,dcm:meoh,30:1v/v)：rf＝0.3。[0084]2.1.4化合物m-6的合成[0085][0086]将化合物m-5(524.5mg,1mmol)溶于无水thf(15ml)中，逐滴滴加1m硼烷四氢呋喃络合物溶液(5ml)，氮气保护下回流反应4h。冷却到室温后，向上述反应液中加入甲醇(30ml)淬灭反应，减压除去溶剂，得到粗中间体。[0087]将所得粗中间体溶解在20mlch2cl2中，加入四氯苯醌(245.8mg,1mmol)，混合物在室温下反应2h。然后将反应混合物减压浓缩。所得粗品经快速柱层析(dcm:meoh,10:1v/v)纯化得到橘黄色油状液体407mg，产率为70％。tlc(silica,dcm:meoh,30:1v/v)：rf＝0.5。[0088]2.1.5化合物m-7的合成[0089][0090]将1-(1-溴乙基)-2-硝基苯(131mg,0.57mmol)和化合物m-6(97mg,0.19mmol)溶于dmf(1ml)中，在氮气保护下反应15min，快速加入cs2co3(124mg,0.38mmol)，室温反应6h。反应完毕后，将反应液倒入饱和氯化铵水溶液(10ml)中，乙酸乙酯萃取(3×30ml)，用无水na2so4干燥，减压浓缩，粗品通过柱层析(pe:ea,4:1v/v)纯化得到黄色固体150mg，产率52％。tlc(silica,pe:ea,4:1v/v)：rf＝0.5。1hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.18(d,j＝8.0hz,2h),7.96(d,j＝7.6hz,1h),7.83(d,j＝7.6hz,2h),7.70(t,j＝7.2,8.0hz,2h),7.51-7.37(m,7h),7.12(d,j＝7.2hz,1h),7.02(t,j＝7.2,8.4hz,1h),6.91(d,j＝8.4hz,2h),6.78(dd,j＝8.4,2.4hz,2h),6.55-6.51(m,3h),6.11(d,j＝8.8hz,1h),5.48(d,j＝2.4hz,4h),4.42(s,2h),1.41(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)：δ158.45,153.30,152.34,146.94,144.52,140.92,138.18,134.14,133.54,131.88,129.82,128.53,128.49,128.30,128.04,127.76,127.28,125.16,124.98,122.18,121.03,116.88,116.56,111.97,101.71,79.46,70.25,67.02,57.64,28.39.具体如图2-4所示。[0091]2.1.6探针pno的合成[0092][0093]化合物m-7(555mg,0.71mmol)溶于ch2cl2(15ml)中，滴加浓盐酸2.5ml，溶液由黄色变为黄褐色，室温反应2h，然后用三乙胺调ph至8.0，所得混合物用ch2cl2萃取(3×30ml)，减压浓缩除去溶剂。将得到的粗品经快速柱层析(dcm:meoh,10:1v/v)纯化得淡黄色固体450mg，化合物pno的产率为80％。tlc(silica,pe:ea,2:1v/v)：rf＝0.5。1hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.17(dd,j＝8.0,0.8hz,2h),7.87(d,j＝7.6hz,2h),7.69(t,j＝8.0hz,2h),7.50(t,j＝8.4,7.2hz,2h),7.43-7.42(m,2h),7.38-7.34(m,1h),7.06(d,j＝7.6hz,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.85-6.81(m,1h),6.74(dd,j＝8.4,2.4hz,2h),6.58(d,j＝2.4hz,2h),6.49(dd,j＝8.0,1.2hz,1h),6.31-6.27(m,1h),6.06(dd,j＝8.0,1.2hz,1h),5.48(s,4h),4.48(s,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)：δ158.40,153.32,147.06,146.27,145.26,141.06,134.03,133.61,130.61,130.22,128.63,128.54,128.50,128.04,127.82,127.01,125.13,124.84,122.12,118.01,117.71,115.42,111.27,101.85,69.72,67.04,57.18.