一种采用单标签进行相对定量的mNGS病原检测方法与流程

一种采用单标签进行相对定量的mngs病原检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物基因检测技术，具体说，是一种采用单标签进行相对定量的mngs病原检测方法。


背景技术：

2.自2005年开发二代测序（ngs）技术以来，宏基因组方法在二代测序中的使用频率大大增加。宏基因组测序（mngs）是一种不需进行病原微生物培养即可快速深入鉴定感染病原体的新技术，相比传统培养方法拥有更高敏感性的同时又与“精准诊疗”的理念相契合，mngs是临床病毒学中有效的重要工具（mokili jl, rohwer f, dutilh be. metagenomics and future perspectives invirus discovery. curr opin virol. 2012, 2:63
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77）。
3.mngs可以立即获得完整的病毒遗传信息，从而进行病毒流行病学监测或鉴定病毒耐药性特定突变（prachayangprecha s, schapendonk cme, koopmans mp, osterhaus adme, sch
ü
rch ac, pas sd, et al. exploring the potential of next-generation sequencing in detection of respiratory viruses. j clin microbiol. 2014, 52:3722
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30），能够鉴定高度不同的病毒基因组、罕见的病原体，并发现靶向pcr遗漏的病毒（graf eh, simmon ke, tardif kd, hymas w, flygare s, eilbeck k, et al.unbiased detection of respiratory viruses by use of rna sequencing-based metagenomics: a systematic comparison to a commercial pcr panel. j clin microbiol. 2016, 54:1000
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7），使用mngs进行宏基因组学分析是确定病毒感染丰度并以无偏好性的方式鉴定感染的有效方法（lefterova mi, suarez cj, banaei n, pinsky ba. next-generationsequencing for infectious disease diagnosis and management: a reportof the association for molecular pathology. j mol diagn. 2015, 17:623
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634）。
4.目前mngs技术临床采集样本类型根据不同病灶主要分为静脉血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液及其他体液、组织等，临床样本采集对象为人类样本，含有大量人类基因组信息，对mngs的病原菌或其他微生物的测序结果产生较大影响。针对此问题，多数检验所机构采取对临床样本提取核酸前进行前处理操作，以期去除部分宿主信息（即人类核酸），提升病原菌的检出比例。
5.但由于临床样本采集部位、样本间个体差异导致样本复杂性极高，各样本类型间的宿主比例不尽相同，统一进行的去宿主前处理操作效果也不尽相同。这导致了不同样本间测序数据中宿主所占比例无法处于同一水平，对于同批次不同样本类型间病原菌检出情况无法在同一水平线进行比较，临床相关研究中样本间的病原菌检出无法相对量化，宿主比例的无法均一化大大影响了临床样本研究数据的真实性和可靠性。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是，通过向样本中添加一种特定的单标签的方法以达
成对同批次或同一待研究范围内临床样本的病原菌检出数目相对定量的效果。即向待比较范围内的所有临床样本均添加等量的同一来源的单标签，该标签可为来自于某种微生物的一段核酸序列，需满足与人类基因组无匹配；以该单标签作为标志物，对检出数据中来自人源的序列检出条数进行校正，因该单标签的添加量保持恒定，因此通过该单标签在不同样本中的检出数即可对不同样本中人源的序列检出条数均一化，以达成在同一水平线比较不同样本间病原菌检出情况的目的。
7.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种采用单标签进行相对定量的mngs病原检测方法，包括以下步骤：步骤1：制备单标签：单标签采用人工合成或购买已选择的菌株，菌株浓度为100μg/ml，按预估使用量分装至不同的1.5 ml ep管中，保存在-80℃冰箱；步骤2：mngs样本中单标签的添加：临床样本收录后，样本按照单次提取用量分装至2.0 ml ep管中，取出分装好的单标签，室温化冻，彻底融化后置于涡旋震荡仪上震荡混匀，8000 rpm/min转速下离心30 sec，每个样本中添加10 μl离心好的单标签，混匀后进行核酸提取和mngs文库构建；步骤3：测序数据均一化标准化：设定1μg单标签在无人源宿主影响条件下理论检出reads数为n；均一化指数=n/临床样本中单标签实际检出reads数；均一化后某病原菌检出数=均一化指数
×
下机数据中某病原菌检出reads数；步骤4：根据均一化后某病原菌检出数的数值，完成不同样本间某一病原菌的相同水平横向比较。
8.优选，所述单标签的选择满足以下条件：一、单标签为已知序列或已知来源的核酸片段，或为已知序列或已知来源的基因组；二、单标签的核酸序列与人类基因组序列无匹配；三、单标签来源为生物，如果是微生物，为非常见病原菌。
9.优选，所述n为人为标准化设定，取值为不低于10的整数。
10.优选，所述n为10000。
11.优选，所述步骤2中，每次使用时取出1管单标签添加至同批次的临床样本中，不可反复冻融。
