Marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的培育及其应用

marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的培育及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株经过反向遗传操作技术培育的marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征改造病毒及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)严重危害全球养猪业的健康发展。prrsv可以感染所有日龄猪，以引起母猪流产和仔猪的呼吸系统综合征为主要特征。prrsv毒株可分为：prrsv1和prrsv2。我国主要流行的是prrsv2，但是近年来prrsv1也已在我国广泛存在并有进一步流行的趋势。此外，四川、广东等地已有由prrsv1感染引发疫情的报道。
3.prrsv属于动脉炎病毒科，是一种单股正链rna病毒，其基因组大小约为15kb，包含10个开放阅读框(orf)。orf1a和orf1b编码至少16个非结构蛋白，orf2-7编码8个结构蛋白。其中，orf2-4基因编码的三种小囊膜蛋白(gp2a，gp3和gp4)通过非共价键形成异三聚体，在prrsv感染靶细胞中发挥关键作用。有研究表明将gp2a的88/94/95位氨基酸进行突变可显著改善prrsv1毒株对marc-145细胞的适应性。
4.疫苗免疫是防控prrs疫情的有效手段。尽管近年来prrsv1已在我国广泛流行，但我国尚未研制出prrsv1特异性疫苗。由于我国现有prrsv1野毒株只能在原代肺泡巨噬细胞pam上增殖，无法在传代marc-145细胞上培养。这成为研制prrsv1活疫苗的一大难题。
5.反向遗传操作技术已成为新型基因工程疫苗研制的重要手段。但是目前尚未有利用反向遗传操作技术改造获得可适应marc-145细胞的prrsv1野毒株的报道。


技术实现要素：

6.本发明针对目前我国缺乏有效防控prrsv1流行株的商品化疫苗问题，本发明提供一株可适应marc-145细胞体外传代培养的prrsv1改造毒株。这一prrsv1改造毒株可作为研制prrsv1基因工程活疫苗的候选株。具体为marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的培育及其应用。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.一种重组质粒，用于制备marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征改造病毒，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征改造病毒rhljb1-m-ame3，由上述重组质粒所拯救制备。
10.marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征改造病毒rhljb1-m-ame3的构建方法如下：
11.首先构建拯救不能适应marc-145细胞的prrsv1野毒株的感染性克隆病毒rhljb1，再利用定点突变对其小囊膜蛋白gp2a编码基因orf2进行特定位点突变，随后利用同源重组对其小囊膜蛋白gp3编码基因orf3进行替换，经过上述orf2和orf3基因双重改造最终成功
拯救获得可适应marc-145细胞的prrsv1改造毒株rhljb1-m-ame3。
12.本发明提供了一株经过反向遗传操作技术改造培育的可适应marc-145细胞传代培养的prrsv1毒株rhljb1-m-ame3。改造前其亲本毒株hljb1只能适应pam原代细胞体外培养，改造后rhljb1-m-ame3可以适应marc-145传代细胞培养。该改造病毒极大便利了后期在活疫苗研制中的应用。
13.进一步的，所述prrsv1野毒株的感染性克隆病毒rhljb1为：使用pacyc177低拷贝载体，经过基因合成和同源重组在pacyc177载体上插入五个单一限制性酶切位点sgsi，pfl23ii，bglii，bsp1407i和xbai，用于感染性克隆病毒rhljb1的构建；rhljb1包含prrsv1野毒株hljb1的基因组全长cdna序列，该全长cdna序列的5’端加有巨细胞病毒真核启动子序列，3’端poly(a)尾下游加有丁肝炎病毒核酶序列以及牛生长激素多聚腺苷酸信号转录终止序列。
14.进一步的，marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征改造病毒rhljb1-m-ame3的构建方法，包括如下步骤：
