一种乳酸杆菌保护剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种菌类保护剂，具体涉及一种乳酸杆菌保护剂及其应用。


背景技术：

2.化学药品和抗生素在渔业养殖中已经有很长的使用历史，长期使用化药和抗生素引起的耐药性和一些药物毒性容易在鱼体残留，其结果是防治鱼病成本提高而药效降低，甚至通过食物链而危害到人的健康。
3.乳酸菌是一类能产生乳酸的革兰氏阳性细菌。国内外研究发现乳酸菌作为鱼饵料拌料，可以有效调节鱼类肠道微生物群落结构稳定，同时抑制杂菌，而产生的代谢产物也可以提升饵料的利用率。同时，在水体中加入乳酸菌制剂，也可以有效改善水质，降低鱼体病害发生。
4.乳酸菌菌种资源易得，并且天然、安全、有效，近年来在水产养殖业中的发展中取得了一定的进步，但其发展程度相比于乳酸菌制剂应用于畜牧业还存在较大差距，所以乳酸菌制剂在渔业养殖中具有相当大的优势和广阔的发展前景。
5.目前，市面上渔用乳酸菌制剂主要有液态和固态两种，液态乳酸菌制作成本低、技术要求不高，相比于固态乳酸菌有更大的优势，也更适应市场的需求。但是，液态乳酸菌在常温下菌体容易死亡，活菌数降低。
6.中国专利cn103820323a公开了一种提高液体乳酸菌存活率的保存方法，采用缓释碳源(缓释碳源)和酸碱调节剂(氢氧化钠)，酸碱调节剂调节液体乳酸菌的ph至5.5以上，在低温(5℃)下保存。但是，只能在短期内提高乳酸菌存活率，超过1个月对乳酸菌的存活率没有任何作用，而且只能在低温下起作用，在37℃下30d存活率仅能保持在2.36％。
7.中国专利cn107354097a公开了一种在常温下提高液态乳酸菌存活率的乳酸菌保存剂及其应用，包括如下组分：蛋白胨0.05～0.15份；酵母浸粉0.05～0.15份；白砂糖4～6份；葡萄糖1～3份；奶粉0.5～1.5份；奶油3～5份；亚油酸0.5～1.5份；抗性糊精0.03～0.07份；七水硫酸镁0.04～0.08份；七水硫酸锰0.01～0.05份；玉米浆干粉1～3份；质量比为羧甲基纤维素钠：海藻酸钠：瓜尔豆胶：黄原胶＝2:2:1:2的混合物0.1～0.3份；nah2po40.02～0.06份；柠檬酸钠0.1～0.5份；柠檬酸0.15～0.4份；乙酸钠0.05～0.15份；卵磷脂0.05～0.15份；单硬脂酸甘油酯0.02～0.08份和净化水77.86～89.33份。该保护剂成分多，添加成本高，且只能在短期提高乳酸菌的存活率，超过一个月乳酸菌含量大量下降。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种乳酸杆菌保护剂及其应用，解决了现有乳酸菌液体制剂难以长期保存的问题，能够显著提高乳酸杆菌在常温下的保存时间。
9.为了达到上述目的，本发明提供了一种乳酸杆菌保护剂，该乳酸杆菌保护剂包含以下重量百分数的成分：79.9～89.9％七水合硫酸镁、9.7～19.9％一水柠檬酸，0.05～0.15％苯甲酸钠和0.15～0.25％聚二甲基硅氧烷。
10.本发明的乳酸杆菌保护剂，采用七水合硫酸镁为乳酸菌提供微量元素，同时硫酸镁也是乳酸菌细胞壁的重要组成成分，有助于乳酸菌细胞结构的稳定；一水柠檬酸调节发酵液的ph为3.5～3.7，该ph下，乳酸菌菌体的活性最低、存活时间最长，另外，柠檬酸作为一种有机酸，有独特的酸味，和乳酸菌发酵的味道相辅相成，使得产品更具特色，而且一水柠檬酸的水溶性优于柠檬酸，在乳酸菌制剂中20℃就溶解非常快；苯甲酸及其盐类是广谱抗微生物试剂，但它的抗菌有效性依赖于ph值，随着介质酸度的增高其杀菌、抑菌效力增强，在碱性介质中则失去杀菌、抑菌作用，其杀菌或抑菌的最适ph值为2.5～4.0，本发明通过一水柠檬酸调节ph，使得发酵液的ph适合苯甲酸钠发挥杀菌或抑菌作用，可以很好的抑制杂菌尤其是霉菌的生长，同时，苯甲酸钠还具有防腐的作用，可以有效防治乳酸菌发酵液的变质；聚二甲基硅氧烷具有耐热性、耐寒性、可以有效帮助发酵液抵御气温变化带来的影响，提高乳酸菌的存活率，同时其具有导热性，可以使得乳酸菌发酵液的温度及时散去，进一步降低高温对菌体的影响。