12.本发明的有益效果是：（1）本发明可实现mngs测序数据的均一化，在去除人源宿主测序信息影响的前提下比较不同样本间的病原菌实际检出情况；目前mngs领域未有针对测序数据中人源比例相对定量的方法报道，本发明大大提升mngs测序数据的真实性和准确性；（2）本发明操作简便，无需增加较多操作步骤和试剂耗材；本发明仅在样本中增加可定制化的同一来源的单标签，并随mngs文库构建过程流转，直至流转至上机测序环节，通过对测序数据的分析校正，即可完成对宿主测序数据的均一化。
具体实施方式
13.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；
显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.本发明的采用单标签进行相对定量的mngs病原检测方法，包括以下步骤：步骤1：制备单标签：单标签采用人工合成或购买已选择的菌株，菌株浓度为100μg/ml，按预估使用量分装至不同的1.5 ml ep管中，保存在-80℃冰箱；步骤2：mngs样本中单标签的添加：临床样本收录后，样本按照单次提取用量分装至2.0 ml ep管中，取出分装好的单标签，室温化冻，彻底融化后置于涡旋震荡仪上震荡混匀，8000 rpm/min转速下离心30 sec，每个样本中添加10μl离心好的单标签，混匀后进行核酸提取和mngs文库构建；步骤3：测序数据均一化标准化：设定1 μg单标签在无人源宿主影响条件下理论检出reads数为n；均一化指数=n/临床样本中单标签实际检出reads数；均一化后某病原菌检出数=均一化指数
×
下机数据中某病原菌检出reads数；步骤4：根据均一化后某病原菌检出数的数值，即可完成不同样本间某一病原菌的相同水平横向比较。
15.所述单标签来源的选择满足以下条件：一、单标签为已知序列或已知来源的核酸片段，或为已知序列或已知来源的基因组；二、单标签的核酸序列与人类基因组序列无匹配；三、单标签来源为生物，如果是微生物，为非常见病原菌。
16.所述n为人为标准化设定，取值为不低于10的整数。优选，所述n为10000。
17.所述步骤2中，每次使用时取出1管单标签添加至同批次的临床样本中，不可反复冻融。
18.上述单标签的选择和制备均为本专业的常规步骤，在此不再叙述。
19.下面结合本发明的具体实施例进行说明：1. 单标签在不同含量的人源细胞样本中的校正效果测试：（1）购买哈氏噬纤维菌（cytophaga hutchinsonii），配制菌株浓度为100μg/ml，按预估使用量（1 ml）分装至不同的1.5 ml ep管中，保存在-80℃冰箱，使用时取出1管添加至同批次的临床样本中，不可反复冻融；（2）配制不同量的人源细胞梯度，细胞数分别为1.00*104、5.00*104、1.00*105、5.00*105、1.00*106，每个人源细胞梯度4-5个技术重复，取出分装好的单标签，室温化冻，彻底融化后置于涡旋震荡仪上震荡混匀，8000 rpm/min转速下离心30 sec，每个样本中添加10 μl离心好的单标签，混匀后进行核酸提取和mngs文库构建；（3）设定1μg单标签在无人源宿主影响条件下理论检出reads数为10000（该数值为人为标准化设定，包括但不仅限于10000条reads）；均一化指数=10000/临床样本中单标签实际检出reads数；均一化后某病原菌检出数=均一化指数
×
下机数据中某病原菌检出reads数；结果如下：
由以上数据可知，在不同含量的人源细胞样本，即人源宿主比例不同情况下，添加相同量的病原菌，实际病原微生物检出reads数产生了数量级的差别（2000-40000条不等），在经过校正后，均一化后病原菌微生物检出数处于相同水平，不同数目人源细胞中均一化后病原菌检出数cv值在14.41%，远低于实际检出情况（81.27%）。
20.2. 单标签的校正效果稳定性测试：（1）购买哈氏噬纤维菌（cytophaga hutchinsonii），配制菌株浓度为100 μg/ml，按预估使用量（1 ml）分装至不同的1.5 ml ep管中，保存在-80℃冰箱，使用时取出1管添加至同批次的临床样本中，不可反复冻融；（2）配制不同量的人源细胞梯度，细胞数分别为1.00*104、5.00*104、1.00*105、5.00*105、1.00*106，每个人源细胞梯度4-5个技术重复，取出分装好的单标签，室温化冻，彻底融化后置于涡旋震荡仪上震荡混匀，8000 rpm/min转速下离心30 sec，每个样本中添加
10 μl离心好的单标签，混匀后进行核酸提取和mngs文库构建；（3）设定1 μg单标签在无人源宿主影响条件下理论检出reads数为10000（该数值为人为标准化设定，包括但不仅限于10000条reads）；均一化指数=10000/临床样本中单标签实际检出reads数；均一化后某病原菌检出数=均一化指数
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下机数据中某病原菌检出reads数；（4）按照以上方法重复2次实验，与1中校正结果对比，计算每次实验实际病原菌检出cv值与均一化后病原菌检出的cv值，确认单标签校正效果的稳定性，结果如下：
由以上数据可知，批次1中不同数目人源细胞中均一化后病原菌检出数cv值在14.41%（实际检出cv值81.27%），批次2中不同数目人源细胞中均一化后病原菌检出数cv值在10.65%，批次3中不同数目人源细胞中均一化后病原菌检出数cv值在5.97%，单标签的校正效果稳定。
21.3. 单标签的校正效果在临床中的应用：（1）购买哈氏噬纤维菌（cytophaga hutchinsonii），配制菌株浓度为100 μg/ml，按预估使用量（1 ml）分装至不同的1.5 ml ep管中，保存在-80℃冰箱，使用时取出1管添加至同批次的临床样本中，不可反复冻融；（2）选取临床肺泡灌洗液样本2个，脑脊液样本2个，痰液样本2个，外周血样本2个，
每个样本3个技术重复，取出分装好的单标签，室温化冻，彻底融化后置于涡旋震荡仪上震荡混匀，8000 rpm/min转速下离心30 sec，每个样本中添加10 μl离心好的单标签，混匀后进行核酸提取和mngs文库构建；（3）设定1 μg单标签在无人源宿主影响条件下理论检出reads数为10000（该数值为人为标准化设定，包括但不仅限于10000条reads）；均一化指数=10000/临床样本中单标签实际检出reads数；均一化后某病原菌检出数=均一化指数
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下机数据中某病原菌检出reads数；校正前后对比如下：
由以上数据可知，基于单标签相对定量技术后，可将不同样本类型的样本中检测到的同种病原菌均一化，该均一化后的结果可进行横向比较。
22.以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。