一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶的制作方法

1.本发明涉及基因工程疫苗技术领域，更具体的说是涉及一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacterpylori,hp)是一种革兰氏阴性菌，它感染人后通常能引发患者慢性胃炎、消化性溃疡、胃淋巴增生性淋巴瘤、胃癌等消化系统疾病。幽门螺杆菌从过去的标准三联疗法到现在的四联疗法，幽门螺杆菌根除率却在不断下降。开发一种有效的幽门螺杆菌疫苗可以避免目前根除方法中存在的根除率下降问题。
3.在近30年的幽门螺杆菌疫苗研究中，开发幽门螺杆菌疫苗的进展非常缓慢，但临床前研究、临床研究和一项在中国范围内的3期临床研究已证明在预防和治疗策略方面取得了成功。这为继续开发一种安全有效的幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。
4.幽门螺杆菌在定植过程中，其中重要的一环是黏附。目前已有许多幽门螺杆菌黏附因子已经报道。幽门螺杆菌跨过胃黏液层，与宿主上皮细胞黏附，其中可能涉及唾液酸酶。
5.唾液酸酶(sialidase)又称神经氨酸酶，它是分布于细菌表面的膜蛋白。唾液酸酶可裂解宿主细胞表面的寡糖，暴露出下方的隐性受体，增强对组织的黏附，唾液酸酶具有的此功能已在肺炎链球菌中被广泛研究，同时将其作为肺炎链球菌疫苗成分已被报道。
6.幽门螺杆菌有1400多个orf，通过对幽门螺杆菌每个蛋白进行分析，并与ncbi数据库中其它细菌已解析的蛋白功能进行对比，发现幽门螺杆菌被膜上也存在上述蛋白。
7.因此，将唾液酸酶作为幽门螺杆菌候选疫苗抗原来开发、研制新的幽门螺杆菌疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明提供了一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶。
9.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶，唾液酸酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.本发明提供了编码权利要求1所述的唾液酸酶的基因，基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.本发明提供了一种包含上述基因的重组表达载体。
13.优选的：重组载体还包括his标签序列、编码促溶蛋白的基因；编码促溶蛋白的基因包括gst和mbp。
14.本发明还提供了：一种上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：
15.1)采用f234/r234引物对扩增幽门螺杆菌基因组dna，得到编码唾液酸酶的基因片段；f234的核苷酸序列如seq id no.3所示；
16.r234的核苷酸序列如seq id no.4所示；
17.2)将编码唾液酸酶的基因片段插入骨架载体中得到重组表达载体；骨架载体的多克隆位点为bamhi/ecor i。
18.优选的：骨架载体为含his标签序列和编码促溶蛋白的基因的骨架载体；含his标签序列和编码促溶蛋白的基因的骨架载体的构建方法，包括以下步骤：
19.f29b-1/r502引物对对pmal-c2x模板进行pcr扩增，得到mbp基因片段；用f502/r29b-07引物对对pgex-6p-1模板进行pcr扩增，得到gst基因片段；
20.f29b-1的核苷酸序列如seq id no.5所示；
21.r502的核苷酸序列如seq id no.6所示；
22.f502的核苷酸序列如seq id no.7所示；
23.r29b-07的核苷酸序列如seq id no.8所示；
24.以mbp基因片段和gst基因片段为模板，用f29b-2/r29b-07引物对进行pcr扩增，得到his(tag)-mbp-gst片段；
25.f29b-2的核苷酸序列如seq id no.9所示；
26.将his(tag)-mbp-gst片段插入pet29b质粒中，得到含his标签序列和两种编码促溶蛋白的基因的重组表达载体。
27.优选的：pet29b质粒的插入多克隆位点为nedi/bamhi。
28.本发明还提供了一种包含上述基因或上述重组载体的重组菌株。
29.本发明还提供了一种由上述重组菌株重组表达得到的唾液酸酶或上述唾液酸酶在制备检测、预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物或生物制品中的应用。
30.优选的：生物制品包括疫苗。
31.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶，取得的技术效果为本发明采用基因工程技术克隆表达幽门螺杆菌唾液酸酶重组蛋白，上清表达量高，分离纯化步骤简便，免疫效价高且有保护性。唾液酸酶重组蛋白可以直接与黏膜佐剂lt(b)5配合使用，适用于口服免疫接种。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
33.图1附图为本发明提供的pet29b-6质粒构建示意图。
34.图2附图为本发明提供的his(tag)-mbp-gst基因片段质粒鉴定pcr结果；m：dna分子量标准；1；his(tag)-mbp-gst基因片段(1803bp)pcr产物。
35.图3附图为本发明提供的sialidase基因片段高保真pcr扩增结果；m：dna分子量标准；1；sialidase基因片段(429bp)pcr产物。
36.图4附图为本发明提供的重组pet29b-sialidase/bl21(de)3普通pcr鉴定结果；m：dna分子量标准；1；sialidase基因片段(429bp)pcr产物。
37.图5附图为本发明提供的sialidase/bl21(de)3工程菌破菌上清经初次纯化亲和
层析图。第一个峰为破菌上清上样峰，第二、三、四个峰为a2缓冲液洗涤杂蛋白峰，第五个峰为a3缓冲液洗涤杂蛋白峰，第六个峰为a4缓冲液洗脱得目的蛋白峰。
