一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法
技术领域
1.本发明属于兽医和microrna药物精准治疗技术领域，涉及一种治疗羊传染性脓包病的microrna，还涉及一种治疗羊传染性脓包病microrna的制备方法，可用于精确靶向治疗羊传染性脓包病。
背景技术：
2.羊传染性脓包病俗称“羊口疮”，是一种由传染性脓包病毒引起的急性、接触性传染病，对绵羊和山羊的影响较大。随着畜牧业的快速发展，羊养殖规模不断扩大，有些地区由于养殖户科学知识和养殖技术的缺乏，导致该病暴发，造成严重的经济损失。据报道，2016年新疆阿尔泰地区福海县某养羊场个别羊只出现红斑、水泡和脓疱等症状，经诊断为羊传染性脓包病，应引起该地区养羊户的高度重视。
3.羊传染性脓包病是由羊口疮病毒(orfv)引起的传染病。羊口疮病毒为双链dna病毒，属痘病毒科，电镜下为椭圆形，大小260～300nm
×
160～190nm，呈线团样结构。该病毒世界范围广泛分布，主要感染山羊和绵羊，也能引起人发病。羊口疮病毒对外界环境有较强抵抗力，散播在地面的病毒，经过秋冬至来春仍有传染性，对热和甲醛较敏感，60℃左右持续5min，病毒会失去活性。
4.在本病疫区，该病主要由于接触感染动物而传染，常常因购进病羊或携带病毒的羊而将该病传入健康羊群。羊圈消毒不严格也是诱发该病的重要原因之一。该病可在一年中任何时间传播，尤其是放牧季节。由于干燥季节饲草干硬，羊皮肤容易擦伤导致感染该病病毒，具有传染性。康复后的羊只在2～3年内有极强的免疫力，然而不会经过初乳传给小羊。
5.该病潜伏期一般为2～7d，长的可达10d以上。该病发病主要在唇及眼、耳内侧、趾、生殖器、乳房等羊体上没有毛发部位发生红斑、丘疹、水疱、脓疱等，随后形成黑褐色疣厚痂，痂皮脱落遗留红斑而逐渐康复。严重病例，导致羊口唇龟裂，影响羊的采食、哺乳，导致羊体日趋消瘦，最后衰竭而死，病程为10～25d。若发生二次感染，致死率为20～60％。
6.该病的发展经过典型的痘期，水疱期脓疱呈扁平状，具有棕灰色厚痂，可高出皮肤2～4mm，这是脓疱大体病变的最重要特征。依据继发感染程度，脓疱大约在第4周可完全消退，有时因上皮不断增生而形成乳头状瘤样生长物。
7.本病可依据临床症状和病理变化进行诊断，诊断方式比较简单，根据羊口角周围的增生原痂即可作出诊断，但要注意与羊痘和溃疡性皮炎的区别。羊传染性脓疱病是发生于没有毛发部位，脓疱扁平；羊痘是全身性痘疹，结节较圆，没有水疱和脓疱病变，也无疣状增生，主要为组织坏死；而羊溃疡性皮炎主要感染1岁以上成年羊，病变特点是黏膜溃疡和组织破坏，痂垢下没有桑葚样的肉芽组织增生。
8.该病的预防措施主要有以下5点：(1)本病由于主要通过受伤的皮肤进行传染，平时对饲料、垫草的芒刺及其尖锐物体尽量拣出，避免羊只皮肤发生损伤，并经常给羊喂盐，减少羔、幼羊啃土啃墙损伤口腔黏膜。(2)禁止从疫区引进羊只及其产品，对引进的羊只应
选自健康羊群，引入后要隔离观察半月以上，并经多次检查，确认无病后方可混群饲养。(3)在该病流行地区进行免疫接种。取患病羊口唇部痂皮0.1g研磨成末，加入50％甘油和100ml生理盐水，再加入适量青霉素制成接种苗。在羊尾根部光滑无毛处用针头刮损表皮，涂上接种苗，1～2d后接种部位有轻度炎症，继而部分变水疱和脓疱，4～5d后部分脓疱开始结痂，1周后即可复原，免疫期一般为1年。(4)羊舍、工具及周围环境，定期采用20％火碱溶液、10％石灰乳、20％垫草灰水或百毒杀进行消毒。(5)若发现病羊应立即将其与健康羊隔离，并对全群羊只进行排查，避免病菌的传播。同时，整个养殖场进行清扫和彻底消毒，被污染的饲料、垫草及脱落的痂皮要及时收集并进行彻底焚烧，对病死羊进行无害化深埋处理。
9.在该病的治疗及预防方面，首先要及时将病羊与健康羊隔离，口唇和阴部病变用0.1％的高锰酸钾溶液或2％明矾溶液冲洗创面，然后涂上2％龙胆紫、碘甘油、冰硼散或华素片等药物，每日2～3次。趾、腕和关节病变用1～2％煤酚涂擦，早晚各1次。然后，将10mg维生素b2、5mg强的松和100mg磺胺嘧啶，研磨成末涂于患处，每日早晚各1次；最后，内服病毒灵片剂，每日早晚各1次，羔羊每次100mg，幼羊每次150～250mg，连用5d。此外临床表明，给病羊肌肉注射黄芪多糖注射液可缩短病程，促进病羊的康复。治疗剂量为每只羔羊5～10ml，每日两次，连用3～5d，幼羊10～15ml，每日2次，连用3～5d。
