一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及应用。


背景技术：

2.pet系列质粒，是一种常用的融合蛋白类型的原核高效表达载体，由t7启动子启动表达，转录和翻译调控系统能使目的蛋白高水平表达。pet系列质粒作为目前应用最广泛的重组蛋白表达载体，表达量在通常情况下可达到总蛋白量的50％，但一般pet系列质粒在宿主大肠杆菌bl21中有较好的表达，而在代谢菌中的表达效果较差，会存在较多的包涵体，导致不能获得较多的可溶性蛋白，严重影响蛋白的活性。因此，对pet系列质粒的改造是不可或缺的一部分。


技术实现要素：

3.针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及应用，本发明显著了提高目的基因的可溶性蛋白的表达量，有效地提高了代谢菌的酶转化效率。
4.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：本发明提供一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，该质粒的获取为：包括对pet系列质粒依次进行第一替换和第二替换；所述第一替换包括使用定点突变的方法将pet系列质粒上的启动子替换为拼合启动子，得重组质粒；所述第二替换包括将重组质粒的复制子替换为目标质粒的复制子，得高表达质粒；具体步骤如下：步骤一：以pet系列质粒为模板，以seq id no.6-10所示的任一种拼合启动子的基因序列为目标序列，采用定点突变的方法用目标序列替换pet系列质粒的原有启动子序列；步骤二：以步骤一所述具有拼合启动子的pet系列质粒作为模板，进行聚合酶链式反应得到第一目的基因片段，采用试剂盒对第一目的基因片段进行dna纯化，dna消化酶消化，dna连接酶环化，获得重组质粒；所述第二替换包括：以重组质粒为模板，通过反式聚合酶链式反应获得hg-02片段，以目标质粒的复制子为模板，所述目标质粒的复制子为高拷贝复制子，经过聚合酶链式反应得到第二目的基因片段；步骤四：把获得的hg-02片段和高拷贝片段通过in-fusion的方法进行连接，得到高表达质粒，所述高表达质粒的复制子碱基序列具体如seq id no.11-15所示。
5.本发明的另一目的是提供一种适用于大肠杆菌的高表达质粒的应用，通过转化法将重组质粒导入宿主大肠杆菌中，得到工程菌株shg-02，通过转化法将高表达质粒导入宿主大肠杆菌中，得到菌株shg-03。
6.优选的，所述大肠杆菌为代谢菌，本发明重组质粒和高表达质粒适用于所有代谢菌。
7.优选的，所述代谢菌是代谢菌bw25113，本发明重组质粒和高表达质粒在代谢菌
bw25113中效果最佳。
8.本发明的有益效果在于：1、本发明使用拼合启动子替换pet系列质粒的启动子，拼合启动子同样具有比较高的转录效率和受laci阻遏蛋白调控的强启动子特性；2、把原始质粒复制子替换为第二目的基因片段，本发明高表达质粒具有拷贝数高，普适性强的特点，在菌株传代的过程中能够达到高拷贝的效果；3、本发明显著了提高目的基因的可溶性蛋白的表达量，与普通pet系列载体相比提高了47%左右，有效地提高了代谢菌的酶转化效率。
附图说明
9.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
10.图1为本发明的所构建的重组质粒蛋白表达结果与未替换启动子的质粒蛋白表达结果的电泳对比图；“1”、“2”、“3”、“4”是未替换启动子的质粒蛋白表达结果；“5”、“6”、“7”、“8”是本发明所构建的重组质粒phg-02蛋白表达结果，“1”、“3”、“5”、“7”是上清蛋白的灰度值，“2”、“4”、“6”、“8”是沉淀蛋白的灰度值；图2为本发明的所构建的高表达质粒蛋白表达结果与未替换启动子和复制子的质粒蛋白表达结果的电泳对比图；“1”、“2”是未替换启动子和复制子质粒的蛋白表达结果；“3”、“4”是本发明的所构建的高表达质粒phg-03的蛋白表达结果的电泳图。
具体实施方式
11.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
12.实施例1：本实施例使用的pet系列质粒和拼合启动子均为市售产品，以pet系列质粒为模板，以arog为工具基因，arog基因来源于escherichia coli str. k-12，其碱基序列具体如seq id no.16所示，将基因arog扩增、连接至质粒模板，作为起始质粒；根据现有技术构建重组质粒，获得的重组质粒记为phg-02，高表达质粒，获得的高表达质粒记为phg-03，具体包括以下步骤：1）以pet系列质粒为模板，本实施例选取pet20b (seq id no.1)质粒为模板，在pet20b的启动子上下游各选取15-20bp，采用定点突变的方法将pet20b质粒上的启动子替换为seq id no.6-10所示的任一种序列的拼合启动子，本实施例选取trc (seq id no.7)启动子，trc启动子的基因序列为：ttgacaattaatcatccggctcgtataatg；2）以步骤1）中具有拼合启动子的pet20b质粒作为模板，根据引物序列进行聚合酶链式反应得到高浓度的第一目的基因片段，采用试剂盒，将高浓度第一目的基因片段进行dna纯化，dna消化酶消化，dna连接酶环化，获得目的重组质粒phg-02，浓度为102.67ng/ul，
