新型肽核酸低聚物、其的脱氧核糖核酸甲基化检测用途及利用脱氧核糖核酸甲基化检测方法与流程

1.本发明涉及肽核酸低聚物，并涉及利用新型肽核酸探针来检测脱氧核糖核酸甲基化的技术。


背景技术：

2.脱氧核糖核酸甲基化主要发生在特定基因的启动子区的cpg岛(cpg island)的胞嘧啶(cytosine)上，由此，转录因子的结合受到干扰而阻断特定基因的表达(gene silencing)，这是在生物体内基因的核酸序列没有突变(mutation)的情况下，使基因功能丧失的主要机制。并且，其被解释成使人类癌症中多个肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgenes)丧失功能的原因。
3.在启动子cpg岛上的异常甲基化/去甲基化使肿瘤抑制基因、脱氧核糖核酸修复基因(dna repairgene)、细胞周期调节基因等超甲基化(hyper-methylation)，从而确认了在许多癌症中这些基因的表达被阻断。尤其，众所周知，在癌症发生早期阶段，在特定基因的启动子区将发生超甲基化。因此，肿瘤相关基因的启动子甲基化为癌症的重要指标，其可用于癌症早期诊断、致癌危险的预测、癌症的预后预测、治疗后随访、预测对化疗的反应等多方面。最近，正在积极开展通过亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing)、联合亚硫酸氢钠限制性分析(cobra，combined bisulfite restriction analysis)、焦磷酸测序、甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specificpolymerase chain reaction，msp)等的方法进行检查，并将检查结果用于癌症诊断和筛查等的研究，且正在积极开展在血液、痰液、唾液、粪便、尿液等中研究肿瘤相关基因的启动子甲基化并将其用于各种癌症治疗的研究。
4.但是，当前，研究人员为了确认脱氧核糖核酸甲基化而最常用的亚硫酸氢盐及甲基化特异性酶的处理之后执行甲基化特异性聚合酶链反应的方法为如下的方法，即，利用经亚硫酸氢盐处理来将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，使预先甲基化的5-甲基胞嘧啶维持原来状态的方式来确认脱氧核糖核酸内的个别胞嘧啶的甲基化状态，一次性可以检查的基因或样本的数量有限，经亚硫酸氢盐处理的基因组脱氧核糖核酸的90％以上被降解(degradation)，由此，当检测时需要大量的脱氧核糖核酸。并且，很难设计基于胞嘧啶转化为尿嘧啶的比例或转化效率的检测用引物，因引物的非特异性结合而存在检测结果的再现性降低的问题。
5.不仅如此，即使经亚硫酸氢盐处理，也有可能发生如下的错误，即，非甲基化胞嘧啶不会转化为尿嘧啶，或者5-甲基胞嘧啶并不维持原来状态，而是转化为胸腺嘧啶。因这种错误，需要亚硫酸氢盐处理的脱氧核糖核酸甲基化检测方法会发生假阳性结果，从而具有准确性、特异性、灵敏度和再现性均降低的问题。
6.另一方面，肽核酸(peptide nucleicacid)为核苷酸通过肽键连接的类似脱氧核糖核酸，而并非通过糖和磷酸键连接，其在1991年首次报告。肽核酸是通过化学方法合成且在自然界中不存在的人工核酸，已知的一般肽核酸的结构如下，即，n-(2-氨基乙基)甘氨酸
(n-(2-aminoethyl)glycine)单位通过酰胺键反复连接来形成n-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架，由于上述骨架具有如嘌呤(purine：a及g)和嘧啶(pyrimidine：c及t)碱基的核苷酸，从而可通过与具有互补性核酸序列的天然核酸的杂交(hybridization)反应形成双链。
7.在长度相同的情况下，肽核酸/脱氧核糖核酸双链比脱氧核糖核酸/脱氧核糖核酸双链更加稳定，因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism：snp)，双链的不稳定程度较大，因此，检测单核苷酸多态性的能力比天然核酸更卓越。肽核酸化学稳定，不仅如此，生物也稳定，因为不会被核酸酶(nuclease)或蛋白酶(protease)降解。