38.图6附图为本发明提供的sialidase/bl21(de)3重组工程菌诱导表达、破菌后上清纯化结果，其中，泳道1为蛋白质分子质量标准(thermo fisher，26616)；泳道2为sialidase/bl21(de)3重组工程菌破菌全菌；泳道3为sialidase/bl21(de)3重组工程菌破菌上清；泳道4为sialidase/bl21(de)3重组工程菌沉淀；泳道5为sialidase/bl21(de)3重组工程菌上清纯化第一次流穿；泳道6为sialidase/bl21(de)3重组工程菌上清纯化第二次流穿；泳道7为含促溶标签的sialidase重组蛋白；泳道8为pp酶酶切含促溶标签的sialidase重组蛋白；泳道9为sialidase重组蛋白。
39.图7附图为本发明提供的sialidase重组蛋白免疫balb/c小鼠，唾液iga(1:4)、血清igg(1:800)检测阳转率。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.本发明实施例公开了一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶，为幽门螺杆菌外膜蛋白，跨膜区为152aa-169aa。
42.实施例中的重组表达载体，包含编码sialidase(唾液酸酶)重组蛋白的核苷酸序列、his(tag)序列、促溶蛋白序列和质粒序列，质粒优选pet29b，his(tag)序列为7个组氨酸(his)，促溶蛋白序列分为gst和mbp(麦芽糖结合蛋白)。
43.实施例1
44.pet29b-6双标签促溶载体构建
45.his(tag)、mbp、gst(谷胱甘肽转移酶)基因克隆及连接
46.his(tag)的蛋白氨基酸序列选自(his his his his his his his)seq id no.10，核苷酸序列(catcatcatcatcatcatcat)如seq id no.11。
47.mbp基因来源于pmal-c2x质粒(长沙优宝生物科技有限公司)，mbp的蛋白氨基酸序列选自(lysileglugluglylysleuvaliletrpileasnglyasplysglytyrasnglyleualagluvalglylyslyspheglulysaspthrglyilelysvalthrvalgluhisproasplysleugluglulyspheproglnvalalaalathrglyaspglyproaspileilephetrpalahisaspargpheglyglytyralaglnserglyleuleualagluilethrproasplysalapheglnasplysleutyrprophethrtrpaspalavalargtyrasnglylysleuilealatyrproilealavalglualaleuserleuiletyrasnlysaspleuleuproasnproprolysthrtrpglugluileproalaleuasplysgluleulysalalysglylysseralaleumetpheasnleuglngluprotyrphethrtrpproleuilealaalaaspglyglytyralaphelystyrgluasnglylystyraspilelysaspvalglyvalaspasnalaglyalalysalaglyleuthrpheleuvalaspleuilelysasnlyshismetasnalaaspthrasptyrserilealaglualaalapheasnlysglygluthralametthrileasnglyprotrpalatrpserasnileaspthrserlysvalasntyrglyvalthrvalleuprothrphelysglyglnproserlysprophevalglyvalleuseralaglyileasnalaalaserproasnlysgluleualal
ysglupheleugluasntyrleuleuthraspgluglyleuglualavalasnlysasplysproleuglyalavalalaleulyssertyrgluglugluleualalysaspproargilealaalathrmetgluasnalaglnlysglygluilemetproasnileproglnmetseralaphetrptyralavalargthralavalileasnalaalaserglyargglnthrvalaspglualaleulysaspalaglnthr)seq id no.12，核苷酸序列(aaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggtctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcatccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacattatcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctgaaatcaccccggacaaagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttacaacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcgctgatttataacaaagatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggataaagaactgaaagcgaaaggtaagagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttcacctggccgctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggcaagtacgacattaaagacgