一种自发性肺动脉高压模型及构建方法

chest. 2011 aug;140(2):301-309.[5] harrison w farber, joseph loscalzo. pulmonary arterial hypertension. n engl j med,2004.351(16):p.1655-65。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种自发性的肺动脉高压动物模型及其构建方法。
[0006]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明第一方面提供了一种肺动脉高压非人类动物模型的构建方法，修饰非人类动物的基因组，使得修饰的动物基因组包含bmp9基因；以及获得包含经修饰的基因组的非人类动物。
[0007]
进一步，通过将bmp9核酸序列引入非人类动物的单细胞胚胎或胚胎干细胞的基因组来修饰非人类动物的基因组。
[0008]
进一步，所述核酸序列可操作性的连接到表达载体中。
[0009]
进一步，所述动物是啮齿动物。
[0010]
进一步，所述啮齿动物是大鼠。
[0011]
进一步，所述动物模型表现出肺血管重构、右心室肥厚或肺动脉压力升高中的一种及以上的症状。
[0012]
本发明第二方面提供了细胞系，所述细胞系衍生自本发明第一方面所述的构建方法制备的肺动脉高压非人类动物。
[0013]
本发明第三方面提供了胚胎干细胞，所述胚胎干细胞衍生自本发明第一方面所述的构建方法制备的肺动脉高压非人类动物。
[0014]
本发明第四方面提供了如下任一项所述的方法：1）一种繁育肺动脉高压非人类动物的方法，将修饰有bmp9的非人类动物与野生型动物进行繁育，筛选bmp9阳性的动物；2）一种鉴定用于治疗肺动脉高压的治疗剂的方法，所述方法包括：向本发明第一方面所述的构建方法制备的肺动脉高压非人类动物中施用药剂；进行一种或多种测定以确定所述药剂是否对与肺动脉高压相关的一种或多种异常具有效果；以及当所述药剂对与肺动脉高压相关的一种或多种异常有治疗效果时，将所述药剂鉴定为治疗剂。
[0015]
本发明第五方面提供了如下任一项所述的应用：1）本发明第一方面所述构建方法制备的肺动脉高压非人类动物模型、本发明第二方面述的细胞系或本发明第三方面所述的胚胎干细胞在筛选用于治疗肺动脉高压的药物中的应用；2）本发明第一方面所述构建方法制备的肺动脉高压非人类动物模型、本发明第二方面述的细胞系或本发明第三方面所述的胚胎干细胞在评估肺动脉高压治疗/预防效果中的应用；3）bmp9在制备自发性肺动脉高压非人类动物模型中的应用。
[0016]
本发明的有益效果：本发明提供了一种肺动脉高压非人类动物模型，所述模型遗传背景清楚、更接近疾病真实症状，解决了现有动物模型与临床疾病相差较大的问题，对于研究肺动脉高压的临床研究具有重要的意义。
[0017]
附图说明
[0018]
图1是pcdna3.1-alb-bmp9-wt转基因质粒示意图。
[0019]
图2是pcr鉴定tg-bmp9-wt大鼠基因型图；其中，n：阴性对照；p：阳性对照；m：核酸marker；1-7：tg-bmp9-wt大鼠。1-4号为阳性鼠，5-7号为阴性鼠。
[0020]
图3是大鼠的多普勒超声心动图。
[0021]
图4是右心导管检测大鼠肺动脉压力图；其中，4a和4b是大鼠平均肺动脉压力检测和统计图；4c和4d是大鼠右心室收缩压检测和统计图。
[0022]
图5是弹力vg（evg）染色检测肺血管重构病变性质图。
[0023]
图6是统计肺血管中层厚度百分比图，其中，6a是50-100μm小血管中层厚度百分比图；6b是50μm以下微细血管中层厚度百分比图。
具体实施方式
[0024]
以下将对本发明进一步详细说明，应理解，所述用语旨在描述目的，而非限制本发明。
[0025]
术语“核酸序列”“核苷酸序列”或“分离的核苷酸序列”或“多核苷酸序列”或“多核苷酸”或“分离的多核苷酸序列”在本文可互换使用，并且是指分别含有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸分子、dna或rna。核酸可以是双链的、单链的、或包含双链或单链序列的部分。
[0026]“表达”是指将多核酸转录成mrna并翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核酸衍生自基因组dna，并且选择了合适的真核宿主细胞或生物，则表达可包括mrna的剪接。“核酸”包括核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna)，该dna可以是互补dna(cdna)或基因组dna。
[0027]
如本文所用，术语“治疗”是指给予化合物或组合物以控制疾病的进展。疾病进展的控制应理解为达到有益或期望的临床结果，包括但不限于减轻症状、减少疾病持续时间、稳定病理状态(特别是避免额外恶化)、疾病进展的延迟、病理状态的改善和缓解(部分和全部)。与不进行治疗的预期生存相比，疾病进展的控制还涉及生存期的延长。
[0028]
本发明提供了肺动脉高压的新的非人类动物模型。实际上，发明人已经发现了一种新的肺动脉高压动物模型，该模型再现了人类疾病的核心特征。