8.如上所述，正在进行利用肽核酸对于生物酶的稳定性的性质的研究，作为一例，将其用作探针。例如，可通过调节肽核酸探针与靶核酸之间的杂交效率来用于多种检测方法。
9.对此，本发明人员为了在脱氧核糖核酸甲基化检测方法中解决上述现有方式的技术问题而提出了在不经亚硫酸氢盐处理的情况下也可以轻松检测脱氧核糖核酸甲基化的肽核酸探针及利用上述肽核酸的甲基化检测方法。


技术实现要素：

10.本发明用于解决上述现有技术的问题，本发明的目的在于，提供在未经亚硫酸氢盐预处理的情况下可以检测基因的甲基化的新型肽核酸低聚物及甲基化基因检测用肽核酸探针。
11.本发明的再一目的在于，提供如下的方法，即，在未经亚硫酸氢盐预处理的情况下，利用肽核酸探针来在基因不扩增的情况下抑制甲基化的脱氧核糖核酸的扩增，选择性地扩增未甲基化的脱氧核糖核酸并利用各个聚合酶链反应产物的循环阈值差异来检测基因是否甲基化。
12.本发明的另一目的在于，提供如下的试剂盒，利用新型肽核酸探针来在基因不扩增的情况下抑制甲基化的脱氧核糖核酸的扩增，选择性地扩增未甲基化的脱氧核糖核酸并利用各个聚合酶链反应产物的循环阈值差异来检测基因是否甲基化。
13.为了实现上述目的，本发明提供通过以下化学式1表示的肽核酸(peptide nucleicacid)低聚物。
14.化学式1
[0015][0016]
在上述化学式1中，r1可以为疏水性取代基，r2为氢或疏水性取代基，r3为羟基或疏水性取代基，base为选自包括腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶的天然核苷酸或非天然核苷酸的一个碱基，n为5至30的整数，包含在上述肽核酸低聚物的各个结构单位可相同或不同。
[0017]
在本发明的一例中，上述化学式1的疏水性取代基可相互独立地选自由c
3-c
30
的烷
基、c
3-c
30
的烯基、c
3-c
30
的炔基、c
6-c
30
的芳基、c
3-c
30
的杂芳基、包含疏水基的氨基酸及它们的组合组成的组中，上述疏水性取代基的氢中的一种以上可被卤素元素取代，上述烷基、烯基或炔基的碳中的一种以上可被o或s取代，上述杂芳基包含选自b、n、o、s、p(＝o)、si及p中的一种以上。
[0018]
在本发明的一例中，上述化学式1的r1的疏水性取代基可以为选自由c
3-c
30
的烷基、c
3-c
30
的烯基及c
3-c
30
的炔基组成的组中的一种以上。
[0019]
在本发明的一例中，上述化学式1的r1的疏水性取代基可以为c
8-c
18
的烷基。
[0020]
在本发明的一例中，包含上述疏水基的氨基酸可以为相互独立地选自由异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、半胱氨酸(cys)、蛋氨酸(met)、丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、苏氨酸(thr)及色氨酸(trp)组成的组中的一种。
[0021]
本发明提供通过以下化学式1表示的甲基化基因检测用肽核酸探针。
[0022]
化学式1
[0023][0024]
在上述化学式1中，r1可以为疏水性取代基，r2为氢或疏水性取代基，r3为羟基或疏水性取代基，base为选自包括腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶的天然核苷酸或非天然核苷酸的一个碱基，n为5至30的整数，包含在上述肽核酸低聚物的各个结构单位可以相同或不同。
[0025]
在本发明的一例中，基因甲基化检测用肽核酸探针的化学式1的疏水性取代基可相互独立地选自由c
3-c
30
的烷基、c
3-c
30
的烯基、c
3-c
30
的炔基、c
6-c
30
的芳基、c
3-c
30
的杂芳基、包含疏水基的氨基酸及它们的组合组成的组中，上述疏水性取代基的氢中的一种以上可被卤素元素取代，上述烷基、烯基或炔基的碳中的一种以上可被o或s取代，上述杂芳基包含选自b、n、o、s、p(＝o)、si及p中的一种以上。
[0026]
在本发明的一例中，上述化学式1的r1的疏水性取代基可以为选自由c
3-c
30
的烷基、c
3-c
30
的烯基及c
3-c
30
的炔基组成的组中的一种以上。
[0027]
在本发明的一例中，上述化学式1的r1的疏水性取代基可以为c
8-c
18