15.1)puc57-synthesis-amervac-orf2-4质粒合成；
16.2)引物设计；
17.3)hljb1-m-ame3感染性克隆的构建；
18.3-1)hljb1-m-ame3全基因分段扩增；
19.3-2)hljb1-m-ame3各片段连接；
20.4)rhljb1-m-ame3感染性克隆病毒拯救。
21.进一步的，步骤2)中设计的引物如下：
[0022][0023][0024]
进一步的，marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征改造病毒rhljb1-m-ame3在制备新型基因工程疫苗中的应用。
[0025]
本发明的另一方面，提供了一种人工改造的prrsv1基因工程活疫苗候选株，上述人工改造获得的可适应marc-145细胞的prrsv1改造毒株接种仔猪不引起体温升高，不影响增重，也不造成发病死亡，具有良好安全性。同时可以诱导prrsv1特异性中和抗体，因此，可作为基因工程疫苗候选株，应用于培育prrsv1基因工程活疫苗。
[0026]
本发明的另一个方面，还提供了一种人工改造的prrsv1毒株应用于研究其marc-45细胞适应性机制。具体是利用反向遗传操作技术继续对这一可适应marc-145细胞的prrsv1改造毒株与不适应marc-145细胞的prrsv1野毒株的小囊膜蛋白编码基因继续进行定点突变和片段替换，从而精确解析决定prrsv1野毒株marc-145细胞适应性的关键基因与位点。
[0027]
与现有技术相比，本发明的有益技术效果如下：
[0028]
1、所改造获得的感染性克隆病毒是一株可适应marc-145细胞体外传代培养的prrsv1改造毒株；
[0029]
2、所构建的改造病毒有良好的体内外增殖效力，感染marc-145传代细胞可引起细胞病变(cpe)，接种猪体可以出现特异性病毒血症；
[0030]
3、所构建的改造病毒具有良好的安全性，接种猪体后不引起发热(体温《40℃)，不影响增重，更不会引起仔猪发病死亡；
[0031]
4、所构建的改造病毒可以诱导保护性免疫应答，接种猪可诱导产生prrsv1的中和抗体；
[0032]
5、所构建的改造病毒可用于研制prrsv1基因工程活疫苗，有利于我国prrs疫情的防控。
附图说明
[0033]
图1是本发明实施例1中rhljb1-m-ame3改造病毒基因组全长cdna连接构建示意图；
[0034]
图2是本发明实施例1中rhljb1-m-ame3改造病毒感染marc-145细胞引起的细胞病变图；
[0035]
图3是本发明实施例1中利用针对prrsv的n蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光检测法在marc-145细胞检测拯救的rhljb1-m-ame3改造病毒结果图；
[0036]
图4是本发明实施例1中利用针对prrsv的n蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光检测法在pam细胞检测拯救的rhljb1-m-ame3改造病毒结果图；
[0037]
图5是本发明实施例1中利用荧光定量pcr方法检测rhljb1-m-ame3改造病毒在marc-145细胞上的动态增殖结果图；
[0038]
图6是本发明实施例1中rhljb1-m-ame3改造病毒感染marc-145细胞的噬斑结果图；
[0039]
图7是本发明实施例2中rhljb1-m-ame3改造病毒接种猪体引起病毒血症结果图；
[0040]
图8是本发明实施例2中rhljb1-m-ame3改造病毒接种猪体体温变化结果图；
[0041]
图9是本发明实施例2中rhljb1-m-ame3改造病毒接种猪体体重变化结果图。
[0042]
核苷酸序列说明
[0043]
seq id no.1重组质粒rhljb1-m-ame3序列；
[0044]
seq id no.2引物hljb1-asci-f1；
[0045]
seq id no.3引物hljb1-pfl23
ⅱ‑
r1；
[0046]
seq id no.4引物hljb1-pfl23
ⅱ‑
f2；
[0047]
seq id no.5引物hljb1-bglii-r2；
[0048]
seq id no.6引物hljb1-bglii-f3；
[0049]
seq id no.7引物hljb1-bsp1407i-r3；
[0050]
seq id no.8引物hljb1-bsp1407i-f4；
[0051]
seq id no.9引物hljb1-r4-1；
[0052]
seq id no.10引物hljb1-xbai-r4-2；
[0053]
seq id no.11引物hljb1-orf2am-f；