11.优选地，乳酸杆菌选自植物乳杆菌sicc 1.936、植物乳杆菌sicc 1.354、布氏乳杆菌sicc 1.1256、布氏乳杆菌sicc 1.1257、棒状乳杆菌sicc 1.1361和棒状乳杆菌sicc 1.890中任意一种或两种以上。本发明的另一目的是提供所述的乳酸杆菌保护剂的应用，该应用选自以下任意一种：(1)在提高乳酸杆菌存活率方面的应用；(2)在乳酸杆菌保存方面的应用；(3)在用于鱼类生长调节的菌剂中的应用。
12.本发明的另一目的是提供所述的乳酸杆菌保护剂在用于鱼类生长调节的菌剂中的应用，所述菌剂包含：乳酸杆菌和乳酸杆菌保护剂，其中，所述乳酸杆菌选自植物乳杆菌sicc 1.936。
13.优选地，所述用于鱼类生长调节的菌剂包含：乳酸杆菌和乳酸杆菌保护剂，其中，所述乳酸杆菌选自植物乳杆菌sicc 1.936。
14.优选地，在鱼类生长调节的菌剂中，所述乳酸杆菌保护剂的含量为1～2.5％。
15.优选地，所述鱼类选自鲫鱼。
16.优选地，所述菌剂包含：乳酸杆菌的二级种子液和乳酸杆菌保护剂；其中，所述乳酸杆菌的二级种子液的制备，包含：将活化的乳酸杆菌在一级种子液培养基中37℃培养，获得一级种子液；将所述一级种子液接入二级种子液培养基中，不充气，静置发酵或搅拌发酵10～24h，获得二级种子液。
17.优选地，所述一级种子液培养基的成分包含：蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、柠檬酸二铵、磷酸氢二钾、醋酸钠、硫酸猛、硫酸镁、葡萄糖、土温-80和水，ph为6.2～6.4；所述二级种子液培养基的成分包含：葡萄糖、红糖、蛋白胨和水，发酵结束的ph为4～4.7；所述二级种子液中添加保护剂后ph为3.5～3.7。
18.优选地，所述蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、柠檬酸二铵、磷酸氢二钾、醋酸钠、硫酸猛、硫酸镁、葡萄糖、土温-80和水的用量比为10g：10g：5g：2g：2g：5g：0.25g：0.58g：20g：1.0ml：1000ml；所述葡萄糖、红糖、蛋白胨和水的用量比为5g：5g：2g：500ml。
19.本发明的另一目的是提供一种乳酸杆菌菌剂，该乳酸杆菌菌剂中含有1.5～2.5％所述的乳酸杆菌保护剂和乳酸杆菌。
20.本发明的乳酸杆菌保护剂及其应用，解决了现有乳酸菌液体制剂难以长期保存的问题，具有以下优点：
21.本发明的乳酸杆菌保护剂能够显著提高乳酸杆菌的存活期，甚至到第六个月都有较大的活菌量。本发明的保护剂对植物乳杆菌、布氏乳杆菌和棒状乳杆菌均具有效果，具体地，对植物乳杆菌sicc 1.936、植物乳杆菌sicc 1.354、布氏乳杆菌sicc 1.1256、布氏乳杆菌sicc 1.1257、棒状乳杆菌sicc 1.1361、棒状乳杆菌sicc 1.890均具有很好的保护效果，尤其对2株植物乳杆菌的作用效果最好，在经过60d活菌数仍高达108cfu/ml。而且，植物乳杆菌sicc 1.936在促进鱼体生长和减少鱼死亡率上的效果优于其他5株菌，具有更好的应用价值。添加本发明保护剂的植物乳杆菌sicc 1.936更好促进鱼类肠道有益菌的生长、抑制有害菌的生长，调节肠道菌群的平衡。
具体实施方式
22.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实验例1乳酸菌发酵液制备