的烷基。
[0028]
在本发明的一例中，包含上述疏水基的氨基酸可以为相互独立地选自由异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、半胱氨酸(cys)、蛋氨酸(met)、丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、苏氨酸(thr)及色氨酸(trp)组成的组中的一种。
[0029]
在本发明的一例中，上述肽核酸探针还可包含选自由报告基因(reporter)及猝灭剂(quencher)组成的组中的一种或两种的组合。
[0030]
在本发明的一例中，上述肽核酸探针可包含结合在c-末端的报告基因及结合在n-末端的猝灭剂的肽核酸探针或包含结合在n-末端的报告基因及结合在c-末端的猝灭剂。
[0031]
并且，本发明提供利用上述肽核酸探针的甲基化基因检测方法。
[0032]
在具体的一例中，上述甲基化基因检测方法可包括如下的步骤：制备可以与未甲基化的基因的核酸序列特异性结合的包含通过以下化学式1表示的肽核酸探针及未甲基化的基因的第一混合物；制备包含具有与上述核酸序列相同的核酸序列的甲基化分析用靶基因及通过以下化学式1表示的肽核酸探针的第二混合物；改变上述第一混合物及第二混合物的温度；以及测定基于上述温度变化的解链温度(tm，melting temperature)来分析熔解曲线。
[0033]
化学式1
[0034][0035]
在上述化学式1中，r1可以为疏水性取代基，r2为氢或疏水性取代基，r3为羟基或疏水性取代基，base为选自包括腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶的天然核苷酸或非天然核苷酸的一个碱基，n为5至30的整数，包含在上述肽核酸低聚物的各个结构单位可以相同或不同。
[0036]
在本发明的一例中，在分析上述熔解曲线的步骤中，可测定δtm，当δtm≥3℃时，判断为基因被甲基化，上述δtm＝tm(甲基化分析用靶基因)－tm(具有与甲基化分析用靶基因相同的核酸序列的未甲基化的基因)。
[0037]
在本发明的一例中，上述甲基化基因检测方法可包括如下的步骤：制备能够与未甲基化的基因的核酸序列特异性结合的包含通过以下化学式1表示的肽核酸探针及未甲基化的基因的第一混合物；制备包含具有与上述核酸序列相同的核酸序列的甲基化分析用靶基因及通过以下化学式1表示的肽核酸探针的第二混合物；对上述第一混合物及第二混合物执行聚合酶链反应；以及测定上述聚合酶链反应的δct值。在此情况下，上述δct＝ct(甲基化分析用靶基因)－ct(具有与甲基化分析用靶基因相同的核酸序列的未甲基化的基因)。
[0038]
并且，本发明提供试剂盒，用于包含肽核酸探针的上述甲基化基因检测方法，上述肽核酸探针通过以下化学式1表示，上述肽核酸探针可以与基因的核酸序列特异性结合，上述基因的核酸序列可发生甲基化。
[0039]
化学式1
[0040][0041]
在上述化学式1中，r1可以为疏水性取代基，r2为氢或疏水性取代基，r3为羟基或疏
水性取代基，base为选自包括腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶的天然核苷酸或非天然核苷酸的一个碱基，n为5至30的整数，包含在上述肽核酸低聚物的各个结构单位可以相同或不同。
[0042]
本发明提供方法，上述方法包括如下的步骤：混合基因甲基化检测用肽核酸探针与生物试样来使包含在上述生物试样的靶基因与肽核酸探针杂交；通过高于非甲基化的基因及肽核酸探针杂交体的解链温度且低于甲基化的基因及肽核酸探针杂交体的解链温度的温度施加热量；以及去除在上述温度条件下熔解的非甲基化的基因及肽核酸探针杂交体，通过上述甲基化的基因及肽核酸探针杂交体的成像的荧光信号检测基因甲基化。
[0043]
在本发明的甲基化基因检测方法中，在未经基因的扩增过程的情况下，可通过熔解曲线分析法来在短时间内检测基因是否甲基化。并且，即使不扩增基因，也可以利用δtm来以优秀的灵敏度及特异性检测含有极少量的甲基化基因。
[0044]