具体如图5-6所示。荧光探针pno的hrms图谱，calculatedforc40h31n4o7[m-h] 679.2187found679.2181。[0094]2.2探针pno识别no的原理[0095]pno(68mg，0.10mmol)溶于dmso(15ml)中，加入含有dea·nonoate(310mg，2.0mmol)的pbs缓冲液(30ml，20mm，ph＝7.4)，在37℃反应30min。二氯甲烷(3×10ml)萃取，减压浓缩，将产物进行提取分离，通过hrms确认反应产物，从而确认探针pno与no的反应原理。具体如图7所示。[0096]2.3光谱性能的测定[0097]2.3.1体外光解动力学实验[0098]记录探针pno在紫外光(uv365nm,20w)下连续照射不同时间后，与no反应的荧光光谱和紫外吸收光谱的变化，确定最佳的光解时间。[0099]2.3.2紫外光谱的测定[0100]uv光谱采用岛津uv-2600紫外-可见分光光度计测定。将探针pno、探针pno uv照射、探针pno no、探针pno no uv照射后的溶液进行全波长扫描，测定其吸收光谱。[0101]2.3.3荧光光谱的测定[0102]将探针pno用溶剂dmso溶解，加入到石英比色皿中。将探针pno用pbs缓冲液(20mm，ph＝7.4)进行稀释，加入不同浓度的dea·nonoate(dea·nonoate作为no的供体)孵育，测定其荧光强度。每组数据至少平行三次，结果以mean±sd表示。[0103]测试条件：荧光测量实验均在室温下用安捷伦caryeclipse荧光分光光度计测定。激发波长为495nm，激发狭缝宽度5nm，发射狭缝宽度5nm，扫描速度600nm/min，发射光谱范围在500-750nm。光电倍增管的电压设为600v。[0104]2.3.4检测限的测定[0105]最低检测限按文献报道方法计算。探针pno自身的荧光强度比值测定10次，计算10次测定的荧光强度比值的标准偏差，再将探针与no反应，得到no浓度与荧光强度的线性方程。检测限的计算公式为：3σ/k。k代表荧光强度与no浓度线性方程的斜率，σ代表空白样的标准偏差。[0106]2.4raw264.7细胞的复苏、培养、传代和冻存[0107]2.5细胞毒性的测定[0108]采用mtt法测定探针pno的细胞毒性。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。raw264.7细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，然后在5％co2培养箱进行培养。将细胞分别与不同浓度的pno(0,10,20,30,50,100μm)孵育24h。24h后，每个孔中加入20μlmtt染料(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物，5mg/ml，溶于pbs缓冲液中)，继续在37℃条件下孵育4h。随后除去剩余的mtt溶液，并向各孔中加150μl的dmso以溶解甲瓒结晶。摇床震荡10min后，用酶标仪测量570nm的吸光度。在相同处理条件下，以没有添加探针的作为对照孔，用调零孔(dmso mtt)校准吸光度值，各组细胞存活率计算公式为：细胞相对存活率＝(实验孔od值-调零孔od值)/(对照孔od值-调零孔od值)×100％。最终处理数据，绘制柱状图。每个样品重复三次，整个实验重复三次。[0109]2.6细胞水平荧光成像[0110]2.6.1外源性no的细胞成像[0111]为检测探针pno对细胞内no的特异性识别能力以及探针的生物相容性，本专利进行raw264.7细胞的激光共聚焦显微镜成像。倒置显微镜下观察细胞，生长状态良好且达到60％-80％融合时(处于对数生长期)，以2×104cells/ml的密度接种于共聚焦培养皿内，待细胞长至60％-80％密度且状态良好时，将raw264.7细胞与探针pno溶液(终浓度为20μm)孵育30min，再与no(终浓度100μm)孵育15min，uv照射140s成像。在成像前，用磷酸盐缓冲液(3×1ml)洗涤细胞三次，使用超高分辨激光扫描共聚焦显微镜(徕卡stellaris5)进行成像。[0112]2.6.2内源性no的细胞成像[0113]将raw264.7细胞与lps(终浓度20μg/ml)和l-arg(终浓度5mg/ml)孵育12h后，用磷酸盐缓冲液(3×1ml)缓和洗涤，再加入探针pno溶液(终浓度为20μm)孵育30min，然后用uv照射140s。