10.对病情严重的羊只，采用160万～480万单位的青霉素钠、50万～100万单位的链霉素、5～10ml鱼腥草和2～5mg地塞米松磷酸钠，肌肉注射，每日两次。也可采用5～10ml银黄热毒清注射液和抗病毒注射液5～10ml混合肌肉注射,每日两次，连用2～3d。如果病羊体质极度虚弱，不能进食，应采取输液的方法，对其补充能量，增强体质。
11.和现有技术相比，本发明一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法，方法简单，microrna制备过程无污染，无需复杂设备，能耗低；microrna稳定性高，使用方便，可在细胞系中无限扩增，通过肌肉注射分散均匀，高效吸收，高效利用，通过靶向精准的基因疗法，对于保证规模养殖集群动物疾病治疗和健康具有十分重要的作用。既可当对患病个体进行治疗，又可在对患病种群进行治疗，缩短病程的作用，尤其适合规模化养殖场使用。在本品中通过哦精准靶向基因治疗，相对传统工艺来讲工艺简单、稳定，实验室制备条件温和，绿色环保。
技术实现要素：
12.本发明的目的解决上述技术问题，针对羊传染性脓包病病毒基因专门设计，提供一种靶向性的、个性化的一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法，用于药物或者抗原的体内羊传染性脓包病病毒，有效针对性的对羊传染性脓包病进行治疗，提高免疫力，也可以提高免疫耐受。
13.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法，其特征在于，该microrna由以下步骤制备而来：(1)将hepg2.2.10细胞培养于含10％胎牛血清的f12培养基中(2)trizol提取细胞总rna，逆转录成cdna(3)收集培养基上清液，elisa试剂盒检测细胞hbsag、hbeag水平(4)采用细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法法测蛋白浓度(5)对基因hs3st3b1及载体pmi rrbreporttm双荧光素酶报告基因进行序列分析，利用nhei、ncoi两个限制性内切酶将目的基因片段克隆到载体中(6)将hs3st3b1基因的序列克隆至hrluc基因下游作为hrluc的3’utr，制备成
hs3st3b13’utr双报告基因野生型载体质粒，即得一种治疗羊传染性脓包病的microrna。
14.所述步骤(1)hepg2.2.10细胞是由hepg2细胞以头尾相连的方式转染hbv二倍体得到。
15.所述步骤(1)hepg2.2.10细胞培养基中另外加入阿奇霉素。
16.所述步骤(2)逆转录引物序列为：
17.上游：5’tgatctaccggcctttcaacctcatga 3’18.下游：5’cgatcagcgttcctacgaggtacagac 3’19.所述步骤(2)逆转录反应条件：90℃预变性5min，90℃变性30s，55℃退火40s，循环30次。
20.所述步骤(4)中测蛋白浓度具体为：每孔蛋白上样量为40μg，15％sds page电泳，电转至pvdf膜，10％脱脂牛奶封闭1h，分别加入小鼠抗人hbcag(1:20000)、羊抗hs3st3b1多抗(1:1000)和鼠抗gapdh单抗(1:2000)，4℃过夜，tbst洗膜，再分别加入马抗小鼠igg抗体(1:50000)、兔抗羊igg(1:20000)及羊抗鼠iggi(1:20000)，tbst洗膜后ecl试剂盒化学发光，凝胶成像系统显影。
21.所述步骤(5)所用载体的报告荧光素酶基因为海肾荧光素酶，校正荧光素酶基因为海肾荧光素酶做内参校正。
22.所述步骤(6)hs3st3b13’utr双报告基因突变型载体质粒在野生型载体基础上将hs3st3b1基因中序列gattctc突变actagag