本发明的再一效果如下，即，通过在靶基因的甲基化的序列结合上述肽核酸来选择性地抑制上述甲基化的脱氧核糖核酸的扩增，并利用与对应扩增效率有关的循环阈值与未甲基化的基因的对应循环阈值差异来检测靶基因是否甲基化。或者，可利用甲基化的基因的循环阈值与内参基因(internal control基因)(betta actin，gapdh等)的循环阈值(甲基δct)及未甲基化的基因与上述internal control基因的循环阈值(非甲基δct)差异并通过δδct(δδct＝非甲基δct－甲基δct)分析来检测靶基因是否甲基化。
[0045]
不仅如此，在本发明的甲基化基因检测方法中，在未经亚硫酸氢盐预处理的情况下，可以仅通过一步骤轻松检测甲基化基因，无需担心通过亚硫酸氢盐处理的甲基化检测有可能发生错误，从而能够以高的准确度检测是否甲基化。
[0046]
并且，在本发明的甲基化基因检测方法中，在不经通过聚合酶链反应的基因的扩增过程的情况下，可通过利用荧光物质的成像技术来检测是否甲基化。可通过成像的荧光信号的强度及分布来检测甲基化的定量检测。
附图说明
[0047]
图1示出本发明的比较例1(a)及实施例1(b)的熔解曲线图。
[0048]
图2示出本发明实施例2(a)及比较例2(b)的甲基化检测聚合酶链反应的扩增曲线结果图。
[0049]
图3为示出本发明的实施例和比较例的甲基化与否判断技术的示意图。
具体实施方式
[0050]
以下，具体说明本发明。除非另有定义，在本说明书中所使用的术语应被解释成本发明所属技术领域的普通技术人员一般理解的内容。本说明书的附图及实施例用于使本发明所属技术领域的普通技术人员轻松理解并实施，在附图及说明书中可以省略有可能使本发明的主旨不清楚的内容，本发明并不局限于附图及实施例。
[0051]
以下使用的“甲基化”指在构成基因的碱基附着甲基的情况。优选地，在本发明中，是否甲基化是指在特定基因的特定cpg区的胞嘧啶(cytosine)是否发生甲基化。
[0052]
以下使用的“表观基因组特异性肽核酸”(epigenome specific pna)作为可以与靶基因的甲基化的胞嘧啶的甲基相互作用的肽核酸，可以是在规定的位置结合疏水性取代
基而发生变形的肽核酸。
[0053]
以下使用的肽核酸低聚物可以是2个以上的肽核酸单体通过肽键聚合的聚合物。
[0054]
以下使用的“特异性结合”可以是甲基化及非甲基化基因与肽核酸的核酸序列的70％以上的互补性结合，优选地，80％以上，更优选地，90％以上，最优选地，95％以上的序列互补性结合。
[0055]
本发明提供通过以下化学式1表示的肽核酸(peptide nucleic acid)低聚物。
[0056]
化学式1
[0057][0058]
上述r1为疏水性取代基，r2为氢或疏水性取代基，r3为羟基或疏水性取代基，base为选自包括腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶的天然核苷酸或非天然核苷酸的一个碱基，n为5至30的整数，包含在上述肽核酸低聚物的各个结构单位可以相同或不同。优选地，上述n可以为8至24的整数，但并不局限于此。
[0059]
具体地，上述非天然核苷酸可以包含嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、n4n
4-乙酰胞嘧啶、n6n
6-乙酰-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(c
3-c6)-烷基尿嘧啶、5-(c
3-c
6)
)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶及假异胞嘧啶，但并不局限于此。
[0060]
本发明的肽核酸低聚物可以为在肽核酸骨架(backbone)的特定位置结合疏水性取代基的形态，可以为均结合在肽核酸基本骨架的γ位置、n-末端、c-末端或或两侧末端的形态，优选地，可以为结合在γ位置的形态。最少一种以上的疏水性取代基可以连续、间歇性地结合在肽核酸探针。
[0061]
在本发明中的上述化学式1的疏水性取代基可相互独立地选自由c
3-c
30
的烷基、c
3-c
30
的烯基、c
3-c
30
的炔基、c
6-c
30
的芳基、c
3-c
30
的杂芳基、包含疏水基的氨基酸及它们的组合组成的组中，上述疏水性取代基的氢中的一种以上可被卤素元素取代，上述烷基、烯基或炔基的碳中的一种以上可被o或s取代，上述杂芳基包含选自b、n、o、s、p(＝o)、si及p中的一种以上。
[0062]