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttcctggttgacctgattaaaaacaaacacatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaagctgcctttaataaaggcgaaacagcgatgaccatcaacggcccgtgggcatggtccaacatcgacaccagcaaagtgaattatggtgtaacggtactgccgaccttcaagggtcaaccatccaaaccgttcgttggcgtgctgagcgcaggtattaacgccgccagtccgaacaaagagctggcaaaagagttcctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaataaagacaaaccgctgggtgccgtagcgctgaagtcttacgaggaagagttggcgaaagatccacgtattgccgccactatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagact)如seq id no.13。
48.gst基因来源于pgex-6p-1质粒(长沙优宝生物科技有限公司)，gst的蛋白氨基酸序列选自(serproileleuglytyrtrplysilelysglyleuvalglnprothrargleuleuleuglutyrleugluglulystyrglugluhisleutyrgluargaspgluglyasplystrpargasnlyslysphegluleuglyleuglupheproasnleuprotyrtyrileaspglyaspvallysleuthrglnsermetalaileileargtyrilealaasplyshisasnmetleuglyglycysprolysgluargalagluilesermetleugluglyalavalleuaspileargtyrglyvalserargilealatyrserlysaspphegluthrleulysvalasppheleuserlysleuproglumetleulysmetphegluaspargleucyshislysthrtyrleuasnglyasphisvalthrhisproaspphemetleutyraspalaleuaspvalvalleutyrmetaspprometcysleuaspalapheprolysleuvalcysphelyslysargileglualaileproglnileasplystyrleulysserserlystyrilealatrpproleuglnglytrpglnalathrpheglyglyglyasphisproprolysseraspleugluvalleupheglnglyproleu)seq id no.14，核苷酸序列(tcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggaagttctgttccaggggcccctg)如seq id no.15。
49.根据引物设计原则，设计相应引物，并加入酶切位点。引物序列如下表1：
50.表1
[0051][0052]
his(tag)、mbp、gst基因连接
[0053]
采用高保真pcr方法扩增基因序列，高保真pcr酶(kod-plus-neo)来源于东洋纺上海生物科技有限公司。
[0054]
高保真pcr体系为：模板dna1μl，10
×
pcr buffer 5μl，dntps 5μl，硫酸镁3μl，上、下游引物各1μl，高保真酶1μl，加无菌水至总体积50μl。
[0055]
高保真pcr程序：反应体系配制好后将其振荡混匀，后放入pcr扩增仪。94℃预变性2min，98℃变性10秒，62℃退火30s，68℃延伸(延伸时间根据目的基因片段大小而定)，35个循环。
[0056]
高保真pcr后将其产物进行琼脂糖凝胶电泳回收，凝胶回收采用琼脂糖胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。其操作程序如下：
[0057]
(1)用1
×
tae配制1.5％的琼脂糖凝胶；
[0058]
(2)将pcr扩增样品按照10:1的比例加入10
×
loading buffer，用移液枪吹打混匀。
[0059]
(3)将样品全部加入凝胶孔中，打开开关，设定电泳条件参数220v、30min开始电泳；
[0060]
(4)将电泳后的凝胶用凝胶扫描系统进行扫描，对比有无目的dna且条带大小与相应理论值是否相符。
[0061]
(5)在紫外线分析仪中将琼脂糖凝胶上的目的条带切下，移入1.5ml ep管中。
[0062]
(6)进行吸附柱平衡处理：向吸附柱中加入200μl buffer cbs，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。
[0063]
(7)将切下含有目的片段的凝胶，估计重量或精确称量重量。每100mg1.5％琼脂糖凝胶加入150μl binding solution，于50～60℃水浴5～10min，期间每2～3min间断轻微颠倒混匀，直至胶块完全融化。
[0064]
(8)将上述混合液转移至套有2ml收集管的吸附柱中，室温放置2min，6000rpm室温离心1min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液。
[0065]
(9)将吸附柱重新放回收集管中，加入500μl wa solution，于12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液。
[0066]
(10)将吸附柱重新放回收集管中，加入500μl wash solution，于12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液。重复一次。
[0067]