[0029]
骨形成蛋白9（bmp9，也叫生长分化因子2，gdf2）的基因位于10q11.22染色体上，基因id为2658，包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的基因或蛋白，以及源自细胞中加工的任何形式的基因或蛋白。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体。gene id可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。
[0030]
本文所用，术语“非人类动物”包括非人类脊椎动物，更优选地是哺乳动物，例如驯养的家畜(例如牛，马，猪)，宠物(例如狗，猫)，或啮齿动物。术语“啮齿类”是指系统发育类
啮齿动物的任何和所有成员(例如，小鼠，大鼠，松鼠，海狸，土拨鼠，地鼠，田鼠，土拨鼠，仓鼠，豚鼠和刺豚鼠)，包括从中衍生的所有后代的任何后代。
[0031]
如本文所用，术语“非人类动物模型”是指具有或显示出疾病或病状的特征的非人类动物。用作动物模型是指动物用于研究疾病或状况的任何用途，例如用于研究进展或发展或对新疗法或现有疗法的反应的用途。
[0032]
本发明提供了一种肺动脉高压非人类动物模型的构建方法，修饰非人类动物的基因组，使得修饰的动物基因组包含bmp9基因；以及获得包含经修饰的基因组的非人类动物。
[0033]
在一些实施方案中，通过将bmp9核酸序列引入非人类动物的单细胞胚胎或胚胎干细胞的基因组来修饰非人类动物的基因组。
[0034]
在本发明的具体实施方案中，通过将bmp9核酸序列引入非人类动物的单细胞胚胎（受精卵）的基因组中来修饰非人类动物的基因组。
[0035]
在一些实施方案中，所述核酸序列可操作性的连接到表达载体中。所述的表达载体目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体、质粒、噬菌体。
[0036]
在优选的实施方案中，所述表达载体为质粒，选自本领域常规的用于构建转基因结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将基因相应的dna序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。
[0037]
在本发明的具体实施方案中，所述质粒为pcdna3.1-alb。
[0038]
作为可选择的实施方案，表达载体向细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、deae葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
[0039]
在本发明的具体实施方案中，表达载体向细胞中的导入使用显微注射的方法。
[0040]
作为可选择的实施方案，所述非人类动物是啮齿动物。
[0041]
在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠和大鼠。在一些实施方案中，啮齿动物选自总科鼠总科(muroidea)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物来自选自下列的家族：丽仓鼠科(calomyscidae)(例如，类小鼠的仓鼠)、仓鼠科(cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(platacanthomyidae)(例如，刺棒睡鼠)和鼹形鼠科(spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一些实施方案中，本公开的小鼠来自鼠科(muridae)的成员。
[0042]
在本发明的具体实施方案中，所述啮齿动物是大鼠。
[0043]
在一些实施方案中，所述肺动脉高压非人类动物模型表现出肺血管重构、右心室肥厚或肺动脉压力升高中的一种及以上的症状。
[0044]
在本发明的具体实施方案中，所述肺动脉高压非人类动物在生长一段时间后自发性发展为肺动脉高压。
[0045]
本发明的非人类动物可用于体内试验。另外，本发明的非人类动物可以用作体细胞、胎儿或胚胎细胞的来源，一旦分离并培养，就可以用于体外测试。另外，如果需要，可以
使用常规技术从所述细胞制备永生化细胞系。因此，另一方面，本发明提供了衍生自本发明非人类动物的分离的细胞系。
[0046]
在一些实施方案中，本发明提供了胚胎干细胞，所述胚胎干细胞衍生自前面所述的肺动脉高压非人类动物。
[0047]
在一些实施方案中，本发明提供了非人类动物的后代。本发明的非人类动物的后代可以通过常规方法获得，例如，通过常规方法例如通过本发明非人类动物之间的经典杂交技术、或通过体外受精本发明非人类动物的卵和/或精子，可以获得本发明的非人类动物的后代。如本文所用，术语“后代”是指在原始转化的非人类动物之后的每一代的每个后代。
[0048]
在一些实施方案中，将修饰有bmp9的非人类动物与野生型动物进行繁育，获得bmp9阳性的动物后代。
[0049]