具体地，上述化学式1的r1的疏水性取代基可以为选自由c
3-c
30
的烷基、c
3-c
30
的烯基、c
3-c
30
的炔基、c
6-c
18
的芳基及c
4-c
15
的杂芳基组成的组中的一种以上，优选地，杂芳基可以包含n，但并不局限于此。
[0063]
更具体地，上述化学式1的r1的疏水性取代基可以为选自由c
6-c
20
的烷基、c
6-c
20
的烯基及c
6-c
20
的炔基组成的组中的一种以上，优选地，可选自作为c
8-c
18
的烷基的c
8-c
18
的烯基或c
8-c
18
的炔基中，只要是结合在肽核酸骨架并可以与甲基引起疏水性相互作用的疏水性取代基，则并不局限于此。
[0064]
结合在上述肽核酸低聚物的γ位置、一侧末端或两侧末端的疏水性取代基可通过与靶基因的甲基的疏水性相互作用，在没有空间位阻(sterichindrance)的情况下可提高
与靶基因的结合力。
[0065]
并且，在包含疏水基的氨基酸的情况下，可以为相互独立地选自由异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、半胱氨酸(cys)、蛋氨酸(met)、丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、苏氨酸(thr)及色氨酸(trp)组成的组中的一种。优选地，可以为选自由异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)及半胱氨酸(cys)组成的组中的一种，但并不局限于此。
[0066]
与非甲基化基因相比，结合在上述氨基酸的支链(side chain)的疏水基与结合在甲基化基因的甲基之间的疏水性相互作用可呈现出分子间更强力的结合力。
[0067]
本发明提供通过以下化学式1表示的甲基化基因检测用肽核酸(peptide nucleicacid)探针。
[0068]
化学式1
[0069][0070]
在上述化学式1中，r1可以为疏水性取代基，r2为氢或疏水性取代基，r3为羟基或疏水性取代基，base为选自包括腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶的天然核苷酸或非天然核苷酸的一个碱基，n为5至30的整数，包含在上述肽核酸低聚物的各个结构单位可以相同或不同。优选地，上述n可以为8至24的整数，但并不局限于此。
[0071]
上述化学式1的疏水性取代基可相互独立地选自由c
3-c
30
的烷基、c
3-c
30
的烯基、c
3-c
30
的炔基、c
6-c
30
的芳基、c
3-c
30
的杂芳基、包含疏水基的氨基酸及它们的组合组成的组中，上述疏水性取代基的氢中的一种以上可被卤素元素取代，上述烷基、烯基或炔基的碳中的一种以上可被o或s取代，上述杂芳基包含选自b、n、o、s、p(＝o)、si及p中的一种以上。
[0072]
具体地，上述化学式1的r1的疏水性取代基可以为选自由c
3-c
30
的烷基、c
3-c
30
的烯基、c
3-c
30
的炔基、c
6-c
18
的芳基及c
4-c
15
的杂芳基组成的组中的一种以上，优选地，杂芳基可包含n，但并不局限于此。
[0073]
更具体地，上述化学式1的r1的疏水性取代基可以为选自由c
6-c
20
的烷基，c
6-c
20
的烯基及c
6-c
20
的炔基组成的组中的一种以上，优选地，可以选自作为c
8-c
18
的烷基的c
8-c
18
的烯基或c
8-c
18
的炔基中，只要是结合在肽核酸骨架并可以与甲基引起疏水性相互作用的疏水性取代基，则并不局限于此。
[0074]
包含上述疏水基的氨基酸可相互独立地选自由异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、半胱氨酸(cys)、蛋氨酸(met)、丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、苏氨酸(thr)及色氨酸(trp)组成的组中的一种。优选地，可以为选自由异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)及半胱氨酸(cys)组成的组中的一种，但并不局限于此。
[0075]
与非甲基化基因相比，结合在上述氨基酸的支链(side chain)的疏水基与结合在
