腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法与流程

腺相关病毒raav9的分离纯化方法
技术领域
1.本发明涉及病毒的分离纯化领域，具体涉及一种腺相关病毒的分离纯化方法。


背景技术：

2.腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链dna缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(itr)中的cap和rep基因。itrs对于病毒的复制和包装具有决定性作用，cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。aav能感染多种细胞，rep基因产物存在时，病毒dna很容易整合到人类第19号染色体。
3.重组腺相关病毒载体(raav)是由野生型腺相关病毒(aav)改造而来，raav基因组仅包含aav两端的末端重复序列(itr)，所含外源基因完全替代了病毒自身编码基因。通过在包装细胞系中反式补偿aav的复制基因rep、结构基因cap和包装辅助基因可制备获得raav。
4.重组腺相关病毒载体(raav)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，raav被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)，同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
5.目前已注册的aav种类总数已超过196种，灵长类动物体内有13种不同血清型的aav(即aav1-aav13)，其中aav2、aav3、aav9源自人类本身，不同的raav亚型对人体组织有不同的亲和性，而且每个亚型的raav其分离纯化方法也是不同的。raav9对心脏，肌肉，肺(肺泡)，肝脏及中枢神经有较好的亲和性，且其特殊之处在于raav9可穿过血脑屏障。但是目前国内关于纯化raav9的研究并不多，且其存在着纯化过程繁琐、杂蛋白含量较多、纯度低、回收率低的问题。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的目的在于提供一种raav9的分离纯化方法。
7.本发明采用如下技术方案：本发明提供一种腺相关病毒raav9的分离纯化方法，包括以下步骤：
8.将包含raav9的液相组合物，调节ph至中性，过滤；
9.肝素亲和层析：采用带有肝素的层析介质对过滤后的液相组合物进行亲和层析，收集流穿液并浓缩；
10.凝胶过滤层析：将浓缩后的流穿液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，即得。
11.作为本发明的一种实施方式，肝素亲和层析的填料为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm。
12.作为本发明的一种实施方式，所述层析介质为汇研生物heparin focurose 6ff。
13.作为本发明的一种实施方式，亲和层析所用的平衡液为8～12mm pb，ph 7.0。
14.作为本发明的一种实施方式，亲和层析所用的洗脱液为8～12mm pb，2.0m nacl，ph 7.0。
15.作为本发明的一种实施方式，凝胶过滤层析所用的填料为高度交联的琼脂糖和葡聚糖，或高度交联4％的琼脂糖。
16.作为本发明的一种实施方式，凝胶过滤层析所用的平衡液和缓冲液为15～25mm pb，0.1～0.2m nacl，ph7.0。
17.作为本发明的一种实施方式，液相组合物采用0.45μm的膜过滤。
18.作为本发明的一种实施方式，所述液相组合物为细胞裂解液或细胞培养上清液。
19.本发明所提供的腺相关病毒raav9纯化方法能够很好的分离纯化raav9，分离后的raav9纯度能够达到95％以上，回收率至少能够达到78％以上，当采用汇研生物heparin focurose 6ff作为第一步的纯化介质进行纯化时，其收率能达到96％以上。
附图说明
20.图1为本发明实施例1中亲和层析后的纯化图谱，其中l1为流穿1，l2为流穿2，l3为流穿3，l4为流穿4，e1为洗脱1，e2为洗脱2，e3为洗脱3，e4为洗脱4；
21.图2为本发明实施例1中亲和层析后的电泳图，其中mr为marker，泳道1为全液(未离心过滤)，泳道2为原液(离心过滤后)，泳道3为流穿1，泳道4为流穿2，泳道5为流穿2浓缩液，泳道6为流穿3，泳道7为流穿3浓缩液，泳道8为流穿4，泳道9流穿4浓缩液，泳道10为洗脱1，泳道11为洗脱2，泳道12为洗脱3，泳道13为洗脱4；
22.图3为本发明实施例1中凝胶过滤层析后的纯化图谱，其中e1为洗脱1，e2为洗脱2，e3为洗脱3，e4为洗脱4，e5为洗脱5，e6为洗脱6，e7为洗脱7；
23.图4为本发明实施例1中凝胶过滤层析后的电泳图，其中mr为marker，泳道1为洗脱1浓缩液，泳道2为洗脱2浓缩液，泳道3为洗脱3浓缩液，泳道4为洗脱4，泳道5为洗脱5，泳道6为洗脱6，泳道7为洗脱7；
24.图5为本发明实施例2中凝胶过滤层析后的纯化图谱，其中e1为洗脱1，e2为洗脱2，e3为洗脱3，e4为洗脱4；
25.图6为本发明实施例2中凝胶过滤层析后的电泳图，其中mr为marker，泳道1为原液，泳道2为原液浓缩滤出液，泳道3为洗脱1浓缩液，泳道4为洗脱2浓缩液，泳道5为洗脱3浓缩液，泳道6为洗脱4。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
27.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
28.实施例1
29.本实施例提供一种腺相关病毒raav9的分离纯化方法，包括以下步骤：
30.(1)收集含有raav9的sf9昆虫细胞上清液，将上清液用纯化水稀释4倍左右，调节ph至7.0后，0.45μm膜过滤；