(11)将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm室温离心1min，打开吸附柱的盖子，室温放置5～10min或50℃放置3～5min，以彻底去除wash solution。
[0068]
(12)将吸附柱放入干净的1.5ml收集管中，对膜中央悬空加入30～50μlelutionbuffer，盖好盖子，37℃放置2min，12000rpm离心1min,离心管中的液体即为包含目的dna片段的溶液。写上标签后-20℃保存，备用。
[0069]
以pmal-c2x质粒为模板，f29b-1、r502为引物进行高保真pcr，产物命名为mbp-1。
[0070]
以pgex-6p-1质粒为模板，f502、r29b-07为引物进行高保真pcr，产物命名为gst-1。
[0071]
以mbp-1、gst-1为模板，f29b-2，r29b-07为引物进行高保真pcr，产物命名为his(tag)-mbp-gst，his(tag)-mbp-gst基因大小为1803bp。
[0072]
his(tag)-mbp-gst基因与pet29b质粒连接
[0073]
将his(tag)-mbp-gst基因、pet29b分别进行双酶切，酶切位点为nedi/bamhi。nedi/bamhi来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。酶切操作程序如下：
[0074]
(1)pcr产物10μl，10
×
kbuffer4μl，nde i、bamhi酶各2μl，无菌水22μl。
[0075]
(2)pet29b质粒10μl，10
×
kbuffer4μl，nde i、bamhi酶各2μl，无菌水22μl。
[0076]
(3)酶切体系配制好后进行振荡混匀，后放入干式恒温器中，温度设定为30℃，恒温反应3h。
[0077]
(4)将双酶切的产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在成像系统下观察结果。其操作同上。
[0078]
切胶回收需要的片段，后进行琼脂糖凝胶回收，琼脂糖凝胶回收操作同上。
[0079]
用连接酶将双酶切好的his(tag)-mbp-gst基因和pet29b质粒进行连接，连接后的产物命名为pet29b-6，连接酶(ligation high)来源于东洋纺上海生物科技有限公司。连接反应程序及操作如下：
[0080]
(1)目的dna 3μl；载体3μl；连接酶3μl。振荡混匀后，放入pcr扩增仪中，16℃连接3小时。
[0081]
(2)pet29b-6质粒构建如图1。
[0082]
实施例2
[0083]
pet29b-6质粒转化dh5a
[0084]
大肠杆菌dh5a感受态细胞制备：
[0085]
(1)在超净工作台中用移液枪挑取-80℃冷冻保存的大肠杆菌dh5a菌株于3ml lb液体培养基中过夜培养。lb液体培养基组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，溶剂为水。
[0086]
(2)吸取400μl过夜培养的菌液于100ml lb液体中，细菌培养至od
600
值为0.4左右。
[0087]
(3)将菌液置于冰上，平均倒于两个灭菌过的50ml离心桶中，后进行离心，离心参数为：温度8℃，离心力10000g离心10min。
[0088]
(4)离心结束后倒掉上清，向离心桶中加入30ml 0.1m氯化钙，吹打混匀，在冰上静置30min后离心，离心参数为：温度8℃，离心力10000g离心10min。
[0089]
(5)离心结束后倒掉上清。再重复上述步骤一次。
[0090]
(6)将离心桶置于冰上，向离心桶中分别加入2.5ml 30％甘油和0.1m氯化钙并吹
打混匀。
[0091]
(7)将混匀的感受态细胞分别以100μl分至1.5ml ep管中。写上标签后放入-80℃冰箱进行保存。
[0092]
将连接后的产物转入大肠杆菌dh5a感受态细胞，大肠杆菌dh5a感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。转化体系及程序如下：
[0093]
(1)将dh5a感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上融化。
[0094]
(2)将连接产物全部加入融化的dh5a感受态细胞中，冰上静置感受态细胞30min。
[0095]
(3)42℃热激45s，冰上静置2min。
[0096]
(4)将转化产物加入500μl lb液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物1。lb液体培养基组成同上。
[0097]
(5)取100μl培养物1涂布于lb琼脂平板上，37℃过夜培养。lb琼脂平板组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，琼脂粉1.750％，卡那霉素0.001.5％，溶剂为水。
[0098]
在过夜培养lb琼脂平板上挑取菌落进行普通pcr鉴定，引物为f29b-2，r29b-07，takara ex taq来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。
[0099]
普通pcr鉴定程序如下：
[0100]
(1)菌悬液1μl为模板；无菌水13.3μl；上、下游引物各1μl；buffer2μl；dntp 1.6μl；taq酶0.1μl。
[0101]
(2)将反应体系振荡混匀后，放入pcr扩增仪。95℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸120s，35个循环，72℃完全延伸2min。
[0102]
取菌落pcr扩增液10μl与10
×
loadingbuffer 1μl进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220v、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。
