在微生物中生物合成香叶木素和/或橙皮素的方法与流程

1.本发明涉及一种生产香叶木素和橙皮素的方法。


背景技术：

2.香叶木素和橙皮素分别是o
‑
甲基化的黄酮和o
‑
甲基化的黄烷酮。这些化合物本身令人感兴趣，并且也作为用于生产其他感兴趣的分子的生物合成中间体令人感兴趣。
3.因此，对香叶木素和橙皮素的生物合成方法，存在着未满足的需求。


技术实现要素：

4.本发明人开发了香叶木素和橙皮素在微生物中的生物合成。
5.因此，本发明涉及一种重组微生物用于生产香叶木素和/或橙皮素的用途，所述重组微生物包含编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列。
6.本发明还涉及一种重组微生物，其包含编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述微生物是酵母。
7.在一个实施方式中，所述o
‑
甲基转移酶(omt)是来自于智人(homo sapiens)的o
‑
甲基转移酶(omt)。
8.在另一个实施方式中，所述o
‑
甲基转移酶(omt)选自包含序列seq id no：89的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
9.在另一个实施方式中，所述o
‑
甲基转移酶(omt)是来自于拟南芥(arabidopsis thaliana)的o
‑
甲基转移酶(omt)。
10.在另一个实施方式中，所述o
‑
甲基转移酶(omt)选自包含序列seq id no：87的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
11.在优选实施方式中，所述o
‑
甲基转移酶(omt)是来自于柑橘属(citrus)，特别是克莱门柚(citrus clementina)或甜橙(citrus sinensis)的o
‑
甲基转移酶(omt)。特别地，所述o
‑
甲基转移酶(omt)可以选自：包含选自seq id no：91和93的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。优选地，所述o
‑
甲基转移酶(omt)选自：包含选自seq id no：91的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。根据另一个优选的可选方案，所述o
‑
甲基转移酶(omt)选自：包含选自seq id no：93的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
12.优选地，所述微生物还包含编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的异源或内源核酸序列。
13.优选地，所述微生物还包含编码黄酮合酶(fns)、特别是能够从圣草酚产生木犀草
素的黄酮合酶的内源或异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)优选地来自于拟南芥、荷兰芹(petroselinum crispum)、玉米(zea mays)、金银花(lonicera japonica)、灰毡毛忍冬(lonicera macranthoides)、翠菊(callistephus chinensis)、芹菜(apium graveolens)、蒺藜状苜蓿(medicago truncatula)、孜然(cuminum cyminum)、毒欧芹(aethusa cynapium)、圆叶当归(angelica archangelica)、毒芹(conium maculatum)、茶树(camellia sinensis)、朝鲜蓟(cynara cardunculus var scolymus)、水母雪莲(saussurea medusa)、毛喉鞘蕊花(plectranthus barbatus)、黄芩(scutellaria baicalensis)、旋蒴苣苔(dorcoceras hygrometricum)、金鱼草(antirrhinum majus)、回回苏(perilla frutescens var crispa)、大丽花(dahlia pinnata)或erythranthe lewisii。所述黄酮合酶(fns)可以选自：包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。根据优选实施方式，所述黄酮合酶(fns)选自：包含选自seq id no：37、33和35、优选为seq id no：37的序列的酶和包含与这些序列之一、优选与seq id no：37具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
14.优选地，所述微生物还包含：
15.‑
编码酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列；和/或编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列和编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列；
16.‑
编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列；
17.‑
编码查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列；
18.‑