chlorotriazinyl)、罗丹明绿(rhodamine green)、罗丹明红(rhodamine red)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、fitc、俄勒冈绿(oregon green)、aleza fluor、fam(6-羧基荧光素)、德克萨斯红、hex(2，4，5，7-四氯-6-羧基-4，7-二氯荧光素)、joe、rox、tet、tritc、temra、cy3及cy5组成的组中的一种以上，但并不局限于此。
[0087]
在本发明中，猝灭剂作为吸收上述报告基因的发光能量的荧光受体(fluoroscence acceptor)，可以为选自由tamra(6-羧基四甲基罗丹明)、eclipse、ddq、qsy、黑莓猝灭剂(blackberry quencher)、bhq1、bhq2、dabcyl(4，4-二甲氨基-偶氮苯-4-羧酸)、爱荷华黑(iowa black)、fq、irdye qc-1组成的组中的一种以上，但并不局限于此。
[0088]
本发明的肽核酸探针包含选自由报告基因及猝灭剂组成的组中的一种或两种的组合，由此，若与未甲基化的基因或甲基化分析用靶基因杂交来形成杂交体(hybrid)，则发生荧光信号。在本发明的一例中，肽核酸探针包含选自由报告基因及猝灭剂组成的组中的一种或两种的组合，但并不局限于此，上述报告基因或猝灭剂可以结合在未甲基化的基因或甲基化分析用靶基因。
[0089]
若逐渐改变上述杂交体的温度，则形成双链的肽核酸探针及基因在适当熔解温度条件下迅速熔解，荧光信号被猝灭，猝灭瞬间的温度可以为解链温度。可测定未甲基化的基因及肽核酸探针、甲基化分析用靶基因及肽核酸探针之间的δtm来确认基因是否甲基化。
[0090]
本发明提供利用上述甲基化基因检测用肽核酸探针来检测基因是否甲基化的方法。具体地，提供包括如下步骤的甲基化基因检测方法：制备可以与未甲基化的基因的核酸序列特异性结合的包含通过以下化学式1表示的肽核酸探针及未甲基化的基因的第一混合物；制备包含具有与上述核酸序列相同的核酸序列的甲基化分析用靶基因及通过以下化学式1表示的肽核酸探针的第二混合物；改变上述第一混合物及第二混合物的温度；以及测定基于上述温度变化的解链温度(tm，melting temperature)来分析熔解曲线。
[0091]
化学式1
[0092][0093]
在上述化学式1中，r1可以为疏水性取代基，r2为氢或疏水性取代基，r3为羟基或疏水性取代基，base为选自包括腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶的天然核苷酸或非天然核苷酸的一个碱基，n为5至30的整数，包含在上述肽核酸低聚物的各个结构单位能够相同或不同。优选地，上述n可以为8至24的整数，但并不局限于此。
[0094]
上述化学式1的疏水性取代基可相互独立地选自由c
3-c
30
的烷基、c
3-c
30
的烯基、c
3-c
30
的炔基、c
6-c
30
的芳基、c
3-c
30
的杂芳基、包含疏水基的氨基酸及它们的组合组成的组中，上述疏水性取代基的氢中的一种以上能够被卤素元素取代，上述烷基、烯基或炔基的碳中的一种以上能够被o或s取代，上述杂芳基包含选自b、n、o、s、p(＝o)、si及p中的一种以上。
33258)及其的衍生物、hoechst 33342及其的衍生物、hoechst 34580及其的衍生物、羟芪脒(hydroxystilbamidine)及其的衍生物、lds 751及其的衍生物、碘化丙啶(propidium iodide，pi)及其的衍生物、cy-dyes衍生物组成的组中。
[0105]
具体地，表观基因组特异性肽核酸可包含报告基因(reporter)及猝灭剂(quencher)。由于表观基因组特异性肽核酸包含报告基因及猝灭剂，因此，与基因形成互补性结合并杂交之后，可以产生荧光信号，随着上述杂交的混合物的温度上升，当在熔解温度条件下，表观基因组特异性肽核酸与基因的互补性结合解离时，荧光信号将被猝灭。可通过从基于这种温度变化的荧光信号及猝灭信号获取的熔解曲线分析来判断基因是否甲基化。
[0106]