在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定用于治疗肺动脉高压的治疗剂的方法，所述方法包括：向前面所述的肺动脉高压非人类动物中施用药剂；进行一种或多种测定以确定所述药剂是否对与肺动脉高压相关的一种或多种异常具有效果；以及当所述药剂对与肺动脉高压相关的一种或多种异常有治疗效果时，将所述药剂鉴定为治疗剂。
[0050]
本发明的药剂优选在药学上可接受的媒介物中施用。合适的药物载体是本领域技术人员已知的。对于肠胃外给药，通常将化合物溶解或悬浮在无菌水或盐水中。对于肠内给药，将化合物以片剂、液体或胶囊形式掺入惰性载体中。合适的载体可以是淀粉或糖，并且包括润滑剂、调味剂、粘合剂和其他相同性质的材料。所述化合物还可以通过局部施用溶液、乳膏、凝胶或聚合材料(例如，pluronictm，basf)局部施用。
[0051]
或者，可以在脂质体或微球(或微粒)中给予化合物。制备脂质体和微球体以施用于患者的方法是本领域技术人员已知的。本质上，将材料溶解在水溶液中，如果需要的话，将适当的磷脂和脂质以及表面活性剂一起加入，并且根据需要将材料透析或超声处理。由聚合物或蛋白质形成的微球是本领域技术人员众所周知的，并且可以被定制以通过胃肠道直接进入血流。或者，可以掺入化合物，并植入微球或微球的复合物以在数天至数月的一段时间内缓慢释放。
[0052]
本发明的方法优选地用于鉴定减轻这种症状或体征的药剂。
[0053]
在另一个实施方案中，发明涉及一种评估肺动脉高压治疗效果的方法，所述方法包括以下步骤:i)向根据本发明的非人类动物模型提供要测试的药物组合物或化合物，ii)评价在用药物组合物或化合物治疗的所述模型上观察到的效果。
[0054]
根据本发明的优选实施例，要观察的所述效果是指生理病理变化。在本发明的动物模型中待检测的所述生理病理变化是指对动物模型中存在的如先前所述的生理病理变化的任何改善，例如，与对照(未治疗的动物)相比，在治疗后检测肺动脉压力降低，肺血管中层厚度减少。
[0055]
在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的动物模型或根据本发明的细胞系或根据本发明的胚胎干细胞在筛选用于治疗或预防肺动脉高压的药物中的应用。
[0056]
用于本发明方法的候选化合物或药物可包括所有不同类型的有机或无机分子，包括肽，寡糖或多糖，脂肪酸，类固醇等。而且，待筛选的可能的化合物包括，例如，造血干细胞，酶和基因治疗产品，例如，重组载体等。这些化合物可以单独或彼此组合施用。
[0057]
使用动物模型进行筛选，可以在出现特定疾病表型之前，之中或之后施用候选化合物。可以使用本领域技术人员已知的诊断测试来监测疾病进展或消退的症状。监测疾病进展或消退的症状的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，多普勒超声、病理检测等。
[0058]
在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的动物模型或根据本发明的细胞系或根据本发明的胚胎干细胞在评估肺动脉高压治疗效果中的应用。
[0059]
在另一个实施方案中，本发明提供了bmp9在制备自发性肺动脉高压非人类动物模型中的应用。作为可选择的实施方案，所述非人类动物是啮齿动物。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠和大鼠。在一些实施方案中，啮齿动物选自总科鼠总科(muroidea)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物来自选自下列的家族：丽仓鼠科(calomyscidae)(例如，类小鼠的仓鼠)、仓鼠科(cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(platacanthomyidae)(例如，刺棒睡鼠)和鼹形鼠科(spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一些实施方案中，本公开的小鼠来自鼠科(muridae)的成员。
[0060]
在一些实施方案中，通过将bmp9核酸序列引入非人类动物的单细胞胚胎（受精卵）或胚胎干细胞的基因组来修饰非人类动物的基因组进而得到自发性肺动脉高压非人类动物模型。
[0061]
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
[0062]
实施例自发性肺动脉高压模型的构建及检测一、构建载体1、人工合成人源bmp9全长cds（gene id: 2658）；2、构建包含人源野生型bmp9基因全长cds的转基因质粒pcdna3.1-alb-bmp9-wt（图1）。该质粒为实验室自主构建，由alb基因启动子序列（2460bp，图1中绿色高亮部分）驱动人源野生型bmp9基因（1290bp，图1中红色高亮部分）在肝脏高表达。
[0063]
3、质粒全长8574 bp，用sanger测序确认核酸正确无误。
[0064]
二、显微注射1、结扎雄鼠：输精管结扎的sd雄鼠。
[0065]