31.(2)肝素亲和层析：采用heparin focurose 6ff(汇研生物，介质为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm，平均粒径约为90μm)作为层析柱，用10mm pb，ph7.0的平衡液平衡10个柱体积以上，流速为60cm/h；
32.将处理后的昆虫细胞上清液以30cm/h的流速进行上样，根据病毒滴度一般上样20个柱体积，流速为30cm/h，收集流穿峰；上样结束后以平衡液清洗层析柱20个柱体积，流速为60cm/h；采用盐浓度线性梯度洗脱的方式，盐溶液由0m nacl(0％b)在15个柱体积时间内线性逐步上升至2m nacl(100％b)，流速为60cm/h，收集洗脱峰；
33.(3)凝胶过滤层析：将步骤(2)中纯化得到的流穿峰合并，以100kd超滤杯浓缩约15倍左右待用，超滤离心参数为6140rpm、8min、4℃，并采用0.45μm膜过滤后备用；
34.采用focudex 200pg(汇研生物，介质为高度交联的琼脂糖和葡聚糖，粒径范围为25～45μm，平均粒径约为34μm)作为层析柱，用20mm pb，0.15m nacl，ph 7.0平衡液平衡1.5个柱体积，流速为60cm/h；将浓缩处理后的流穿液以30cm/h的流速进行上样，一般上样2ml，上样流速30cm/h；采用洗脱液20mm pb，0.15m nacl，ph 7.0以30cm/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；
35.(4)检测：将收集到的洗脱液进行sds-page电泳检测纯度以及荧光定量pcr测病毒滴度方式检测回收率。
36.通过sds-page电泳实验发现：raav9的三个结构蛋白纯度为95％以上，通过荧光定量pcr滴度检测回收率为104.76％。
37.实施例2
38.本实施例提供一种腺相关病毒raav9的分离纯化方法，包括以下步骤：
39.(1)收集含有raav9的sf9昆虫细胞上清液，将上清液用纯化水稀释4倍左右，调节ph至7.0后，0.45μm膜过滤；
40.(2)肝素亲和层析：采用heparin focurose 6ff(汇研生物，介质为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm，平均粒径约为90μm)作为层析柱，用10mm pb，ph7.0的平衡液平衡10个柱体积以上，流速为60cm/h；
41.将处理后的昆虫细胞上清液以30cm/h的流速进行上样，根据病毒滴度一般上样20个柱体积，流速为30cm/h，收集流穿峰；上样结束后以平衡液清洗层析柱20个柱体积，流速为60cm/h；采用盐浓度线性梯度洗脱的方式，盐溶液由0m nacl(0％b)在15个柱体积时间内线性逐步上升至2m nacl(100％b)，流速为60cm/h，收集洗脱峰；
42.(3)凝胶过滤层析：将步骤(2)中纯化得到的流穿峰合并，以100kd超滤杯浓缩约15倍左右待用，超滤离心参数为6140rpm、8min、4℃，并采用0.45μm膜过滤后备用；
43.采用focurose 4ff(汇研生物，介质为高度交联4％的琼脂糖，粒径范围为45-165μm，平均粒径约为90μm)作为层析柱，用20mm pb，0.15m nacl ph 7.0平衡液平衡1.5个柱体积，流速为60cm/h；将浓缩处理后的流穿液以30cm/h的流速进行上样，一般上样2ml，上样流速30cm/h；采用洗脱液20mm pb，0.15m nacl ph 7.0以30cm/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。
44.(4)检测：将收集到的洗脱液进行sds-page电泳检测纯度以及荧光定量pcr测病毒滴度方式检测回收率。
45.通过sds-page电泳实验发现：raav9的三个结构蛋白纯度为95％以上，通过荧光定量pcr滴度检测回收率为96.73％。
46.实施例3
47.本实施例与实施例1的区别在于：将步骤(2)中的heparin focurose 6ff(汇研生物，介质为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm，平均粒径约为90μm)层析柱替换为heparin sepharose 6fastflow(cytica，介质为高度交联6％的琼脂糖，平均粒径约为90μm)层析柱，其余步骤与实施例1相同。
48.检测得到：raav9的纯度为95％以上，回收率为78.15％。
49.实施例4
50.本实施例与实施例2的区别在于：将步骤(2)中的heparin focurose 6ff(汇研生物，介质为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm，平均粒径约为90μm)层析柱替换为heparin sepharose 6fastflow(cytica，介质为高度交联6％的琼脂糖，平均粒径约为90μm)层析柱，其余步骤与实施例1相同。
51.检测得到：raav9的纯度为95％以上，回收率为87.44％。
52.对比例1
53.本对比例与实施1的区别在于，分离纯化的对象为腺相关病毒raav2，具体操作步骤与实施例1相同。
54.检测得到：raav2的纯度为10％以下(未达到纯化效果)，回收率为58.62％。
55.对比例2
56.本对比例与实施例2的区别在于，分离纯化的对象为腺相关病毒raav2，具体操作步骤与实施例2相同。
57.检测得到：raav2的纯度为10％以下(未达到纯化效果)，回收率为62.28％。
58.上述实施例中，纯度、回收率以及蛋白去除率的计算方法如下：
59.纯度：sds-page电泳检测raav三个结构蛋白灰度值总占比
60.回收率(％)＝【纯化后样品滴度(vg/ml)*体积(ml)】/【纯化前样品滴度(vg/ml)*体积(ml)】*100％；
61.蛋白去除率(％)＝1-【纯化后样品总蛋白浓度(mg/ml)*体积(ml)】/【纯化前样品总蛋白浓度(mg/ml)*体积(ml)】*100％；
62.备注：样品滴度检测用荧光定量pcr法。
63.样品总蛋白检测用bradford法(考马斯亮蓝染色法)。
64.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。