24.1、乳酸菌的活化
25.采用的乳酸菌菌株为植物乳杆菌(编号sicc 1.936)、植物乳杆菌(编号sicc 1.354)、布氏乳杆菌(编号sicc 1.1256)、布氏乳杆菌(编号sicc 1.1257)、棒状乳杆菌(编号sicc 1.1361)、棒状乳杆菌(编号sicc 1.890)以上菌株均购自四川省微生物资源平台菌种保藏管理中心。
26.在实验室将购买的上述乳酸菌分别在平板培养基上进行活化，平板培养基成分包含：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物(购自oxoid公司，型号lp0021b)、2g柠檬酸二铵、2g磷酸氢二钾、5g醋酸钠、0.25g硫酸猛、0.58g硫酸镁、20g葡萄糖、1.0ml土温-80、20g琼脂、1000ml蒸馏水，ph为6.2～6.4，121℃灭菌20min后倒平板上。
27.2、一级种子液制备
28.在超净工作台内使用接种环从上述活化平板上挑足量的乳酸菌接入一级种子液培养基中，放入37℃摇床中，在120r/min的条件下培养60h，获得一级种子液，一级种子液的活菌量为4.1
×
10
10
cfu/ml，比二级种子液体的活菌量高，但是生产成本远远高于二级种子液，乳酸菌活菌量大于108cfu/ml就能发挥很好的效果，因此选用二级种子液作为调节鲫鱼生长的菌剂。
29.其中，上述一级种子液培养基的成分包含：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、2g柠檬酸二铵、2g磷酸氢二钾、5g醋酸钠、0.25g硫酸猛、0.58g硫酸镁、20g葡萄糖、1.0ml土温-80和1000ml蒸馏水，ph为6.2～6.4，121℃灭菌20min冷却后使用。
30.3、二级种子液制备
31.在无菌环境中，将上述制备的一级种子液按照10％接种量接入二级种子液培养基中，不充气，静置发酵或搅拌发酵10～24h，获得二级种子液(液态乳酸菌)，含活菌量：3
×
10
10
cfu/ml。
32.其中，上述二级种子液培养基的成分包含：25g葡萄糖、25g红糖、10g蛋白胨和1000ml自来水，发酵结束的ph为4.0～4.7。
33.为了不胀气，一般发酵完成后，在塑料或大储藏罐常温下静置2～3天后加入保护剂再装瓶，加入保护剂后乳酸菌菌剂成品ph为3.5～3.7，成品在常温下保存即可。
34.实验例2乳酸菌发酵液对鱼体生长的影响
35.将上述6株乳酸菌分别制备成一级种子液，活菌量均统一稀释到3
×
10
10
cfu/ml，6种液态产品都放置在25℃常温下，拌料投喂，100kg饲料加液态产品3l，6个实验组鲫鱼各100尾，投喂二个月，最后观察6种液体产品对鲫鱼的生长性能的差异。
36.表1为不同乳酸菌对鲫鱼的生长性能的影响
[0037][0038]
由上表1可知，乳酸菌sicc 1.936、sicc 1.354、sicc 1.1256、sicc 1.1257、sicc 1.1361这5株菌对促进鱼体生长都有一定的效果，其中sicc 1.936、sicc 1.1256、sicc 1.1361、sicc 1.890在减少死亡率上效果更好，可见不同类型乳酸菌在鱼类养殖中具有较好的效果，具有很大的开发应用价值。而且，植物乳酸菌sicc 1.936在促进鱼体生长和减少鱼死亡率上的效果优于其他5株菌，所以选取该菌具有更好的应用价值，以下针对该菌进行保护剂的筛选试验。
[0039]
实验例3乳酸菌保护剂的筛选
[0040]
利用上述选取的植物乳杆菌sicc 1.936的二级种子液，对多种材料进行乳酸菌保护剂材料的筛选，单一材料的添加量重量百分数为1％，其中对乳酸菌活菌有积极影响的材料参见表2。
[0041]
表2为单一材料作为乳酸菌保护剂下植物乳杆菌sicc 1.936的活菌数(单位：cfu/ml)