[0103]
将菌落pcr鉴定阳性菌接种于lb-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物2。lb-1培养基组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，卡那霉素0.001.5％，溶剂为水。
[0104]
将培养物2进行保种，保种参数为培养物2：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。
[0105]
pet29b-6质粒(含his(tag)-mbp-gst基因)鉴定
[0106]
取培养物2进行质粒抽提，重组质粒dna抽提试剂盒来源于上海捷瑞生物工程有限公司。质粒抽提程序如下：
[0107]
(1)dna吸附柱平衡处理：向plasmid recovery column中加入200μlbuffer cbs，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将plasmid recovery column重新放回到收集管中备用。
[0108]
(2)取2～4ml lb培养基过夜培养的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清。
[0109]
(3)加入250μlsolution i，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
[0110]
(4)加入250μl solution ii，立即温和并充分地上下翻转混合6～8次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液。
[0111]
(5)加入350μl solutionⅲ，温和并充分地上下翻转混合8～10次，室温放置2～5min。12000rpm离心10min。
i。引物序列如下表2：
[0131]
表2
[0132]
f234cgggatccgagcgagaaaatgctatt，如seq id no.3r234ggaattctcattgctggagttcttt，如seq id no.4
[0133]
采用高保真pcr方法扩增基因序列，sialidase基因大小为429bp，高保真pcr酶、高保真体系及程序同上。
[0134]
将高保真产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220v、35min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图3。
[0135]
当高保真pcr片段与原始序列片段大小相符时，则进行琼脂糖凝胶回收，凝胶回收操作同上。
[0136]
sialidase基因与pet29b-6质粒连接
[0137]
将sialidase基因、pet29b-6分别进行双酶切，酶切位点为bamhi、ecor i。酶切体系及程序同上，酶的来源同上。
[0138]
将双酶切的产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在成像系统下观察结果。
[0139]
切胶回收需要的片段，琼脂糖凝胶回收操作同上。
[0140]
用连接酶将双酶切好的sialidase基因和pet29b-6质粒进行连接，连接酶来源、酶切体系及程序同上。
[0141]
pet29b-6-sialidase转化dh5a
[0142]
将连接后的产物转入大肠杆菌dh5a感受态细胞，大肠杆菌dh5a感受态细胞来源、转化体系及程序同上。
[0143]
将转化产物加入500μl lb液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物3。lb培养基组成同上。
[0144]
取100μl培养物3涂布于lb琼脂平板上，37℃过夜培养。lb琼脂平板组成同上。
[0145]
在过夜培养lb琼脂平板上挑取菌落进行普通pcr鉴定，takara ex taq来源、普通pcr鉴定体系及程序同上。
[0146]
取菌落pcr扩增液10μl与10
×
loadingbuffer 1μl进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220v、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。
[0147]
将菌落pcr鉴定阳性菌接种于lb-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物4。lb-1培养基组成同上。
[0148]
将培养物4进行保种，保种参数为培养物4：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。
[0149]
取过夜培养物4进行抽提质粒，此质粒命名为pet29b-6-sialidase。重组质粒dna抽提试剂盒、质粒抽提程序同上。
[0150]
将抽提质粒进行普通pcr鉴定，引物为f234、r234，鉴定体系及程序同上。
[0151]
取质粒鉴定普通pcr扩增液10μl与10
×
loading buffer 1μl进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220v、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。
[0152]
将经普通pcr鉴定符合质粒进行-20℃保存备用。
[0153]
pet29b-6-sialidase转化bl21(de)3
[0154]
将pet29b-6-sialidase质粒转入大肠杆菌bl21(de)3感受态细胞，大肠杆菌bl21(de)3感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司，转化体系及程序参照说明书。
[0155]
将转化产物加入500μl lb液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物5。lb培养基组成同上。