23.该治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法，在治疗羊传染性脓包病中应用，通过肌肉注射的方式注射进患畜体内，具有很好的治疗羊传染性脓包病的效果。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
25.实施例1
26.一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法
27.通过以下方法制备：
28.(1)将hepg2.2.10细胞培养于含10％胎牛血清的f12培养基中。
29.(2)trizol提取细胞总rna，逆转录成cdna。
30.(3)收集培养基上清液，elisa试剂盒检测细胞hbsag、hbeag水平。
31.(4)采用细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法法测蛋白浓度。
32.(5)对基因hs3st3b1及载体pmi rrbreporttm双荧光素酶报告基因进行序列分析，利用nhei、ncoi两个限制性内切酶将目的基因片段克隆到载体中。
33.(6)将hs3st3b1基因的序列克隆至hrluc基因下游作为hrluc的3’utr，制备成hs3st3b13’utr双报告基因野生型载体质粒，即得一种治疗羊传染性脓包病的microrna。
34.实施例2治疗效果实验
35.在山东省青岛市莱西市日庄镇胡家沟村的莱西市吕庆先山羊养殖厂的养殖12月
龄的山羊中，从中挑选确诊后的患有羊传染性脓包病的100头山羊作为治疗对象，将随机挑选的100头患有羊传染性脓包病的山羊羊分为4组(实施例1组、实施例2组、实施例3组和对照组)，每组25头，其中实施例1～3组分别使用本发明实施例1～3所得microrna进行肌肉注射治疗，早晚期间在山羊后腿外侧肌肉注射制备的microrna，每天两次；对照组相同位置相同时间注射生理盐水。观察记录各组羊的治愈率和治愈时间，结果如表1所示
36.疗效判定标准：
37.痊愈：患羊经过1周的治疗后，其脓包病症状消失，能够正常进食，体温恢复正常。
38.有效：患羊的脓包病症状基本消失，进食量与治疗前比较增加，体温恢复正常。
39.无效：患羊经过1周的治疗后，其脓包病症状仍存在，且体温较高，进食量无增加。
40.表1治疗效果统计
41.分组实施例1实施例2实施例3对照组痊愈2223217有效3245无效01013痊愈天数3236
42.从表1的数据可知：本发明的治疗羊传染性脓包病的microrna对山羊传染性脓包病治疗效果明显优于对照组，同时治疗实验明显短于对照组，说明本发明治疗羊传染性脓包病的microrna药物的长效和吸收上具有明显效果。
43.实施例3治疗效果实验
44.在青岛市即墨区移风店镇七级社区东北村的即墨区四季春奶山羊养殖场随机选取刚患有传染性脓包病的奶山羊400头，将挑选的100头奶山羊分为4组(实施例1组、实施例2组、实施例3组和对照组)，每组100头，其中实施例1组分别使用本发明实施例1所得microrna进行防治，每天早晚期间在山羊后腿外侧肌肉注射制备的microrna，每天两次；实施例2组在患羊口唇和阴部病变用0.1％的高锰酸钾溶液或2％明矾溶液冲洗创面，然后涂上2％龙胆紫、碘甘油、冰硼散或华素片等药物，每日2～3次。趾、腕和关节病变用1～2％煤酚涂擦，早晚各1次。然后，将10mg维生素b2、5mg强的松和100mg磺胺嘧啶，研磨成末涂于患处，每日早晚各1次；最后，内服病毒灵片剂，每日早晚各1次，羔羊每次100mg，幼羊每次150～250mg，连用5d。实施例3组采用160万～480万单位的青霉素钠、50万～100万单位的链霉素、5～10ml鱼腥草和2～5mg地塞米松磷酸钠，肌肉注射，每日两次。对照组不使用任何药物，10天后，对实施例组1、实施例组2、实施例组3和对照组的观察记录各组羊的发病率，结果如表2所示。
45.表2预防效果统计数据
46.分组实施例1实施例2实施例3对照组总数100100100100治愈数95637213发病率5％37％28％87％治愈率95％63％72％13％
47.从表2的数据可知：本发明的治疗羊传染性脓包病的microrna对羊传染性脓包病有明显的治疗效果。