2、超数排卵：10只3-4周龄sd鼠注射激素进行超排。
[0066]
3、受精卵注射：取约100枚受精卵进行注射。
[0067]
4、受体鼠制备：8周龄sd雌鼠与结扎雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
[0068]
5、胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部。
[0069]
三、基因型鉴定
1、剪尾编号：出生7-10天的大鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号。
[0070]
2、基因组dna提取： 使用全式金（transgen）公司的基因组dna提取试剂盒（ee101-12）提取大鼠基因组dna。
[0071]
3、pcr检测：合成pcr基因型鉴定引物（表1），使用takara公司rr042a试剂盒，按照表2所示试剂配比以及表3所示反应条件，对大鼠进行基因型鉴定。
[0072]
表1 引物序列表2 pcr反应体系表3 pcr扩增程序 4、结果分析：pcr完成后，用6
×
loading buffer 终止pcr反应，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。只有携带bmp9转基因片段的大鼠才能扩增出552bp阳性条带，同窝阴性大鼠没有条带（图2）。
[0073]
四、繁育子代：1、将获得的founder大鼠为f0代大鼠与野生型sd大鼠交配得到f1代，通过pcr鉴定得到f1代tg-bmp9-wt大鼠。
[0074]
2、每一代杂合阳性雄鼠按雄雌1：2比例与野生型雌鼠合笼交配，获得下一代大鼠。
[0075]
3、截至2021年12月，大鼠已经传代到f5代，基因型稳定，每一代阳性大鼠比例为
42-55%，符合孟德尔遗传定律。
[0076]
五、tg-bmp9-wt自发性肺动脉高压实验方法：1、右心导管检测肺动脉压力：利用多导生理记录仪 (powerlab/8sp)及其配套的压力换能器检测大鼠肺动脉血流动力参数。将大鼠用异氟烷-氧气混合气体（1.5％）麻醉，使其仰卧，固定其四肢，在大鼠右侧胸骨上方1cm处剪开皮肤，暴露右侧颈外静脉，分离血管周围结缔组织。在血管下穿过两条结扎线，颈外静脉远心端结扎，近心端打一松节，提起近心端结扎线以阻断血流。将导管送入血管，将近心端的松节扎紧以固定导管。导管经肺静脉进入右心室，然后进入肺动脉。观察波形，确认导管所在位置，导管进入右心室与肺动脉后分别记录压力。波形稳定后，取三段波形，每段波形包含10个心动周期，记录平均肺动脉压、右心室收缩压的数据，以三组数据的平均值作为最终检测结果。
[0077]
2、超声心动图检测大鼠心脏结构和功能大鼠利用异氟烷-氧气混合气体（1.5％）麻醉，仰卧于测量板上，胸部涂抹耦合剂，使用小动物超声仪（vevo
®ꢀ
2100 成像系统）分别在胸骨旁左心室短轴切面同一心动周期内测量收缩期和舒张期左室前壁厚度、左室后壁厚度、左室腔径大小，在主动脉短轴切面检测右室流出道宽度，并使用多普勒模式在主动脉短轴切面测量肺动脉内血流，在四腔心切面检测三尖瓣环收缩期位移，在胸骨旁右心短轴切面测量舒张期右室游离壁厚度和腔径大小。
[0078]
3、病理取大鼠肺组织，多聚甲醛常温固定14天后脱水、石蜡包埋，he和evg染色，评估血管重构性质，测量大鼠肺小动脉（《50μm和50-100μm）中膜增厚百分比（肌层厚度/血管外径），每组大鼠至少统计5只，每只大鼠15-20个血管。
[0079]
4、统计分析应用graphpad prism 8.0软件作图分析，数据用表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用独立样本t检验，p《0.05说明差异具有统计学意义。
[0080]
5、结果：1) tg-bmp9-wt 大鼠在2月龄时表型正常，肺动脉压力、右心室无明显异常。
[0081]
2) tg-bmp9-wt 大鼠6月龄时，大鼠出现自发性肺动脉高压。超声心动图显示，与wt大鼠（n=8）相比，tg-bmp9-wt大鼠（n=5）主动脉短轴切面多普勒模式可见肺动脉血流有双峰趋势，且肺动脉血流峰值远低于wt大鼠（p =0.005）（图3）。右心导管检测大鼠肺循环血流动力学显示，5只6月龄tg-bmp9-wt 大鼠全部表现出自发性肺动脉高压，发病率100%。野生型大鼠mpap均值为18mmhg，rvsp均值为19mmhg。转基因大鼠平均肺动脉压（mpap）均值为43mmhg（p 《 0.001），最高可达到59mmhg；右室收缩压（rvsp）均值为57mmhg（p 《 0.001），最高可达90mmhg（图4）。
[0082]
病理检测表明，6月龄tg-bmp9-wt大鼠微小肺血管发生明显重构，内膜增生、纤维化，微小肺血管几乎完全闭塞（图5）。进一步的，利用肺组织病理图片，统计50-100μm小血管及50μm以下微细血管中层厚度占血管直径比例。结果如图6所示，tg-bmp9-wt大鼠50-100μm小血管中层显著增厚（p《0.01；6a），50μm以下微细血管中层增厚程度更加显著（p《0.01；6b）。