[0156]
取100μl培养物5涂布于lb琼脂平板上，37℃过夜培养。lb琼脂平板组成同上。
[0157]
在过夜培养lb琼脂平板上挑取菌落进行普通pcr鉴定，takara ex taq来源、普通pcr鉴定体系及程序同上。
[0158]
取菌落pcr扩增液10μl与10
×
loadingbuffer 1μl进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220v、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图4。
[0159]
将菌落pcr鉴定阳性菌接种于lb-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物6。lb-1培养基组成同上。
[0160]
将培养物6进行保种，保种参数为过夜培养物：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。
[0161]
sialidase大肠杆菌发酵
[0162]
pet29b-6-sialidase大肠杆菌接种培养
[0163]
将构建好的pet29b-6-sialidase大肠杆菌工程菌从-80℃超低温冰箱中取出，将工程菌接种于lb-1培养基中，37℃、220rpm恒温培养过夜。lb-1培养基组成同上。
[0164]
pet29b-6-sialidase大肠杆菌扩大培养
[0165]
取出过夜培养的工程菌，以1.5％接种比例接种于tb培养基，共接种4l，37℃、220rpm恒温培养3h。tb培养基组成为：磷酸二氢钾0.2312％，磷酸氢二钾1.2540％，酵母提取物2.4000％，胰蛋白胨1.2000％，甘油0.4000％，消泡剂0.0500％，溶剂为水。
[0166]
pet29b-6-sialidase大肠杆菌诱导表达
[0167]
扩大培养结束时，设置诱导温度为15℃，加入0.08mm iptg进行诱导表达，诱导时间为20h。
[0168]
pet29b-6-sialidase大肠杆菌菌体收集
[0169]
诱导结束时，采用离心机离心收集菌体，离心参数为：10000g，8℃，10min，离心结束后将菌体放置在-80℃保存备用。湿菌产率为11.77g/l。
[0170]
sialidase重组蛋白纯化
[0171]
破菌
[0172]
取发酵所得菌体10～100g，按质量(g)：体积(ml)比1:15加入缓冲液a1，在4℃条件下使用剪切机对含菌体的缓冲液进行剪切悬浮。缓冲液a1组成为氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，ph8.0，溶剂为水。
[0173]
使用ro水冲洗高压均质机(ah-1500，ats工业系统有限公司)管道。打开低温制冷系统进行预冷，备用。将预冷的悬浮菌液加入高压均质机，在480～520bar条件下破菌7～8次，后取全菌样品。
[0174]
将破菌后的液体装入离心桶，10，000g离心30min，离心温度为8℃，收集上清，此为上清液1。
[0175]
将上清液1使用真空抽滤泵进行过滤，收集过滤后的上清备用，此为上清液2，后取上清样品。
[0176]
将沉淀用缓冲液a1进行悬浮，悬浮后取此样品，命名为沉淀。
[0177]
含双标签促溶sialidase重组蛋白ni填料亲和层析纯化
[0178]
亲和层析条件：
[0179]
(1)仪器系统：apps200d纯化系统(利穗科技(苏州)有限公司)
[0180]
(2)填料：ni-nta
[0181]
(3)纯化柱规格：50mm
×
200mm
[0182]
(4)装柱体积：100ml
[0183]
用缓冲液a1进行平衡填料至电导、紫外平衡。
[0184]
在4℃低温条件下上样上清液2，上样流速为10ml/min，上样1个柱体积后，取流穿，此为流穿1。
[0185]
第一次洗涤：
[0186]
(1)上样结束后，取流穿，此为流穿2。
[0187]
(2)用缓冲液a1进行洗涤，洗涤体积为1～2个柱体积，流速为15ml/min。
[0188]
第二次洗涤：缓冲液a1洗涤后，用缓冲液a2进行洗涤，洗涤至紫外值小于100mau，流速为15ml/min。缓冲液a2组成为：氯化钠2.92％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，咪唑0.136％，ph8.0，溶剂为水。
[0189]
第三次洗涤：缓冲液a2洗涤后，用缓冲液a3进行洗涤，洗涤至紫外值小于70mau，流速为15ml/min。缓冲液a3组成为：氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，咪唑0.340％，ph8.0，溶剂为水。
[0190]
洗脱：缓冲液a3洗涤后，用缓冲液a4进行洗脱，流速为15ml/min。当紫外值大于250mau时开始收集样品，当紫外值小于250mau时停止收集样品。缓冲液a4组成为：氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，咪唑1.700％，ph8.0，溶剂为水。此样品为含双标签促溶sialidase重组蛋白，取此样品进行后续sds-page鉴定，命名为样品1。
[0191]
含双标签促溶sialidase重组蛋白ni填料亲和层析纯化如图5。
[0192]
含双标签促溶sialidase重组蛋白酶切
[0193]
用缓冲液a1对含双标签促溶sialidase重组蛋白进行稀释5倍。
[0194]
用10kd超滤管对稀释后含双标签促溶sialidase重组蛋白进行离心超滤浓缩，离心条件为4000g，15min。
[0195]
从-80℃超低温冰箱中取出pp酶，在4℃条件下解冻备用。
[0196]
将10～30mlpp酶加入上述浓缩后含双标签促溶sialidase重组蛋白中，4℃酶切过夜。
[0197]
取过夜酶切后样品进行后续sds-page鉴定，此为样品2。
[0198]
sialidase重组蛋白ni填料亲和层析纯化
[0199]