[0054]
seq id no.12引物hljb1-orf2am-r；
[0055]
seq id no.13引物amervac-overlap-orf2a-r；
[0056]
seq id no.14引物amervac-overlap-orf3-f；
具体实施方式
[0057]
下列实施例中的常规实验方法，参见sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。
[0058]
在本发明的实施例中，病毒有hljb1分离株。细胞有bhk-21细胞系和原代肺泡巨噬细胞pam和marc-145细胞。
[0059]
在本发明实施例中，质粒和菌株：pacyc177质粒购自优宝生物，rhljb1感染性克隆质粒保存于本实验室(构建方法如前文所述)，trans1-t1感受态细胞购自北京全式金生物有限公司，puc57-synthesis-amervac-orf2-4和pacyc177-new合成于苏州金唯智公司。
[0060]
在本发明实施例中，使用的其他试剂：rnase free h2o、胰酶细胞消化液(酚红)购自solarbio公司；tripure reagent总rna提取试剂购自艾德莱生物公司；primescript1st strand cdna synthesis kit、2
×
primestar max dna polymearse购自takara公司；fastpure plasmid mini kit购自诺维赞生物科技有限公司；dmem培养基购自hyclone生物化学制品有限公司；胎牛血清购自sigma公司；dylight 594,goat anti-mouse igg(h l)secondary antibody购自invitrogen；dna marker购自浙江博而金科技股份有限公司；2
×
biogold tag plus pcr mastermix购自浙江博而金科技股份有限公司；同源重组试剂盒cloneexpress multis one step cloning kit购自vazyme公司；gel extraction kit购自北京康为世纪生物科技有限公司；dna限制性内切酶购自thermo fisher公司；t4 dna ligase、lipofectamine
tm
3000transfection reagent购自invitrogen。
[0061]
实施例1
[0062]
可适应marc-145细胞体外培养的1型猪繁殖与呼吸综合征病毒改造、构建与拯救；
[0063]
1.1puc57-synthesis-amervac-orf2-4质粒合成
[0064]
根据genbank中可适应marc-145细胞的prrsv1毒株amervac的全基因序列(genbank登录号：gu067771.1)，在金唯智公司人工合成其orf2-4基因序列，全长1702bp。得到puc57
‑‑
synthesis-amervac-orf2-4质粒。
[0065]
1.2引物设计
[0066]
使用primer 5.0设计包含amervac的orf3基因的扩增引物，上下游引物分别包含与hljb1的orf2和orf4基因相匹配的同源臂，用于如图1所示通过重叠pcr构建嵌合f3片段。
[0067]
设计突变引物，在hljb1的orf2基因引入3个点突变，使第88、94和95位氨基酸由imf变为fil。
[0068]
包含hljb1全基因扩增的4对引物已于前期构建prrsv1感染性克隆rhljb1时设计，所有使用引物详见下表1：
[0069]
表1.本发明构建prrsv感染性克隆改造病毒的引物
[0070][0071][0072]
1.3hljb1-m-ame3感染性克隆的构建
[0073]
1.3.1hljb1-m-ame3全基因分段扩增
[0074]
如附图1所示，hljb1-m-ame3共有4个片段。首先，以hljb1病毒为模板，分别以hljb1-sgsi-f1和hljb1-pfl23ii-r1；hljb1-pfl23ii-f2和hljb1-bglii-r2引物对组合；扩增f1和f2片段。其次，扩增f4片段需要分两步进行，首先使用hljb1-bsp1407i-f4和hljb1-1r4配对扩增f4-1片段，随后以f4-1扩增产物作为模板，以hljb1-bsp1407i-f4和hljb1-xbai-2r4引物对扩增获得f4片段并加入丁型肝炎病毒(hdv ribozyme)序列。
[0075]