编码查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列；
19.‑
编码黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列；和
20.‑
任选的，编码能够将酪氨酸转变成l
‑
dopa并且也将对香豆酸转变成咖啡酸的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶的异源核酸序列；或编码能够将对香豆酸转变成咖啡酸的对香豆酸3
‑
羟化酶的异源核酸序列。
21.具体来说，所述微生物可以包含：
22.‑
编码酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)来自于黏红酵母(rhodotorula glutinis)或约氏黄杆菌(flavobacterium johnsoniae)，特别是包含选自seq id no：41和39的序列的tal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
23.‑
编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)来自于拟南芥、克莱门柚、荷兰芹或棒状链霉菌(streptomyces clavuligerus)，特别是包含选自seq id no：97、99、43、45、47和49的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：97、99和45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列
并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；
24.‑
编码查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)来自于甜橙、大麦(hordeum vulgare)或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：53、51、55和57的序列的chs和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；和
25.‑
编码查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)来自于拟南芥或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：61和59的序列的chi和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：61的序列的chi和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽；和
26.‑
编码黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)来自于翠菊、回回苏(perilla frutescens var.crispa)、矮牵牛(petunia x hybrida)、非洲菊(gerbera hybrida)、甜橙、拟南芥、山柳兰(pilosella officinarum)、蓝眼菊(osteospermum hybrid cultivar)、黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)、克莱门柚或阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)，优选为包含选自seq id no：7、1、3、5、9、11、13、15、17、19、21和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选地选自具有seq id no：7、11、17和95的酶和与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。
27.优选地，所述微生物还包含编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源或内源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)特别是具有选自seq id no：25、23、27、29和31的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是选自：包含选自seq id no：25的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽。
28.在优选实施方式中，所述微生物是酵母属(saccharomyces)的酵母，特别是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
29.本发明还涉及本专利申请中所定义的微生物用于生产香叶木素和/或橙皮素的用途。
30.本发明还涉及一种生产香叶木素和/或橙皮素的方法，所述方法包括培养本专利申请中所定义的微生物和任选地收获所述香叶木素和/或橙皮素。
31.优选地，在使用根据本发明所述的微生物生产香叶木素和/或橙皮素期间或在根据本发明所述的方法中，不向培养基供应柚皮素、芹菜素、圣草酚和/或木犀草素。
具体实施方式
32.因此，本发明人探索了几条生物合成途径，并成功开发了橙皮素和/或香叶木素在
微生物中的生物合成。具体来说，橙皮素和/或香叶木素可以从圣草酚和/或木犀草素通过4’位中的甲基化来获得。