抑制剂组：将raw264.7细胞与n-硝基-l-精氨酸甲酯(10μm，l-name，no合成酶抑制剂)预孵育2h，再与lps和l-arg孵育12h后，加入探针pno溶液(终浓度为20μm)孵育30min，然后用uv照射140s。在成像前，用磷酸盐缓冲液(3×1ml)洗涤细胞三次，使用超高分辨激光扫描共聚焦显微镜(徕卡stellaris5)进行成像。[0114]2.7数据处理[0115]数据以均数±标准差(mean±sd)表示，使用spss22.0软件进行统计分析。多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-wayanova)。p＜0.05表示差异有统计学意义。[0116]三、效果验证[0117]3探针pno的光学性能检测[0118]3.1荧光探针pno的光解动力学[0119]为了进一步考察探针pno对no的响应性能。首先，进行了探针pno的光解动力学实验。探针pno与no(100μm)孵育15min后，紫外光(365nm，20w)照射不同的时间。如图8所示，经过140s的紫外光照射，518nm处的荧光强度达到峰值，说明探针pno完全光解。因此，选择140s紫外光照射时间进一步考察pno对no的灵敏度和选择性。[0120]3.2荧光探针pno与no反应的荧光光谱与紫外光谱[0121]本专利中考察了探针pno在紫外光(365nm，20w，140s)照射前后的荧光光谱和吸收光谱。脱氧螺内酰胺处于闭环状态，探针pno是无荧光的；由于光激活保护基团邻硝基苄基的存在，探针被关在“笼子”中，与识别物no孵育，没有明显的紫外吸收，也不能引起探针的荧光开启，这使得探针的背景荧光较低；探针pno经紫外光照射后，几乎没有荧光产生；探针pno经紫外光照射后，邻硝基苄基离去，与识别物no反应，最大吸收峰为499nm，同时在518nm处荧光显著增强(图9)。结合荧光光谱及紫外吸收光谱，可以进一步验证图7所示的探针pno的识别机理。[0122]3.3荧光探针pno与no的反应时间[0123]探针pno(10μm)与no(100μm)孵育不同的时间后，紫外光(365nm，20w)照射140s，观察到荧光强度在15min左右达到峰值，说明15min左右pno与no(100μm)反应完全。反应时间延长至30min，荧光强度未见减弱，荧光强度较稳定(图10)。[0124]3.4荧光探针pno与no反应的线性关系以及检测限[0125]将探针pno与不同浓度的no(0-160μm)孵育，考察探针pno对生物样本中no进行定量检测的适用性。无论是否存在no，探针pno在未给予紫外光(365nm，20w，140s)照射之前，反应液无荧光；当探针pno给予紫外光照射之后，与不同浓度的no(0-160μm)孵育后，在518nm处的荧光强度随着no浓度的增加而逐渐增强，当no浓度达到100μm及以上时，荧光强度达到峰值，该峰值是探针pno只与no(0-160μm)孵育荧光强度的500倍。no在0-20μm范围内与荧光强度呈现出良好的线性关系，在pbs缓冲液中，探针pno检测no的检测限为13nm。当探针pno与no的反应比例为1:10时，荧光强度达到峰值，反应趋于饱和(图11)。上述结果显示探针pno具有较好的检测灵敏度，适合定量检测复杂生物体内no水平。[0126]3.5荧光探针pno与no反应ph的影响[0127]为了探究ph对探针pno检测no的影响，将探针与no在不同ph的pbs缓冲液中进行孵育。探针在ph6.5-9.0时荧光响应较高(图12)，但在ph4.0-6.0范围内荧光响应较低并且荧光强度随着酸性增加逐渐下降，原因是酸性条件下，荧光素衍生物的脱氧内酰胺环处于闭环状态，几乎没有荧光。上述结果表明，探针pno适用于生理条件下(ph7.4)no的定量检测。[0128]3.6荧光探针pno检测no的选择性[0129]由于生物体内环境的复杂性，探针需要有较高的选择性，来实现对no的精准检测。如图13-16所示，只有当no存在时，荧光强度才会大幅度增加。其他不含巯基的氨基酸(包括ala,glu,trp,tyr,val,ser,arg,gly,phe,his,lys)、无机盐离子(包括zn2 ,na ,k ,mg2 ,cu2 ,ca2 ,cl-,br-,i-,fe3 ,fe2 ,hpo42-,h2po4-,co32-,hco3-)、活性硫(包括gsh,gssg,ch3sssch3,hcy,s2o32-,so42-,so32-,hso3-,na2s,cys)、活性氧及活性氮(包括h2o2,ocl-,o2-,1o2,·oh,tbuooh,no2-,no,no3-,onoo-)、mgo/aa/dha仅引起了微弱的荧光变化。此外，竞争性实验结果表明，no与上述多种物质共同孵育也不影响探针pno与no的荧光响应。