[0042][0043]
注：ck为对照组；活菌数为0且长白霉是因为乳酸菌都死了，无法抑制杂菌生长，导致一些真菌能够生长，这些白霉主要是一些真菌的菌丝；而有些活菌数为0但不长白霉，这是因为添加了苯甲酸钠、一水柠檬酸，有抑制杂菌生长的能力。
[0044]
如上表所示，经过对多种材料进行筛选发现，在二级种子液中各自添加七水合硫酸镁、一水柠檬酸、苯甲酸钠、聚二甲基硅氧烷这四种材料，对乳酸菌活菌量提高和液态防腐中具有很好的效果，其中，添加七水合硫酸镁和一水柠檬酸在提高活菌量的效果很好，但单独添加保护剂的发酵液中活菌量依旧不高，因此设计正交试验将上述4种材料进行复配(参见表3)，将配比进一步优化，以期得到更好的保护剂，进一步提高活菌量。
[0045]
表3为复配的乳酸菌保护剂下植物乳杆菌sicc 1.936的活菌数(单位：cfu/ml)(添加量为重量百分数1％)
[0046][0047]
由上表3可知，发酵液放置30d后，以84.90％七水合硫酸镁、14.80％一水柠檬酸、0.10％苯甲酸钠和0.20％聚二甲基硅氧烷组成的保护剂的活菌量最高，是最佳的复合保护剂配方。
[0048]
将上述最佳的复合保护剂按照比列添加进二级种子液，分别在发酵好的乳酸菌液体分别添加1％、1.5％、2％、2.5％(重量百分数)保护剂，研究不同添加量对乳酸菌的影响。
[0049]
表4为添加不同浓度保护剂在常温下不同时间植物乳杆菌sicc 1.936的活菌数(单位：cfu/ml)
[0050][0051][0052]
从上表4可知，添加的保护剂浓度为2％时，植物乳杆菌sicc 1.936的存活期最长，
活菌量最高，甚至到第六个月都有较大的活菌量。
[0053]
实验例4乳酸菌保护剂在不同类型乳酸菌中的应用
[0054]
在前述的6种菌株的二级发酵液中按2％的比列加入筛选的最佳保护剂，研究保护剂对不同菌株的作用效果。
[0055]
表5为保护剂在不同类型乳酸菌中的应用效果试验(单位：cfu/ml)
[0056][0057]
由上表5可知，保护剂对不同菌株均有一定的效果，尤其对2株植物乳杆菌的作用效果最好，因此本发明的保护剂可特用于植物乳杆菌发酵液的保存。
[0058]
实验例5乳酸菌保护剂在液态乳酸菌对鲫鱼生长性能方面的影响
[0059]
将实验例1制备的液态乳酸菌(3
×
10
10
cfu/ml)做动物试验，观察添加2％乳酸菌保护剂的植物乳杆菌sicc 1.936的二级发酵液(实验组1)、未添加乳酸菌保护剂的植物乳杆菌sicc 1.936的二级发酵液(实验组2)、添加2％最佳保护剂的水(实验组3)及清水(ck)的四种产品对鲫鱼的生长性能的影响。
[0060]
四种液态产品都放置在25℃常温下，拌料投喂，100kg饲料加液态产品3l，四个实验组鲫鱼各300尾，投喂二个月，最后观察四种液体产品对鲫鱼的生长性能的差异(包括增重率、死亡率、肠道菌群)。
[0061]
表6为四种液体产品对鲫鱼生长性能的影响
[0062][0063]
由表6可知，实验组1增重率提高最大，死亡率最低，实验组2的增重率高于实验组3和ck组，死亡率低于实验组3和ck组，上述结果表明本发明的乳酸菌保护剂在乳酸菌对鲫鱼的生长性能方面具有很重要的作用。
[0064]
表7为添加或未添加乳酸菌保护剂的液态乳酸菌对鲫鱼肠道菌群的影响
[0065][0066]
由表7可知，实验组1的鲫鱼肠道有益菌乳酸菌、双歧杆菌菌群数量均高于其他三个实验组，有害菌大肠杆菌菌群数量均低于其他三个实验组。上述结果表明添加本发明保护剂的乳酸菌能更好促进肠道有益菌的生长、抑制有害菌的生长，调节肠道菌群的平衡。
[0067]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。