一种茯苓多糖复合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种多糖复合物及其制备方法，具体涉及一种茯苓多糖复合物及其制备方法，属于多糖衍生物技术领域。


背景技术：

2.中药茯苓是一种药用真菌，具有祛湿利尿、健脾和胃、安神宁心的作用，它不仅可以入药，也是一种传统的保健食品。经大量实验和临床研究表明，茯苓所含的主要生物活性物质茯苓多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、催眠等药理作用。但是茯苓多糖因为存在较强的分子间和分子内氢键而使得其活性及溶解性下降，以至于其临床给药途径受到限制。因此，需要通过对茯苓多糖进行结构修饰，从而提高其溶解性，增强其生物活性，减少临床试验中可能出现的不良反应及毒副作用。
3.多糖的活性直接或间接受其分子结构的影响，采用一定的方法对多糖分子结构进行适当的化学修饰可以有效提高多糖生物活性，甚至是制备得到具有多重生物活性的多糖衍生物。多糖经过分子修饰后设计出多种新型结构与功能的多糖衍生物，这对于多糖构效方面的研究具有重要的意义，并且为多糖类食品添加剂、功能性食品、保健品及天然药物的研发提供实验基础和理论依据。
4.目前，文献报道中可见硫酸酯化茯苓多糖、羧甲基茯苓多糖、乙酰化茯苓多糖和磺酰化茯苓多糖，但未见磷酸酰胺化茯苓多糖衍生物方面的报道。多糖结构修饰的方法有多种，其中，磷酸化接枝修饰是多糖分子修饰中的一种共价修饰，其支链上的羟基被磷酸根取代，可增强或增加多糖的抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等生物活性。磷酸基团主要接在葡萄糖单元的碳-6位和碳-3位上，其中，碳-3位上的磷酸化对多糖的生物活性的提高非常明显。目前，文献资料中对磷酸化多糖类衍生物的报道相对较少，知网上检索未见有茯苓多糖磷酸衍生物的报道，仅见一些对海带多糖、黑木耳多糖、黄芪多糖进行磷酸化修饰的报道，这些报道提及的工艺操作过程较复杂，并且制得的多糖衍生物的磷酸根含量不高。
5.锌是人体必需的微量元素之一，至少有85种酶是含锌的金属酶，锌几乎与所有蛋白质和氨基酸代谢有关。锌对细胞生长增殖、生物正常生长发育、提高免疫力、预防疾病、促进身体和智力发育等具有非常重要的作用，也是许多金属酶的组成成分或酶激活剂, 同时还有明显的抗氧化作用。但无机补锌对胃粘膜刺激很大，并且大多数锌离子未经吸收就排出体外，故不利于人体吸收，补锌效果差。由于有机锌更接近于其在体内的作用形式，故更容易被人体吸收。多年来，各国研究人员一直在探求副作用小、生物利用率高的有机锌营养强化剂。微量元素与多糖形成配合物可通过小肠吸收途径被直接消化吸收，大大提高微量元素的吸收率，并且在补充锌的同时又可以补充人体所需的多糖。文献中有报道海藻多糖锌配合物、杏鲍菇多糖配合物、金针菇多糖锌配合物、猪苓多糖锌配合物等的制备，但未见磷酸酰胺茯苓多糖锌络合配位衍生物方面的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种磷酸根含量和锌含量都较高的茯苓多糖复合物——磷酸酰胺茯苓多糖锌络合配位衍生物及其制备方法。
7.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种茯苓多糖复合物的制备方法，其特征在于，在微波水热条件下使用羟基乙叉二膦酸及氯化锌与茯苓多糖反应制备得到茯苓多糖复合物，具体包括以下步骤：（1）将茯苓多糖、羟基乙叉二膦酸、氯化锌和水合肼与水混合，得到混合液，调节混合液的ph值至5.0～8.0；（2）将混合液转入封闭的聚四氟乙烯高压反应釜中，于110～140℃微波水热反应10～30min；（3）离心取上清液，然后对上清液依次进行醇沉、离心、洗涤、干燥处理，得到茯苓多糖复合物。