再通过转化法导入宿主菌大肠杆菌代谢菌bw25113中，得到菌株shg-02；引物序列为：f端引物是：cattatacgagggatgattaattgtcaaatttcgcgggatcgagatctcgatcctct；r端引物是：atgtgtaaggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaa；3）活化保藏有工程菌株shg-02的甘油种于5ml 含50ug/ml 卡那霉素的lb 培养基之中，于30 ℃，225rpm 摇床中过夜培养12-18 小时，即得工程菌株shg-02的种子培养液；用移液枪吸取1ml 上述得到的工程菌株shg-02的种子培养液加入到250ml 含50ug/ml 氨苄青霉素的lb培养基之中，于30℃，225rpm 的摇床中扩大培养；用分光光度计于600nm 波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm 波长下吸光度达到0.6时，使用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导工程菌株shg-02表达蛋白酶，终浓度为200mm，然后，将发酵液置于30℃的摇床之中连续培养12 个小时，培养之后定点取样，固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1% ；酵母提取物 0.5% ；nacl 1% ；琼脂2% ；ph 5.5-6.5 ；高压蒸汽灭菌后添加氨苄霉素50ug/ml。
13.4）取出菌液，转移至50ml离心管中，4℃，8000rpm，离心5min收集菌种，弃上清液，加入10ml缓冲液，用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，整个破碎过程保持在冰上进行，必要时可重复破碎，将破碎好的细胞高速离心20min，4℃，10000rpm，取上清蛋白转移至新的50ml离心管中。取样20μl上清蛋白和沉淀蛋白。
14.5）将上清蛋白和沉淀蛋白进行热变性，采用sds-page检测目的蛋白的表达，并计算蛋白灰度值。sds-page检测结果如图1所示，蛋白灰度值结果如表2所示。
15.实施例2：6）在实施例1的基础上，以步骤2）中的重组质粒phg-02为模板，通过反式聚合酶链式反应获得hg-03片段，引物序列为：f端引物是：gaagatcctttgatctttr端引物是：aacgccagcaacgcggcc以目标质粒为的复制子为模板，其中，目标质粒的复制子为高拷贝复制子，目标质粒的复制子的在大肠杆菌内的拷贝数如表1所示，本实施例选取prsf-duet为目标质粒，使用rsf ori (seq id no.13)复制子，以arog为工具基因，在复制子片段的上下游选取15-20bp，作为上下游引物，通过聚合酶链式反应得到第二目的基因片段；7）把获得hg-03片段和第二目的基因片段通过in-fusion的方法进行连接，得到高表达质粒phg-03，浓度为541.96ng/ul，通过转化法导入宿主大肠杆菌代谢菌bw25113中，得到菌株shg-03。
16.8）活化保藏有工程菌株shg-03的甘油种于5ml 含50ug/ml 氨苄霉素的lb 培养基之中，于30 ℃，2250rpm 摇床中过夜培养12-18 小时，即得工程菌株shg-03的种子培养液；用移液枪吸取1ml 上述得到的工程菌株shg-03的种子培养液加入到250ml 含50ug/ml 氨苄青霉素的lb培养基之中，于30℃，225rpm 的摇床中扩大培养；用分光光度计于600nm 波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm 波长下吸光度达到0.6时，使用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导工程菌株shg-03表达蛋白酶，终浓度为200mm，然后，将发酵液置于30℃的摇床之中连续培养12 个小时，培养之后定点取样，固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1% ；酵母提取物 0.5% ；nacl 1% ；琼脂2% ；
ph 5.5-6.5 ；高压蒸汽灭菌后添加卡那霉素50ug/ml 。
17.9）取出菌液，转移至50ml离心管中，4℃，8000rpm，离心5min收集菌种，弃上清，加入10ml缓冲液，用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，整个破碎过程保持在冰上进行，必要时可重复破碎，将破碎好的细胞高速离心20min，4℃，10000rpm，取上清蛋白转移至新的50ml离心管中。取样20μl上清蛋白和沉淀蛋白。
18.10）将上清蛋白和沉淀蛋白变性，采用sds-page检测目的蛋白的表达，并计算蛋白灰度值，检测结果如图2所示，蛋白灰度值结果如表4所示。
19.实施例3：本实施例与实施例1操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例选取pet20b (seq id no.1)质粒作为模板，tac（seq id no.6）启动子，蛋白灰度值结果如表6所示。
20.实施例4：本实施例与实施例1操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例选取pet23a_rbpms_fl（seq id no.2）质粒作为模板，pbad（seq id no.8）启动子，所用大肠杆菌代谢菌为w3110，蛋白灰度值结果如表6所示。