上述各个混合物可通过基因扩增仪从30℃至95℃，优选地，从40℃至90℃以0.1℃/s至20℃/s的速度，优选地，以0.2℃/s至15℃/s的速度，更优选地，以0.5℃/s至10℃/s的速度改变温度。若达到规定温度，则肽核酸/脱氧核糖核酸双链的互补性结合解离而分离，在此情况下的温度为熔解温度(tm)，可通过荧光信号的消失确认熔解温度。
[0107]
在分析上述熔解曲线的步骤中，可测定δtm，当δtm≥3℃时，可判断为基因被甲基化。优选地，可以为δtm≥5℃，更优选地，可以为δtm≥10℃，上述δtm＝tm(甲基化分析用靶基因)－tm(具有与甲基化分析用靶基因相同的核酸序列的未甲基化的基因)，甲基化的胞嘧啶与表观基因组特异性肽核酸之间的结合力强于非甲基化的胞嘧啶与表观基因组特异性肽核酸之间的结合力，因此，熔解温度在甲基化的胞嘧啶与表观基因组特异性肽核酸结合的情况下更高。
[0108]
在本发明的基因甲基化检测方法中，可通过测定基于上述温度变化的解链温度来分析熔解曲线的步骤，在基因不扩增的情况下，仅通过测定基于上述各个混合物温度变化的解链温度来轻松检测甲基化。
[0109]
在本发明的一实例中，上述甲基化基因检测方法可包括如下的步骤：制备可以与未甲基化的基因的核酸序列特异性结合的包含通过以下化学式1表示的肽核酸探针及未甲基化的基因的第一混合物；制备包含具有与上述核酸序列相同的核酸序列的甲基化分析用靶基因及通过以下化学式1表示的肽核酸探针的第二混合物；对上述第一混合物及第二混合物执行聚合酶链反应(pcr，polymerase chain reaction)；以及测定上述聚合酶链反应的δct(cycle threshold)值。在此情况下，上述δct＝ct(靶基因)－ct(具有与靶基因相同的核酸序列的未甲基化的基因)。
[0110]
根据聚合酶链反应(pcr，polymerase chain reaction)获取的基因的扩增产物可通过上述嵌入式荧光物质测定。尤其，在实时聚合酶链反应(real time pcr：rt-pcr)的情况下，为了观察整个反应而使用荧光染料，但由于在每个扩增周期均累积扩增产物，因此荧光染料按比例增加。在扩增初期未检测到荧光的增加，但是当扩增次数超过规定次数时，设备将会检测到累积的荧光量，从而，将显著增加至足以检测到超出最低可检测水平(background level)的时间点的扩增周期数视为循环阈值(ct，cycle threshold)。
[0111]
具体地，本发明可通过聚合酶链反应来扩增基因。与和非甲基化的基因杂交的情况相比，与甲基化的基因杂交的表观基因组特异性肽核酸探针更强力地结合，这是因为氢键及疏水性相互作用引起的更大的分子间引力。由此，基因的扩增受到抑制，因此呈现出较高的循环阈值。即，可通过确认从靶基因的循环阈值去除对照试样的相同基因的循环阈值来获取的δct值来确认是否甲基化。
[0112]
根据本发明的基因甲基化检测方法，可以为δct＞0.5，优选地，可以为δct＞1。
[0113]
本发明提供试剂盒，用于包含肽核酸探针的本发明的甲基化基因检测方法，上述肽核酸探针通过以下化学式1表示，上述肽核酸探针可以与基因的核酸序列特异性结合，上述基因的核酸序列可发生甲基化。
[0114]
化学式1
[0115][0116]
在上述化学式1中，r1可以为疏水性取代基，r2为氢或疏水性取代基，r3为羟基或疏水性取代基，base为选自包括腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶的天然核苷酸或非天然核苷酸的一个碱基，n为5至30的整数，包含在上述肽核酸低聚物的各个结构单位能够相同或不同。优选地，上述n为8至24的整数，但并不局限于此。
[0117]
本发明提供包括如下步骤的方法：混合肽核酸探针与生物试样来使包含在上述生物试样的靶基因与肽核酸探针杂交；通过高于非甲基化的基因及肽核酸探针杂交体的解链温度且低于甲基化的基因及肽核酸探针杂交体的解链温度的温度施加热量；以及去除在上述温度条件下熔解的非甲基化的基因及肽核酸探针杂交体，通过上述甲基化的基因及肽核酸探针杂交体的成像的荧光信号检测基因甲基化。
[0118]
利用上述肽核酸探针与甲基化的基因或未甲基化的基因的结合温差，可以在体外混合包含荧光物质的肽核酸探针与对应于包含待检测的基因的组织、细胞的生物试样。可以在结合温度高的甲基化的基因及肽核酸探针可以维持结合，且结合温度低的未甲基化的基因及肽核酸探针的结合分离的温度条件下检测荧光信号来检测对应生物试样的靶基因是否甲基化。