hljb1-m-ame3的f3片段扩增需要分多步进行，首先以hljb1病毒为模板，分别以hljb1-bglii-f3和hljb1-orf2am-r；hljb1-orf2am-f和hljb1-bsp1407i-r3引物对扩增得到f3-m1和f3-m2。随后以f3-m1和f3-m2为模板，用hljb1-bglii-f3和hljb1-bsp1407i-r3引物对进行重叠pcr，得到带有88/94/95三个氨基酸突变的f3-m3。再以f3-m3为模板，用hljb1-bglii-f3和amervac-overlap-orf2a-r引物对，扩增得到f3-ame3-1。然后，以puc57
‑‑
synthesis-amervac-orf2-4合成质粒为模板，以amervac-overlap-orf3-f和hljb1-bsp1407i-r3引物对，扩增得到f3-ame3-2。最后，以f3-ame3-1和f3-ame3-2为模板，用hljb1-bglii-f3和hljb1-bsp1407i-r3引物对进行重叠pcr，扩增得到f3-ame3-3。hljb1
分段扩增的反应体系和反应程序具体如下：
[0076]
表2反应体系
[0077]
cdna2
×
primestar max dna polymearse引物(10μm)h2o2μl20μl1μl补至40μl
[0078]
表3反应程序
[0079][0080]
按照上述方法，分别扩增hljb1的f1、f2和f4片段，以及带有三个氨基酸突变和amervac orf3基因的f3-ame3-3片段。取pcr反应产物2μl，使用浓度为0.9％的琼脂糖凝胶进行电泳，分别获得片段大小为4371bp，5230bp，2001bp和3758bp的四个基因片段。
[0081]
1.3.2hljb1-m-ame3各片段连接；
[0082]
使用产物纯化试剂盒纯化上述扩增产物。纯化产物与pacyc177-new质粒双酶切，依次连接到pacyc177-new载体，构建策略如图1所示。具体操作步骤如下：
[0083]
首先使用sgs i和pf l23ii双酶切pacyc177-new质粒和hljb1 f1扩增产物，pacyc177-new酶切体系为：pacyc177-new质粒(200ng/μl)15μl,sgsi3μl,pfl23ii 3μl,10
×
cutsmart buffer 4μl,rnase free h2o补至40μl。hljb1 f1酶切体系为：hljb1 f1纯化产物(200ng/μl)10μl,sgsi 2μl,pfl23ii 2μl,10
×
cutsmart buffer 4μl,rnase free h2o补至40μl。反应条件：37℃水浴30分钟。
[0084]
利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收。胶回收的线性载体pacyc177-new和酶切产物hljb1 f1按摩尔比为1:8,以t4 dna连接酶连接，转化trans1-t1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用检测引物进行菌液pcr检测。选取pcr阳性菌过夜增菌培养，提取质粒dna，使用sgsi和pfl23ii进行双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的质粒再进行测序验证，然后继续进行下一个片段连接。f2，f3-ame3-3和f4片段的连接方法与f1连接方法相似，按照图1所示构建策略图进行连接，最终获得含全基因组序列的感染性克隆质粒rhljb1-m-ame3。rhljb1-m-ame3重组质粒全长序列详见seq id no.1。当应用上述仅含有orf2三个点图标的f3-m3片段替换f3-ame3-3即可构建获得感染性克隆质粒rhljb1-m。
[0085]
1.4rhljb1-m-ame3感染性克隆病毒拯救；
[0086]
预先使用含10％fbs的dmem培养基将bhk-21细胞按5
×
105cells/孔的密度接种于12孔细胞培养板，置于37℃,5％co2的培养箱培养至细胞密度达到90％左右。按照lipofectamine
tm
3000transfection reagent说明进行细胞转染，具体操作如下：
[0087]
首先在一个ep管中配置质粒预混液：rhljb1-m-ame3感染性克隆质粒2μg,p3000 4μl，optin-mem 50μl；在另一个ep管中配置lip3000预混液：lip30003μl，optin-mem 50μl；最后将上述两步获得的预混液混合，室温静置15min后,加入待转染的细胞。细胞转染后36-48h,收集上清冻于-80℃备用。
[0088]
使用含有10％fbs的dmem培养基将marc-145细胞按2
×
105cells/孔的密度接种到12孔细胞培养板，置于37℃，5％co2的培养箱培养至细胞密度达到90％左右，弃去培养基，取500μl的bhk-21细胞转染上清液，覆盖到marc-145细胞上，孵育1.5h后，弃去上清，添加含