技术领域
1.本发明属于兽医和microrna药物精准治疗技术领域，涉及一种治疗羊传染性脓包病的microrna，还涉及一种治疗羊传染性脓包病microrna的制备方法，可用于精确靶向治疗羊传染性脓包病。
背景技术：
2.羊传染性脓包病俗称“羊口疮”，是一种由传染性脓包病毒引起的急性、接触性传染病，对绵羊和山羊的影响较大。随着畜牧业的快速发展，羊养殖规模不断扩大，有些地区由于养殖户科学知识和养殖技术的缺乏，导致该病暴发，造成严重的经济损失。据报道，2016年新疆阿尔泰地区福海县某养羊场个别羊只出现红斑、水泡和脓疱等症状，经诊断为羊传染性脓包病，应引起该地区养羊户的高度重视。
3.羊传染性脓包病是由羊口疮病毒(orfv)引起的传染病。羊口疮病毒为双链dna病毒，属痘病毒科，电镜下为椭圆形，大小260～300nm
×
160～190nm，呈线团样结构。该病毒世界范围广泛分布，主要感染山羊和绵羊，也能引起人发病。羊口疮病毒对外界环境有较强抵抗力，散播在地面的病毒，经过秋冬至来春仍有传染性，对热和甲醛较敏感，60℃左右持续5min，病毒会失去活性。
4.在本病疫区，该病主要由于接触感染动物而传染，常常因购进病羊或携带病毒的羊而将该病传入健康羊群。羊圈消毒不严格也是诱发该病的重要原因之一。该病可在一年中任何时间传播，尤其是放牧季节。由于干燥季节饲草干硬，羊皮肤容易擦伤导致感染该病病毒，具有传染性。康复后的羊只在2～3年内有极强的免疫力，然而不会经过初乳传给小羊。
5.该病潜伏期一般为2～7d，长的可达10d以上。该病发病主要在唇及眼、耳内侧、趾、生殖器、乳房等羊体上没有毛发部位发生红斑、丘疹、水疱、脓疱等，随后形成黑褐色疣厚痂，痂皮脱落遗留红斑而逐渐康复。严重病例，导致羊口唇龟裂，影响羊的采食、哺乳，导致羊体日趋消瘦，最后衰竭而死，病程为10～25d。若发生二次感染，致死率为20～60％。
6.该病的发展经过典型的痘期，水疱期脓疱呈扁平状，具有棕灰色厚痂，可高出皮肤2～4mm，这是脓疱大体病变的最重要特征。依据继发感染程度，脓疱大约在第4周可完全消退，有时因上皮不断增生而形成乳头状瘤样生长物。
7.本病可依据临床症状和病理变化进行诊断，诊断方式比较简单，根据羊口角周围的增生原痂即可作出诊断，但要注意与羊痘和溃疡性皮炎的区别。羊传染性脓疱病是发生于没有毛发部位，脓疱扁平；羊痘是全身性痘疹，结节较圆，没有水疱和脓疱病变，也无疣状增生，主要为组织坏死；而羊溃疡性皮炎主要感染1岁以上成年羊，病变特点是黏膜溃疡和组织破坏，痂垢下没有桑葚样的肉芽组织增生。
8.该病的预防措施主要有以下5点：(1)本病由于主要通过受伤的皮肤进行传染，平时对饲料、垫草的芒刺及其尖锐物体尽量拣出，避免羊只皮肤发生损伤，并经常给羊喂盐，减少羔、幼羊啃土啃墙损伤口腔黏膜。(2)禁止从疫区引进羊只及其产品，对引进的羊只应
选自健康羊群，引入后要隔离观察半月以上，并经多次检查，确认无病后方可混群饲养。(3)在该病流行地区进行免疫接种。取患病羊口唇部痂皮0.1g研磨成末，加入50％甘油和100ml生理盐水，再加入适量青霉素制成接种苗。在羊尾根部光滑无毛处用针头刮损表皮，涂上接种苗，1～2d后接种部位有轻度炎症，继而部分变水疱和脓疱，4～5d后部分脓疱开始结痂，1周后即可复原，免疫期一般为1年。(4)羊舍、工具及周围环境，定期采用20％火碱溶液、10％石灰乳、20％垫草灰水或百毒杀进行消毒。(5)若发现病羊应立即将其与健康羊隔离，并对全群羊只进行排查，避免病菌的传播。同时，整个养殖场进行清扫和彻底消毒，被污染的饲料、垫草及脱落的痂皮要及时收集并进行彻底焚烧，对病死羊进行无害化深埋处理。
9.在该病的治疗及预防方面，首先要及时将病羊与健康羊隔离，口唇和阴部病变用0.1％的高锰酸钾溶液或2％明矾溶液冲洗创面，然后涂上2％龙胆紫、碘甘油、冰硼散或华素片等药物，每日2～3次。趾、腕和关节病变用1～2％煤酚涂擦，早晚各1次。然后，将10mg维生素b2、5mg强的松和100mg磺胺嘧啶，研磨成末涂于患处，每日早晚各1次；最后，内服病毒灵片剂，每日早晚各1次，羔羊每次100mg，幼羊每次150～250mg，连用5d。此外临床表明，给病羊肌肉注射黄芪多糖注射液可缩短病程，促进病羊的康复。治疗剂量为每只羔羊5～10ml，每日两次，连用3～5d，幼羊10～15ml，每日2次，连用3～5d。