21.实施例5：本实施例与实施例1操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例选取pet16b.pfu（seq id no.3）质粒作为模板，rhapbad（seq id no.9）启动子，蛋白灰度值结果如表6所示。
22.实施例6：本实施例与实施例1操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例选取pet28a（seq id no.4）质粒作为模板，pl/pr（seq id no.10）启动子，所用大肠杆菌代谢菌为mg1655，蛋白灰度值结果如表6所示。
23.实施例7：本实施例与实施例2操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例以实施例3中的重组质粒为模板，选取pbr322（seq id no.11）复制子，质粒浓度和蛋白灰度值结果如表7所示。
24.实施例8：本实施例与实施例2操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例以实施例4中的重组质粒为模板，选取pmb1（seq id no.12）复制子，所用大肠杆菌代谢菌为w3110，质粒浓度和蛋白灰度值结果如表7所示。
25.实施例9：本实施例与实施例2操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例以实施例5中的重组质粒为模板，选取pmb1*（seq id no.14）复制子，质粒浓度和蛋白灰度值结果如表7所示。
26.实施例10：本实施例与实施例2操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例以实施例6中的重组质粒为模板，选取cole（seq id no.15）复制子，所用大肠杆菌代谢菌为mg1655，质粒浓度和蛋白灰度值结果如表7所示。
27.表1 目标质粒的复制子在大肠杆菌内的拷贝数载体petpucprsf-duetpucpbluescript
序列表序号1112131415复制子pbr322pmb1rsforipmb1*cole拷贝数30-40120300-500500-700300-500表2 替换启动子的质粒蛋白表达量的灰度值序号12345678灰度值93153891330940296024328952125578228952此表对应图1，数据标记：1：空白对照;3：空白对照;5: shg-02/phg-02;7：shg-02/ phg-02;“1”、“3”、“5”、“7”是上清蛋白的灰度值，“2”、“4”、“6”、“8”是沉淀蛋白的灰度值。
28.表3 替换启动子后的质粒表达蛋白中可溶蛋白量占比序号57占比（%）97.07�.59%根据表2中的数据计算的可溶度，可溶度（%）为重组蛋白上清中的表达量占（上清表达量 沉淀中的表达量）的百分比。
29.表4 替换复制子的质粒蛋白表达量的灰度值 1234灰度值1328315672895304928597此表对应图2，数据标记：1：空白对照；2：空白对照；3: shg-03/phg-03；4: shg-03/ phg-03表5 替换复制子前后的质粒浓度序号123phg-02质粒(替换前质粒)浓度(ng/ul)102.67105.7899.68phg-03(替换后质粒)浓度(ng/ul)541.96549.84539.38表6 不同重组质粒表达的蛋白上清蛋白灰度值
序号载体质粒拼合启动子代谢菌空白对照上清蛋白灰度值重组质粒上清蛋白灰度值实施例3seqidno.1seqidno.6(tac)bw251139469935836实施例4seqidno.2seqidno.8(pbad)w31108436894768实施例5seqidno.3seqidno.9(rhapbad)bw251139036953299实施例6seqidno.4seqidno.10(pl/pr)mg16559261906543
此表使用的空白对照为未替换启动子的pet系列质粒表7 不同高表达质粒替换复制子前后的上清蛋白表达量和质粒浓度
序号重组质粒来源目标质粒复制子代谢菌高表达质粒上清蛋白表达量替换复制子前质粒浓度(ng/ul)替换复制子后质粒浓度(ng/ul)实施例7实施例3seqidno.11bw251131023416126.27526.94实施例8实施例4seqidno.12w31101056935114.65534.92实施例9实施例5seqidno.14bw251131046894108.64535.68实施例10实施例6seqidno.15mg16551063548112.58542.67
从表2和4中结果可以看出，针对重组质粒和高表达质粒，其蛋白表达量均显著提高，本发明的重组质粒和高表达质粒在宿主代谢菌中均有较好的表达，由表3结果可以看出，本发明显著了提高目的基因的可溶性蛋白的表达量，与普通pet系列载体相比提高了47%左右，有效地提高了代谢菌的酶转化效率，由表5的结果可以看出，复制子替换后，高表达质粒浓度明显提高，表明本发明的高表达质粒在菌株传代的过程中能够达到高拷贝的效果；由表6和表7的结果可知，重组质粒和高表达质粒均适用于不用种类的代谢菌，重组质粒在不同的代谢菌中可溶性蛋白表达量高，高表达质粒在不用的代谢菌株传代的过程中能够
达到高拷贝的效果。
30.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。