33.圣草酚和木犀草素在5、7、3’和4’位中带有至少两个能够被甲基化的羟基。因此，在优选实施方式中，所述酵母包含编码细胞色素p450还原酶这种nadph
‑
细胞色素p450还原酶的异源或内源核酸。这种酶属于ec 1.6.2.4类别。因此，需要鉴定尤其是相对于5、7和3’位中的羟基能够特异性甲基化4’位中的羟基的甲基化酶。
34.甲基化酶在自然界中大量存在，并代表了一大类底物难以限定的酶。许多以黄酮和黄烷酮作为底物的甲基化酶在7位中引入甲基。其他甲基化酶导致产生在7、3’和4’位中含有多个甲基化的化合物的混合物。值得注意的是，芳香族儿茶酚类化合物的甲基化的位置特异性通常是在间位(3’或5’位)中，很少在对位即4’位中(pandey等，2016,biotechnol.adv.,34,634
‑
662)。
35.似乎对4’位显示出特异性的唯一的酶是来自于大豆(glycine max)的酶somt
‑
2，其能够在大肠埃希氏杆菌中特别是在4’位中甲基化包括芹菜素和柚皮素在内的几种黄酮类化合物(kim等，2005,journal of biotechnology 119:155
–
162)。然而，它接受圣草酚和/或木犀草素的能力未知。此外，本发明人观察到这种酶在酵母中不起作用。
36.因此，需要鉴定能够在圣草酚和/或木犀草素的4’位中引入甲基的甲基化酶，并且本发明人成功地鉴定到此类o
‑
甲基转移酶(omt)。
37.定义
38.术语“微生物”是指单细胞生物体。优选地，所述微生物是细菌或酵母。
39.术语“重组微生物”是指在自然界中不存在，并含有在一个或多个异源遗传元件的插入、修饰或缺失后被修饰的基因组的微生物。
40.术语“重组核酸”是指已被修饰并且不存在于天然微生物中的核酸。例如，该术语可以是指操作性连接到不是天然启动子的启动子的编码序列或基因。它还可以是指对于包含外显子和内含子的基因来说其中内含子已被缺失的编码序列。
41.术语“异源”意味着所述基因已通过遗传工程引入到所述细胞中。它在其中可能以游离体或染色体形式存在。所述基因的起源可能与它被引入到其中的细胞不同。然而，所述基因也可以起源于与它被引入到其中的细胞相同的物种，但它由于非天然的环境而被认为是异源的。例如，所述基因或核酸序列是异源的，因为它在其天然启动子之外的启动子控制之下，它被引入到的位置不同于它天然所处的位置。在引入异源基因之前，宿主细胞可以含有所述基因的内源拷贝，或者它可以不含内源拷贝。此外，核酸序列可能在为了在宿主微生物中表达而将编码序列优化的意义上是异源的。优选地，在本文中，异源核酸序列编码对宿主细胞来说异源的蛋白质，即不天然存在于酵母中的蛋白质。
42.当在本文中使用时，相对于宿主微生物，术语“本源”或“内源”是指天然存在于所述微生物中的遗传元件或蛋白质。
43.术语“基因”是指编码蛋白质的任何核酸。术语“基因”覆盖dna例如cdna或gdna，也覆盖rna。基因可以首先通过重组、酶和/或化学技术制备，随后在宿主细胞或体外系统中复制。基因通常包含编码所需蛋白质的开放阅读框。基因可能含有其他序列例如转录终止子或信号肽。
44.作为遗传密码简并性的结果，特定多肽可能被几种核酸编码。因此，给定多肽的编
码序列中的密码子可以被修饰，以便在特定微生物中获得最佳表达，例如通过使用对该微生物适合的密码子转换表。核酸也可以根据特定酵母的优选gc含量进行优化，和/或被优化以减少重复序列的数目。在某些实施方式中，异源核酸被密码子优化，以在所涉及的微生物中表达。密码子优化可以通过本领域中已知的常规方法来进行(参见例如welch,m.等，(2011)，methods in enzymology 498:43
‑
66)。
45.术语“操作性连接”是指一种配置，其中将控制序列放置在相对于编码序列适合的位置中，使得所述控制序列控制所述编码序列的表达。
46.术语“控制序列”是指基因的表达所需的核酸序列。控制序列可以是本源或异源的。本领域技术人员公知且目前使用的控制序列是优选的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。优选地，所述控制序列包含启动子和转录终止子。
47.术语“表达盒”是指包含操作性连接的编码区(即基因)和调控区(即包含一个或多个控制序列的区域)的核酸构建物。优选地，所述控制序列适合于在所述宿主微生物中使用。
48.当在本文中使用时，术语“表达载体”是指包含表达盒的dna或rna分子。优选地，表达载体是线性或环状双链dna分子。所述载体也可以包含复制原点、选择标志物等。
49.出于本发明的目的，术语两个核酸序列或氨基酸序列之间的“同一性百分率”打算是指在最佳比对后获得的待比较的两个序列之间一致的核苷酸或氨基酸残基的百分率，该百分率是纯粹统计性的，并且所述两个序列之间的差异随机地并在它们的整个长度上分布。最佳比对或最适比对是使如下所述计算的待比较的两个序列之间的同一性百分率最高的比对。两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较常规通过在这些序列已被最适对齐后比较它们来进行，所述比较按照区段或比较窗口来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。出于确定氨基酸序列同一性百分率的目的的比对可以以本领域中公知的各种不同方式进行，例如通过使用可以在互联网上获得的计算机软件，例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/。本领域技术人员可以为测量所述比对确定适合的参数，包括为了在所比较的序列的整个长度内获得最大对齐所需的算法。出于本发明的目的，氨基酸序列同一性百分率的值是指使用emboss needle成对序列比对程序产生的值，所述程序利用needleman