10.对病情严重的羊只，采用160万～480万单位的青霉素钠、50万～100万单位的链霉素、5～10ml鱼腥草和2～5mg地塞米松磷酸钠，肌肉注射，每日两次。也可采用5～10ml银黄热毒清注射液和抗病毒注射液5～10ml混合肌肉注射,每日两次，连用2～3d。如果病羊体质极度虚弱，不能进食，应采取输液的方法，对其补充能量，增强体质。
11.和现有技术相比，本发明一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法，方法简单，microrna制备过程无污染，无需复杂设备，能耗低；microrna稳定性高，使用方便，可在细胞系中无限扩增，通过肌肉注射分散均匀，高效吸收，高效利用，通过靶向精准的基因疗法，对于保证规模养殖集群动物疾病治疗和健康具有十分重要的作用。既可当对患病个体进行治疗，又可在对患病种群进行治疗，缩短病程的作用，尤其适合规模化养殖场使用。在本品中通过哦精准靶向基因治疗，相对传统工艺来讲工艺简单、稳定，实验室制备条件温和，绿色环保。
技术实现要素：
12.本发明的目的解决上述技术问题，针对羊传染性脓包病病毒基因专门设计，提供一种靶向性的、个性化的一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法，用于药物或者抗原的体内羊传染性脓包病病毒，有效针对性的对羊传染性脓包病进行治疗，提高免疫力，也可以提高免疫耐受。
13.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法，其特征在于，该microrna由以下步骤制备而来：(1)将hepg2.2.10细胞培养于含10％胎牛血清的f12培养基中(2)trizol提取细胞总rna，逆转录成cdna(3)收集培养基上清液，elisa试剂盒检测细胞hbsag、hbeag水平(4)采用细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法法测蛋白浓度(5)对基因hs3st3b1及载体pmi rrbreporttm双荧光素酶报告基因进行序列分析，利用nhei、ncoi两个限制性内切酶将目的基因片段克隆到载体中(6)将hs3st3b1基因的序列克隆至hrluc基因下游作为hrluc的3’utr，制备成
hs3st3b13’utr双报告基因野生型载体质粒，即得一种治疗羊传染性脓包病的microrna。
14.所述步骤(1)hepg2.2.10细胞是由hepg2细胞以头尾相连的方式转染hbv二倍体得到。
15.所述步骤(1)hepg2.2.10细胞培养基中另外加入阿奇霉素。
16.所述步骤(2)逆转录引物序列为：
17.上游：5’tgatctaccggcctttcaacctcatga 3’18.下游：5’cgatcagcgttcctacgaggtacagac 3’19.所述步骤(2)逆转录反应条件：90℃预变性5min，90℃变性30s，55℃退火40s，循环30次。
20.所述步骤(4)中测蛋白浓度具体为：每孔蛋白上样量为40μg，15％sds page电泳，电转至pvdf膜，10％脱脂牛奶封闭1h，分别加入小鼠抗人hbcag(1:20000)、羊抗hs3st3b1多抗(1:1000)和鼠抗gapdh单抗(1:2000)，4℃过夜，tbst洗膜，再分别加入马抗小鼠igg抗体(1:50000)、兔抗羊igg(1:20000)及羊抗鼠iggi(1:20000)，tbst洗膜后ecl试剂盒化学发光，凝胶成像系统显影。
21.所述步骤(5)所用载体的报告荧光素酶基因为海肾荧光素酶，校正荧光素酶基因为海肾荧光素酶做内参校正。
22.所述步骤(6)hs3st3b13’utr双报告基因突变型载体质粒在野生型载体基础上将hs3st3b1基因中序列gattctc突变actagag