8.前述的茯苓多糖复合物的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，茯苓多糖、羟基乙叉二膦酸、氯化锌和水合肼的质量比为1.0 : 1.0～3.0: 2.0～4.0: 0.002～0.006。
9.本发明的有益之处在于：本发明提供的茯苓多糖复合物的制备方法，采用的是一步原位微波水热反应法，该方法不仅反应原料来源广，操作过程简便易行，合成时间较短、温度较低，能耗小，可有效节约能源，绿色环保，具有开发和利用的潜力，便于工业化和技术推广，在实际应用过程中具有显著的优势，更重要的是，该方法可有效提高茯苓多糖复合物中的磷的含量和锌的含量，制得的茯苓多糖复合物可在食品添加剂、功能保健食品及药品等领域推广使用。
具体实施方式
10.以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
11.第一部分、测定样品中磷酸根含量和锌含量的方法1、测定样品中磷酸根含量的方法以过硫酸铵为氧化剂，将有机磷转化为无机磷，以钼钒酸盐为显色剂，采用钼蓝比色法测定磷酸根含量。
12.测定步骤具体如下：（1）将100ml浓硫酸慢慢地加到500ml水中，冷却至室温，得到硫酸溶液，将10g钼酸钠溶于400ml水中，得到钼酸钠溶液，将上述硫酸溶液加到钼酸钠溶液中，混匀，得到钼酸钠—硫酸溶液；（2）称取0.8g过硫酸铵和4.2g无水硫酸钠，混合均匀，得到过硫酸铵—硫酸钠分解剂；（3）称取适量样品于100ml锥形瓶中，先向锥形瓶中加入10ml蒸馏水，再向锥形瓶中加入1ml1m硫酸溶液及50mg过硫酸铵—硫酸钠分解剂，将锥形瓶放置在有石棉网的小电炉上均匀加热，直至溶液刚好干稠并刚冒浓厚白烟；（4）稍冷，向锥形瓶中先加入10ml水，再加入4～40mg亚硫酸钠粉末或10滴甲醇，之后在电炉上微沸30～60s取下，将溶液小心转移到50ml比色管中，并用少量水冲洗原锥形瓶几次，洗液并入比色管中，最终将比色管中的溶液控制在25ml左右；
（5）向比色管中加入4ml钼酸钠—硫酸溶液及1ml质量浓度为0.15%的硫酸肼溶液，放入已煮沸的水浴中10min后取出，流水冷却，用水稀释至刻度，立即用1cm比色皿，在580nm波长处，以试剂空白作对照测定吸光度，从标准曲线上查得相应磷酸根的含量。
13.磷酸根含量计算公式如下：ppo
43-= cpo
43-v/m
×
100%式中，ppo
43-为样品中磷酸根含量（%），cpo
43-为580nm处所测吸光度在标准曲线上查得相应的磷酸根浓度，v
样品
为样品稀释的体积，m
样品
为样品的质量。
14.2、测定样品中锌含量的方法使用edta滴定法测定样品中锌的含量。
15.测定步骤具体如下：（1）称取样品1.0g（精确到0.0002g）于250ml锥形瓶中，用滴管缓慢加入体积浓度为25%的乙酸溶液10ml，溶解后再加入50ml蒸馏水，将溶液煮沸5 min，除去co
2 ;（2）冷却后，用质量浓度为20%的六次甲基四胺溶液调节ph值至5~6，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液，滴加3滴二甲酚橙指示剂，用标准edta溶液进行滴定，溶液由紫红色变成亮黄色即为终点，同时做空白对照。
16.锌含量计算公式如下：pzn