用缓冲液a1平衡填料至电导、紫外平衡。此步骤所用仪器、填料、纯化柱同上。
[0200]
在4℃低温条件下上样过夜酶切的含双标签促溶sialidase重组蛋白溶液，上样流速为10ml/min。
[0201]
当紫外值大于10mau时开始收集样品。
[0202]
上样结束后，继续上样缓冲液a1，上样流速为10ml/min。
[0203]
当紫外值小于10mau时停止收集样品。
[0204]
sialidase重组蛋白浓缩
[0205]
用10kd超滤管对sialidase重组蛋白样品进行离心超滤浓缩，离心条件为4000g，15min。
[0206]
将sialidase重组蛋白浓缩至5～15ml后放入-80℃超低温冰箱保存备用。
[0207]
取浓缩后sialidase重组蛋白样品进行后续sds-page鉴定，此为样品3。
[0208]
sialidase重组蛋白sds-page鉴定
[0209]
配制15％sds-page。
[0210]
取全菌、上清、沉淀、流穿1、流穿2、样品1、样品2、样品3各40μl，分别加入10μl 5x sds-page loading buffer，沸水浴5min。
[0211]
取上述沸水浴后样品，以10μl每孔加入sds-page，protein marker加样量为3μl。
[0212]
加样结束后，先调节电压为80v，电泳15min；再调节电压为220v，电泳40min左右。
[0213]
电泳结束后采用考马斯亮蓝法进行染色和脱色。
[0214]
脱色结束后在成像系统下观察结果，结果如图6。
[0215]
sialidase重组蛋白含量测定
[0216]
采用福林酚法进行蛋白含量测定。
[0217]
根据sialidase重组蛋白sds-page电泳图预估检测样品浓度。
[0218]
sialidase重组蛋白测得浓度为6.01mg/ml，标准曲线的相关系数r2＝0.9907，质控回收率为95％。
[0219]
实施例4
[0220]
sialidase疫苗口服免疫动物
[0221]
口服灌胃免疫动物
[0222]
1、实验动物：6周龄雌性balb/c小鼠，90只，18g
±
2g。小鼠自购买后采用随机分组法对鼠进行分组，10只/笼。免疫组30只，感染组30只，空白对照组30只。过渡饲养1天进行免疫实验。
[0223]
2、sialidase疫苗组成：sialidase抗原1mg/ml，lt(b)5为1mg/ml，溶剂为：氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，甘油5ml/100ml，溶液ph为8.0。
[0224]
3、感染组(lt(b)5佐剂对照组)免疫组成：lt(b)5为1mg/ml，溶剂为：氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，甘油5ml/100ml，溶液ph为8.0。
[0225]
4、口服灌胃免疫程序：共免疫3次，免疫时间点为0天、7天、28天。
[0226]
5、免疫前需提前24h断食断水。
[0227]
6、口服灌胃免疫：
[0228]
(1)免疫前将幽门螺杆菌疫苗从-80℃取出放置在4℃冰箱解冻备用。
[0229]
(2)用无菌注射器吸取sialidase疫苗，免疫剂量为sialidase抗原1mg/只，lt(b)5为1mg/只。
[0230]
(3)每次免疫分3次给小鼠灌胃1ml疫苗，每次口服灌胃间隔时间为20min。
[0231]
(4)免疫结束后2h恢复食水。
[0232]
(5)每次免疫操作均相同。
[0233]
(二)末次免疫后口服灌胃感染幽门螺杆菌
[0234]
末次免疫后第10天进行口服灌胃幽门螺杆菌ss1活菌进行攻毒实验，每只小鼠感
染剂量为4
×
106cfu。
[0235]
末次免疫结束后唾液和血样本采集
[0236]
1、小鼠唾液样本采集
[0237]
末次免疫结束后第10天、第38天对小鼠进行采集唾液。
[0238]
唾液采集前小鼠需断食断水24h。
[0239]
采集小鼠唾液前，需给小鼠腹腔注射5mg/ml毛果芸香碱20ul，采集唾液放置在-80℃保存备用。
[0240]
2、小鼠血样本采集
[0241]
末次免疫结束后第10天对小鼠进行采集尾静脉血，第32天采集小鼠眼眶静脉血。
[0242]
3、唾液采集前小鼠需断食断水24h。
[0243]
4、将采集的血室温静置4h，采用3000g离心2min，吸上清，后再重复上述操作一次，将分离的血清放置在-80℃保存备用。
[0244]
唾液iga和血清igg样本elisa间接法检测
[0245]
1、elisa检测准备
[0246]
封闭液组成如下：0.01m pbs，1.5％bsa，溶剂为水。
[0247]
pbst洗涤液组成如下：0.01m pbs，0.05ml/100mltween-20，溶剂为水。
[0248]
抗体稀释液组成如下：0.01m pbs，0.05ml/100mltween-20，0.5％bsa，溶剂为水。
[0249]
底物缓冲液组成如下：磷酸氢二钠1.4％，一水合柠檬酸1.5％，溶剂为水。
[0250]
2m硫酸组成如下：浓硫酸11.22ml/100ml，溶剂为水。
[0251]
1mg/mltmb组成如下：tmb 0.15％，溶剂为dmso。
[0252]
显色液组成如下：1mg/mltmb：底物缓冲液：30％双氧水配制体积比例为100:900:1。
[0253]
sialidase抗原包被酶标板：用2ug/ml免疫抗原包被酶标板，包被条件为37℃下孵育2h，后用pbst洗涤液洗板三次。300μl/孔将封闭液加入上述酶标板，放入4℃冰箱中，封闭过夜。再用pbst洗涤液洗上述酶标板三次，将此酶标板命名为酶标板1并放入4℃冰箱保存备用。
[0254]
2、血清igg样本elisa检测
[0255]
将血清样本用抗体稀释液以1:800进行稀释，100μl/孔加入酶标板1中，37℃、孵育45min，pbst洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板2。
[0256]