23.该治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法，在治疗羊传染性脓包病中应用，通过肌肉注射的方式注射进患畜体内，具有很好的治疗羊传染性脓包病的效果。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
25.实施例1
26.一种治疗羊传染性脓包病的microrna及其制备方法
27.通过以下方法制备：
28.(1)将hepg2.2.10细胞培养于含10％胎牛血清的f12培养基中。
29.(2)trizol提取细胞总rna，逆转录成cdna。
30.(3)收集培养基上清液，elisa试剂盒检测细胞hbsag、hbeag水平。
31.(4)采用细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法法测蛋白浓度。
32.(5)对基因hs3st3b1及载体pmi rrbreporttm双荧光素酶报告基因进行序列分析，利用nhei、ncoi两个限制性内切酶将目的基因片段克隆到载体中。
33.(6)将hs3st3b1基因的序列克隆至hrluc基因下游作为hrluc的3’utr，制备成hs3st3b13’utr双报告基因野生型载体质粒，即得一种治疗羊传染性脓包病的microrna。
34.实施例2治疗效果实验
35.在山东省青岛市莱西市日庄镇胡家沟村的莱西市吕庆先山羊养殖厂的养殖12月
龄的山羊中，从中挑选确诊后的患有羊传染性脓包病的100头山羊作为治疗对象，将随机挑选的100头患有羊传染性脓包病的山羊羊分为4组(实施例1组、实施例2组、实施例3组和对照组)，每组25头，其中实施例1～3组分别使用本发明实施例1～3所得microrna进行肌肉注射治疗，早晚期间在山羊后腿外侧肌肉注射制备的microrna，每天两次；对照组相同位置相同时间注射生理盐水。观察记录各组羊的治愈率和治愈时间，结果如表1所示
36.疗效判定标准：
37.痊愈：患羊经过1周的治疗后，其脓包病症状消失，能够正常进食，体温恢复正常。
38.有效：患羊的脓包病症状基本消失，进食量与治疗前比较增加，体温恢复正常。
39.无效：患羊经过1周的治疗后，其脓包病症状仍存在，且体温较高，进食量无增加。
40.表1治疗效果统计
41.分组实施例1实施例2实施例3对照组痊愈2223217有效3245无效01013痊愈天数3236
42.从表1的数据可知：本发明的治疗羊传染性脓包病的microrna对山羊传染性脓包病治疗效果明显优于对照组，同时治疗实验明显短于对照组，说明本发明治疗羊传染性脓包病的microrna药物的长效和吸收上具有明显效果。
43.实施例3治疗效果实验
44.在青岛市即墨区移风店镇七级社区东北村的即墨区四季春奶山羊养殖场随机选取刚患有传染性脓包病的奶山羊400头，将挑选的100头奶山羊分为4组(实施例1组、实施例2组、实施例3组和对照组)，每组100头，其中实施例1组分别使用本发明实施例1所得microrna进行防治，每天早晚期间在山羊后腿外侧肌肉注射制备的microrna，每天两次；实施例2组在患羊口唇和阴部病变用0.1％的高锰酸钾溶液或2％明矾溶液冲洗创面，然后涂上2％龙胆紫、碘甘油、冰硼散或华素片等药物，每日2～3次。趾、腕和关节病变用1～2％煤酚涂擦，早晚各1次。然后，将10mg维生素b2、5mg强的松和100mg磺胺嘧啶，研磨成末涂于患处，每日早晚各1次；最后，内服病毒灵片剂，每日早晚各1次，羔羊每次100mg，幼羊每次150～250mg，连用5d。实施例3组采用160万～480万单位的青霉素钠、50万～100万单位的链霉素、5～10ml鱼腥草和2～5mg地塞米松磷酸钠，肌肉注射，每日两次。对照组不使用任何药物，10天后，对实施例组1、实施例组2、实施例组3和对照组的观察记录各组羊的发病率，结果如表2所示。
45.表2预防效果统计数据
46.分组实施例1实施例2实施例3对照组总数100100100100治愈数95637213发病率5％37％28％87％治愈率95％63％72％13％
47.从表2的数据可知：本发明的治疗羊传染性脓包病的microrna对羊传染性脓包病有明显的治疗效果。
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