2 = (c
edta
ꢀ´ꢀvedta
ꢀ´ꢀmzn
/m
样品
)
ꢀ´ꢀ
100%式中，pzn
2
为样品中锌含量（%），c
edta
为标准edta溶液的浓度，v
edta 为标准edta溶液的体积，m
zn
为锌的摩尔量，m
样品
为样品的质量。
17.第二部分、制备茯苓多糖复合物实施例1将茯苓多糖、羟基乙叉二膦酸、氯化锌、水合肼和水按照质量比1.0 : 2.5: 3.0: 0.005: 20.0混合，调节混合液ph值至6.5，将混合液转入封闭的聚四氟乙烯高压反应釜中，于1300c微波水热反应20min，离心取上清液，然后对上清液依次进行醇沉、离心、洗涤、干燥处理，得到茯苓多糖复合物i。
18.经第一部分记载的测定样品中磷酸根含量和锌含量的方法的检测，所制得的茯苓多糖复合物i中磷酸根含量为13.48%，锌含量为10.07%。
19.实施例2将茯苓多糖、羟基乙叉二膦酸、氯化锌、水合肼和水按照质量比1.0 : 1.5: 2.0: 0.002: 20.0混合，调节混合液的ph值至5.0，将混合液转入封闭的聚四氟乙烯高压反应釜中，于1100c微波水热反应10min，离心取上清液，然后对上清液依次进行醇沉、离心、洗涤、干燥处理，得到茯苓多糖复合物ii。
20.经第一部分记载的测定样品中磷酸根含量和锌含量的方法的检测，所制得的茯苓多糖复合物ii中磷酸根含量为7.03%，锌含量为6.14%。
21.实施例3将茯苓多糖、羟基乙叉二膦酸、氯化锌、水合肼和水按照质量比1.0 : 2.0: 3.0: 0.004: 20.0混合，调节混合液的ph值至8.0，将混合液转入封闭的聚四氟乙烯高压反应釜中，于1200c微波水热反应30min，离心取上清液，然后对上清液依次进行醇沉、离心、洗涤、干燥处理，得到茯苓多糖复合物iii。
22.经第一部分记载的测定样品中磷酸根含量和锌含量的方法的检测，所制得的茯苓多糖复合物iii中磷酸根含量为8.24%，锌含量为6.92%。
23.实施例4将茯苓多糖、羟基乙叉二膦酸、氯化锌、水合肼和水按照质量比1.0 : 2.5: 3.0: 0.004: 20.0混合，调节混合液的ph值至7.0，将混合液转入封闭的聚四氟乙烯高压反应釜中，于1400c微波水热反应30min，离心取上清液，然后对上清液依次进行醇沉、离心、洗涤、干燥处理，得到茯苓多糖复合物iv。
24.经第一部分记载的测定样品中磷酸根含量和锌含量的方法的检测，所制得的茯苓多糖复合物iv中磷酸根含量为12.17%，锌含量为8.94%。
25.实施例5对比实施例1，仅将微波水热改为回流加热，其它实验条件相同。
26.将茯苓多糖、羟基乙叉二膦酸、氯化锌、水合肼和水按照质量比1.0 : 2.5: 3.0: 0.005: 20.0混合，调节混合液ph值至6.5，回流加热反应20min，离心取上清液，然后对上清液依次进行醇沉、离心、洗涤、干燥处理，得到茯苓多糖复合物v。
27.经第一部分记载的测定样品中磷酸根含量和锌含量的方法的检测，所制得的茯苓多糖复合物v中磷酸根含量为6.37%，锌含量为4.26%，二者明显低于使用微波水热法所得的茯苓多糖复合物中的磷酸根的含量和锌的含量。
28.由上面5个实施例可知，本发明提供的茯苓多糖复合物的制备方法（一步原位微波水热反应法），可有效提高茯苓多糖复合物中的磷的含量和锌的含量。
29.综上，本发明通过对茯苓多糖进行一步法磷酸酰肼改性，增加了茯苓多糖的配位能力，实现了微波水热原位反应，有效提高了反应效率，使得制得的茯苓多糖复合物中的磷的含量和锌的含量都较高。