将羊抗鼠igg二抗用抗体稀释液1:10000进行稀释，100μl/孔加入酶标板2，37℃、孵育45min，pbst洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板3。
[0257]
将显色液按100μl/孔加入酶标板3中，37℃、孵育15min，后按50μl/孔加入2m h2so4终止液，此酶标板命名为酶标板4。
[0258]
将酶标板4放入酶标分析仪中，选择od
450
进行检测，将检测数据保存并进行后续分析。
[0259]
3、唾液iga样本elisa检测
[0260]
将唾液样本用抗体稀释液以1:4进行稀释，100μl/孔加入酶标板1中，37℃、孵育45min，pbst洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板5。
[0261]
将羊抗鼠iga二抗用抗体稀释液1:5000进行稀释，100μl/孔加入酶标板5，37℃、孵
育45min，pbst洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板6。
[0262]
将显色液按100μl/孔加入酶标板6中，37℃、孵育15min，后按50μl/孔加入2m h2so4终止液，此酶标板命名为酶标板7。
[0263]
将酶标板7放入酶标分析仪中，选择od
450
进行检测，将检测数据保存并进行后续分析。
[0264]
4、唾液iga和血清igg效价检测结果
[0265]
检测结果判定：将样本(免疫组)/阴性(感染组)值≥2.1定义为阳性。将免疫组效价检测阳性小鼠/免疫组小鼠
×
100％定义为阳转率。
[0266]
(1)唾液iga效价检测结果：小鼠免疫组保护率判定终点时唾液iga(1:4)效价检测阳转率为40％，如图7所示。
[0267]
(2)血清igg效价检测结果：小鼠免疫组保护率判定终点时血清igg(1:800)效价检测阳转率为70％，如图7所示。
[0268]
(3)通过唾液iga和血清igg效价检测结果说明本发明的sialidase疫苗具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，为sialidase疫苗用于清除胃内幽门螺杆菌定植提供了支撑。
[0269]
sialidase疫苗保护结果
[0270]
1、末次免疫结束后第38天通过平板培养法检测各组小鼠幽门螺杆菌感染定植率，以此计算sialidase疫苗保护率。保护率＝(免疫组只数
×
感染组感染率—免疫组感染只数)/(免疫组只数
×
感染组感染率)
×
100/100。
[0271]
2、幽门螺杆菌平板培养参考本领域中常规的条件、配方及操作方法。
[0272]
3、幽门螺杆菌平板培养判定标准：
[0273]
(1)菌落形态鉴定标准：将平板上生长出直径为0.1mm～0.5mm、呈透明针尖样大小的特征性菌落判定为幽门螺杆菌阳性，用“ ”号表示；在平板上没有长出或者不是上述形态的菌落时，则判定为幽门螺杆菌阴性，用
“‑”
号表示；当平板上长出疑似幽门螺杆菌菌落形态的菌时，用“*”表示。
[0274]
(2)快速尿素酶实验认定标准：在平板菌落上滴上适量尿素酶溶液，菌落若变为红色，即此菌落尿素触酶阳性，此菌落则被判定为幽门螺杆菌阳性，用“ ”号表示；若菌落尿素触酶反应不变为红色或不变色时，则判定此菌落为幽门螺杆菌阴性，用
“‑”
号表示；当菌落尿素触酶反应颜色变为红色不明显时，则判定此菌落为疑似幽门螺杆菌，用“*”表示。
[0275]
(3)快速革兰氏染色镜检鉴定标准：对菌落形态、快速尿素酶实验存疑时进行镜检，镜检标准：菌为紫色，形态为螺旋形弯曲、末端钝圆时，则判定此菌落中含有幽门螺旋杆菌，用“ ”号表示；反之，若镜检菌不为紫色，且形态没有螺旋形弯曲、末端钝圆时，则判定为幽门螺杆菌阴性，用
“‑”
号表示；若未进行此项检测，用“/”号表示。
[0276]
4、幽门螺杆菌平板培养判定标准：当平板上有一个或者一个以上的菌落生长时，经菌落形态鉴定、快速尿素酶实验、快速革兰氏染色镜检，当菌落形态鉴定和快速尿素酶实验均为阳性或快速革兰氏染色镜检阳性，则判定该菌落为幽门螺杆菌，同时判定幽门螺杆菌在鼠胃内感染定植成功；当菌落形态鉴定和快速尿素酶实验均为阴性或快速革兰氏染色镜检阴性，则判定该菌落不是幽门螺杆菌，同时判定幽门螺杆菌在鼠胃内感染定植不成功。
[0277]
5、sialidase疫苗免疫组连续3轮(10只/轮)动物保护实验其定植率检测结果如下
表3～5：
[0278]
表3
[0279][0280]
表4
[0281][0282]
表5
[0283][0284]
6、由于能直接从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态鉴定和快速尿素酶实验，故未进行快速革兰氏染色镜检。
[0285]
7、根据平板培养结果，连续3轮动物保护实验其各组平均定植率如下表6：
[0286]
表6
[0287]
组别定植率免疫组70％(21/30)感染组93.3％(28/30)空白对照组0％(0/30)
[0288]
根据定植率结果，其保护率如下表7：
[0289]
表7
[0290]
组别保护率免疫组25％(7/28)感染组0％(0/28)空白对照组0％(0/30)
[0291]
由上表可知，免疫组的3轮平均保护率为25％，感染组的3轮平均保护率为0％。
[0292]
因此，本发明的sialidase重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生黏膜免疫应答，并且能够清除幽门螺杆菌ss1菌株在小鼠胃内的定植，将黏膜佐剂与sialidase重组蛋白制成幽门螺杆菌亚单位疫苗可用于预防幽门螺杆菌感染。
[0293]
通过以上实施例，本发明的双促溶标签能够大量上清表达外膜sialidase重组蛋白，发酵、纯化步骤简单，得到的sialidase重组蛋白产量高，免疫原性强，可进一步将其应用于预防幽门螺杆菌感染。
[0294]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0295]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。