2％fbs的dmem培养基继续培养。每日观察细胞形态，直至出现典型病变(图2)。培养3-4天，收集细胞上清液，进行ifa试验。如图3所示，prrsv抗n蛋白单克隆抗体15a1检测，拯救病毒(rhljb1-m-ame3)可见特异性红色荧光，亲本毒株与阴性对照组无荧光产生，证实rhljb1-m-ame3感染性克隆病毒在marc-145细胞上拯救成功。同时rhljb1-m-ame3感染性克隆病毒在pam细胞上也可以成功增殖(图4)。用相同方法拯救的rhljb1-m仍然只能感染原代pam细胞，而无法感染marc-145细胞(图2至图6)。
[0089]
1.5rhljb1-m-ame3在marc-145上增殖活性测定；
[0090]
使用含有10％fbs的dmem培养基将marc-145细胞按2
×
105cells/孔的密度接种到12孔细胞培养板，置于37℃，5％co2的培养箱培养至细胞密度达到90％左右，弃去培养基，换用2％fbs的dmem维持培养基(600μl)，并以1：20的比例添加病毒液(30μl)，分别于2hpi(hours post infection)，24hpi，48hpi，72hpi，96hpi，120hpi和144hpi弃去上清，收集细胞，使用tripure reagent提取细胞总rna。总rna经过nanodrop测定浓度后，取500ng rna进行反转录。所得cdna取1μl用于real-time pcr检测prrsv1 orf7基因。具体反应体系和扩增程序如下：
[0091]
表4检测反应体系
[0092]
cdna2
×
ex taq引物(10μm)探针(10μm)h2o1μl20μl0.5μl0.4μl补至20μl
[0093]
表5检测反应程序
[0094][0095]
rhljb1-m-ame3改造病毒在marc-145上的动态增殖情况如图5所示。仅有rhljb1-m-ame3改造病毒可以在marc-145细胞上复制增殖，而rhljb1和rhljb1-m感染性克隆病毒均不能在marc-145细胞上增殖。
[0096]
1.6rhljb1-m-ame3感染marc-145噬斑试验；
[0097]
使用含有10％fbs的dmem培养基将marc-145细胞按2
×
105cells/孔的密度接种到12孔细胞培养板，置于37℃，5％co2的培养箱培养至细胞汇合度达到100％之后，弃去培养基，加入600μl以十倍梯度稀释的病毒液孵育2h后，以含2％fbs及1
×
dmem的低熔点琼脂糖凝胶覆盖。倒置于37℃，5％co2的培养箱培养7天。随后以4％多聚甲醛覆盖琼脂表面，于4℃冰箱过夜固定。弃去多余4％多聚甲醛，小心抠下琼脂，加入结晶紫染色1h，自来水清洗后观察噬斑形态，如图6所示。仅有rhljb1-m-ame3改造病毒可以在感染marc-145细胞后产生空斑，而rhljb1和rhljb1-m感染性克隆病毒均不能感染marc-145细胞，而没有产生空斑。
[0098]
实施例2
[0099]
改造病毒rhljb1-m-ame3仔猪接种试验及其安全性和免疫效力评价；
[0100]
1.改造病毒rhljb1-m-ame3仔猪接种试验；
[0101]
挑选13头prrsv，prv(伪狂犬病毒)，pcv(圆环病毒)，pedv(猪流行性腹泻病毒)等重要病原阴性猪，以2ml含105tcid
50
的rhljb1-m-ame3病毒液接种5头6周龄仔猪，以2ml含105tcid
50
的hljb1病毒液接种5头仔猪。另取3头仔猪接种2ml dmem培养基。第3、7、11、14、
21dpi(days post infection)采集血清，并以qrt-pcr检测病毒含量，如图7所示。每日监测仔猪体温变化情况，如图8所示。每周监测仔猪体重变化情况，如图9所示。rhljb1-m-ame3病毒可以在猪体内增殖产生病毒血症，但是不引起体温升高，也不影响增重。更没有引起明显临床症状或者死亡，初步表明该改造病毒具有较好的安全性。
[0102]
2.体外中和试验检测接种猪血清中抗体含量；
[0103]
为测定rhljb1-m-ame3病毒诱导猪体产生保护性免疫应答能力，利用病毒中和试验对采集的血清样品进行了中和抗体测定。在marc-145细胞上测定血清对rhljb1-m-ame3病毒的中和活性。结果显示rhljb1-m-ame3接种猪可以诱导中和抗体产生，初步表明该改造病毒可诱导猪体产生保护性免疫应答。具体结果如下表所示。
[0104]
表6接种猪血清中抗体含量
[0105][0106]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明技术方案而作的举例，并非对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明要求的保护范围之内。