30.第三部分、比较茯苓多糖和茯苓多糖复合物的流动性和通透性磷酸酰肼功能基团的引入为茯苓多糖构筑了一个带负电荷的亲水性表面结构，从而可有效提高茯苓多糖的水溶性及活性，改性过的茯苓多糖将会在免疫调节等生物活性方面及开发新型材料方面表现出潜在的应用前景。茯苓多糖复合物中的多糖和磷酸酰肼功能基团通过氧、氮或氧氮组合与锌离子螯合配位，采用结构功能化修饰技术，可以将茯苓多糖转化为流动性和通透性更好的活性多糖，是茯苓多糖高效开发利用的关键。茯苓多糖复合物中的多糖和磷酸酰肼功能基团与锌离子结合后往往会提高茯苓多糖的生物活性，并且可以发挥更强的协同增效作用，增加肠黏膜通透性，进而提高多种营养物质的消化吸收，有望提高茯苓多糖的生物利用度，具有很好的开发应用前景。
31.1、流动性实验流动性实验主要是考察茯苓多糖和茯苓多糖复合物的流动性方面的差别。
32.用天平称取10.0 g茯苓多糖和10.0g实施例1制备得到的茯苓多糖复合物，分别置于两个烧杯中，向两个烧杯中各加入90 ml蒸馏水，配成茯苓多糖溶液和茯苓多糖复合物溶液，轻轻搅拌至完全溶解（注意：溶解时尽量不要产生气泡）。使用d=1.0 mm的常数毛细管粘度计分别测量茯苓多糖和茯苓多糖复合物在不同温度下的流动时间。
33.表1 茯苓多糖在不同温度下的流动时间温度第1次第2次第3次第4次平均时间
25℃112s110s111s112s111.25s30℃97s97s98s97s97.25s35℃84s85s85s83s84.25s40℃77s76s77s77s76.75s45℃67s66s66s67s66.50s表2 茯苓多糖复合物在不同温度下的流动时间温度第1次第2次第3次第4次平均时间25℃22s22s23s22s22.25s30℃18s19s18s19s18.50s35℃15s16s15s15s15.25s40℃13s13s13s12s12.75s45℃10s10s11s11s10.50s以上实验结果显示：茯苓多糖复合物的流动时间较茯苓多糖的流动时间减小明显，说明相比较而言，茯苓多糖复合物的流动性更好。
34.2、通透性实验精确称取100 mg茯苓多糖样品和100 mg茯苓多糖复合物样品，用蒸馏水分别溶解并定容到100 ml容量瓶中，震荡均匀，得到样品溶液。用移液管吸取5 ml样品溶液放入50 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，震荡均匀，得到稀释后的样品溶液，将稀释后的样品溶液转移至具塞锥形瓶中。剪取一定长度的md44透析袋，将其一端先用皮筋系紧，加入10 ml蒸馏水，然后系紧另一端，将系好的透析袋放入上述具塞锥形瓶中，在振荡器上100 r/min振荡30 min。取1 ml透析袋内液体放入10 ml具塞刻度试管中，加入1 ml 质量浓度为5% 的苯酚溶液，随后缓慢滴入 5 ml 浓硫酸，摇匀，以蒸馏水作空白对照，通过紫外
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可见光分光光度计在490 nm处测定吸光度值，根据标准曲线得多糖含量，由下列公式求算出通透率：通透率/%=（c
袋内
/c
总
）*100%式中，c
袋内
为多糖在透析袋内的含量（mg/ml），c
总
为多糖的总含量（mg/ml）。
35.结果显示：茯苓多糖复合物样品的通透率为68.12%，茯苓多糖样品的通透率为49.26%。
36.由通透性实验结果可知：茯苓多糖复合物的通透性较茯苓多糖的通透性更好。
37.需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。