[0119]
以下，通过以下的实施例对本发明进行说明。只是，以下的实施例用于具体说明本发明，本发明的范围并不局限于以下的实施例。
[0120]
《实施例1＞分析表观基因组特异性肽核酸探针与非甲基化或甲基化的靶脱氧核糖核酸的结合温度
[0121]
放入0.1μm的序列2的表观基因组特异性肽核酸探针(seasunbio材料，韩国)、0.1μm的序列3的非甲基化的脱氧核糖核酸低聚物(intergrated dna technologies，美国)、0.1μm的序列的甲基化的脱氧核糖核酸低聚物(intergrated dna technologies，美国)及10μl的2x pcr扩增溶液(seasunbio材料，韩国)及7μl的蒸馏水来混合。之后，利用实时基因扩增仪(real-time pcrmachine，cfx96 tm real-time pcrsystem，伯乐(biorad)，美国)，在95℃的温度条件下反应5分钟，将温度降低至40℃之后，从40℃至90℃以2℃/s的速度每上升1℃的温度，在没有基因扩增过程的情况下，测定510nm的荧光波长来分析熔解曲线。在上述试验中所使用的序列如以下表1所示。
[0122]
《比较例1＞分析与一般肽核酸探针结合的非甲基化或甲基化的靶脱氧核糖核酸
的结合温度
[0123]
除代替表观基因组特异性肽核酸探针，使用序列1的一般肽核酸探针之外，与实施例1相同地进行。
[0124]
表1表1
[0125]
图1的a)部分以图表呈现与比较例1有关的结果，图1的b)部分以图表呈现与实施例1有关的结果，在比较例1的情况下，δtm为1℃，在使用表观基因组特异性肽核酸探针的实施例1的情况下，δtm为13℃。通过这种结果可以确认，与未变形的肽核酸相比，在结合疏水性取代基的变形的表观基因组特异性肽核酸的情况下，与甲基化的脱氧核糖核酸的结合力更强，由此可以显著提高在甲基化检测中的灵敏度及特异性。
[0126]
《实施例2＞分析与表观基因组特异性肽核酸探针结合的非甲基化或甲基化的靶脱氧核糖核酸的δct
[0127]
利用45ng的genomicdna、0.1μm的序列5及序列6的脱氧核糖核酸引物、0.1μm的序列2的表观基因组特异性肽核酸探针及10μl的1xpcr扩增溶液(seasunbio材料，韩国)来进行了聚合酶链反应扩增。聚合酶链反应扩增条件如下。利用实时基因扩增仪(real-time pcrmachine，cfx96 tm real-time pcrsystem，biorad，美国)，在95℃的温度条件下处理5分钟之后，以在95℃的温度下30秒钟、在58℃的温度条件下30秒钟、在72℃的温度条件下30秒钟共循环25次之后，在72℃的温度条件下反应5分钟。
[0128]
非甲基化的靶脱氧核糖核酸使用human hct116 dko non-methylated dna(cat#d5014-01，zymo research，美国)，甲基化的脱氧核糖核酸使用human hct116 dko methylated dna(cat#d5014-02，zymo research，美国)。
[0129]
《比较例2＞分析利用sybrgreen intercalating dye的非甲基化或甲基化的靶脱氧核糖核酸的δct
[0130]
使用与实施例2相同条件的脱氧核糖核酸和引物，代替表观基因组特异性肽核酸，将sybrgreen dye(1x)用作插入染料(intercalating dye)来进行聚合酶链反应。聚合酶链反应条件也与实施例2相同。
[0131]
表2序列编号序列名称序列(n'≥c')区分5sep_fgccgcagcagccagcca正向引物6sepr_c2accagccatcatgtcggacc反向引物
[0132]
图2的a)部分示出利用表观基因组特异性肽核酸探针的脱氧核糖核酸甲基化检测聚合酶链反应的扩增曲线结果图表，δct的值为3。图2的b)部分为执行利用intercalating dye的聚合酶链反应的扩增曲线结果图表，对基于靶脱氧核糖核酸浓度的δct进行归一化(normalization)的结果，δct值为0。
[0133]
上述结果表示与非甲基化的基因相比，在使用表观基因组特异性肽核酸探针的情况下，通过与甲基化的胞嘧啶的强力的相互作用，扩增得到印制，由此，可以确认通过测定δct来检测基因是否甲基化。