由上述结果可知，探针pno可以特异性识别no，不受其他活性物质的干扰。[0130]4细胞水平一氧化氮的荧光成像[0131]4.1荧光探针pno的mtt细胞毒性实验[0132]在进行探针pno检测细胞内no的荧光成像实验之前，需要进行细胞毒性实验，确定对细胞无影响的合适探针浓度。如图17a图所示，不同浓度的探针pno(0,10,20,30,50,100μm)与raw264.7细胞孵育24h后，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7的存活率较高，即使浓度为100μm时，细胞的存活率也超过90％。如图17b图所示，将20μmpno与raw264.7细胞孵育6,12,18,24h后，细胞存活率仍在90％以上。由此说明pno对raw264.7细胞存活率几乎没有影响，具有低毒性。[0133]另外，进行光毒性研究。如图18所示，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7给予不同时间的紫外光(365nm，20w)照射，结果表明，当紫外光照射6min时，细胞的存活率超过90％。由此说明紫外光对raw264.7细胞几乎没有影响。[0134]4.2外源性一氧化氮的细胞荧光成像[0135]探针pno在体外测试条件下具有良好的灵敏度与选择性，随后我们继续探究探针能否检测细胞中的no。先将raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min，然后与100μmdea·nonoate(no供体)孵育15min，uv(365nm，20w)照射140s，细胞内可见明亮的绿色荧光(图19c1，图20)。然而，raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min后，与100μmdea·nonoate(no供体)孵育15min，未经紫外光照射，细胞内几乎观察不到荧光(图19a1，图20)；raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min，uv(365nm，20w)照射140s，细胞内也没有明显的荧光增强(图19b1，图20)。综上所述，该探针可以用于活细胞中外源no的细胞成像。由图19可知，细胞在整个拍摄过程中形态良好。[0136]4.3内源性一氧化氮的细胞荧光成像[0137]本专利继续考察探针pno能否在活细胞中进行内源性no的荧光成像。由于no是巨噬细胞产生的炎症因子，lps和l-arg刺激raw264.7细胞产生内源性no，可达到纳摩尔到微摩尔水平。因此，本实验采用lps(20μg/ml)和l-arg(5mg/ml)与细胞孵育的方法来诱导内源性no的产生。raw264.7细胞与探针pno(20μm)孵育30min，uv(365nm，20w)照射140s后，细胞内未见荧光(图21a1，图22)；raw264.7细胞与lps和l-arg预孵育12h，与探针pno(20μm)孵育30min，没有uv照射时，细胞内几乎观察不到荧光(图21b1，图22)；raw264.7细胞与lps和l-arg预孵育12h，再与探针pno(20μm)孵育30min后，uv(365nm，20w)照射140s，细胞内显示出明亮的绿色荧光(图21c1，图22)；此外，将细胞用n-硝基-l-精氨酸甲酯(l-name，nos抑制剂)(20μm)预孵育2h，与lps和l-arg孵育12h，再与探针pno孵育30min，然后给予uv(365nm，20w)照射140s，可见细胞内的荧光显著减弱(图21d1，图22)，说明c1图中的荧光是由no引起的。上述结果说明探针pno可以进行细胞内源性no荧光成像。[0138]综上所述，本发明提供的基于荧光素的no光激活荧光探针pno，该探针在uv照射后，邻硝基苄基发生光解反应，光激活保护基团离去，然后探针与no反应，发生重排反应，释放出化合物puvno，产生荧光信号。探针在只有uv或者只有no存在条件下，是没有荧光信号响应的；当探针在uv与no共同存在的条件下，才能开启荧光信号。该探针检测限低(13nm)，信噪比高，荧光响应倍数高(约500倍)，灵敏度高，选择性好。荧光强度与no(0-20μm)浓度之间具有良好的线性关系，说明探针适合于生物体内一氧化氮的定量检测，并进一步应用pno实现了raw264.7细胞中外源性和内源性no的荧光成像。[0139]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12当前第1页12
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