‑
wunsch算法产生两个序列的最适全局比对，其中所有搜索参数由默认以下参数定义：符号矩阵＝blosum62，开放空位＝10，延长空位＝0.5，末端空位罚分＝假，开放末端空位＝10和延长末端空位＝0.5。在某些实施方式中，在本专利申请中提到的所有同一性百分率可以被设定在至少60％、至少70％、至少80％、至少85％，优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性。具体来说，其中所有酶的序列同一性百分率为至少80％或至少85％、优选地至少90％或至少95％序列同一性的实施方式被认为已被描述。
50.在一个实施方式中，所述多肽相对于在seq id no中描述的序列可能具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个添加、替换或缺失。具体来说，这些添加、替换或缺失被引入在n
‑
端末端、c
‑
端末端或两个末端处。
51.所述多肽可以任选地采取融合蛋白的形式。
52.当在本文中使用时，术语“过表达”和“提高的表达”可互换使用，并且意味着相对
于未修饰的微生物例如野生型微生物或不包含本文中描述的遗传修饰的微生物，基因或酶的表达提高。术语“野生型”是指自然界中存在的未修饰的微生物。酶的提高的表达通常通过提高编码所述酶的基因的表达来获得。在其中所述基因或酶不天然存在于本发明的微生物中，即异源基因或酶的实施方式中，术语“过表达”和“表达”可互换使用。为了提高基因的表达，本领域技术人员可以使用任何已知的技术，例如提高所述基因在所述微生物中的拷贝数，使用诱导所述基因的高水平表达的启动子即强启动子，使用使相应的信使rna稳定的元件或螯合核糖体结合位点(rbs)及其周围序列的序列。具体来说，过表达可以通过提高所述基因在所述微生物中的拷贝数来获得。可以通过本领域技术人员已知的重组方法将所述基因的一个或多个拷贝引入到基因组中，包括基因的替换或多拷贝整合(参见例如国际专利申请wo 2015/092013)。优选地，将包含优选地置于强启动子控制之下的所述基因的表达盒整合到基因组中。作为变化形式，所述基因可以由表达载体、优选为质粒携带，所述载体包含具有优选地置于强启动子控制之下的所述感兴趣的基因的表达盒。取决于复制原点的性质，所述表达载体可以以一个或多个拷贝存在于所述微生物中。基因的过表达也可以通过使用诱导所述基因的高水平表达的启动子来获得。例如，可以将内源基因的启动子用更强的启动子，即诱导更高表达水平的启动子代替。所述在不是天然启动子的启动子控制之下的内源基因被称为异源核酸。适合用于本发明的启动子对于本领域技术人员来说是已知的，并且可以是组成型或诱导型的，并且可以是内源或异源的。
53.术语“包含”也意味着“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”。术语“基本上由
……
组成”意味着所述序列相对于seq id no中描述的序列可能含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个添加、替换或缺失。
54.微生物
55.根据本发明所述的微生物可以是真核或原核微生物。
56.在第一实施方式中，所述微生物是真核生物。优选地，它是酵母目、锁掷酵母目和裂殖酵母目的酵母。所述酵母可以例如选自毕赤酵母(pichia)、克鲁维酵母(kluyveromyces)、酵母(saccharomyces)、裂殖酵母(schizosaccharomyces)、假丝酵母(candida)、油脂酵母(lipomyces)、红酵母(rhodotorula)、红冬孢酵母(rhodosporidium)、耶氏酵母(yarrowia)或德巴利氏酵母(debaryomyces)属。在一个实施方式中，所述酵母选自巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(saccharomyces carlsbergensis)、糖化酵母(saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母(saccharomyces douglasii)、克氏酵母(saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(saccharomyces norbensis)、卵形酵母(saccharomyces oviformis)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、白假丝酵母(candida albicans)、热带假丝酵母(candida tropicalis)、黏红酵母、圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、汉氏德巴利氏酵母(debaryomyces hansenii)和斯达氏油脂酵母(lipomyces starkeyi)。在优选实施方式中，所述微生物是酵母属酵母，优选为酿酒酵母。可选地，所述微生物可以是真菌，优选为丝状真菌。优选地，它选自曲霉(aspergillus)、木霉(trichoderma)、脉孢菌(neurospora)、柄孢壳菌(podospora)、内座壳(endothia)、毛霉(mucor)、旋孢腔菌(cochiobolus)或梨孢霉(pyricularia)属。优选地，所述真菌选自构巢
曲霉(aspergillus nidulans)、黑曲霉(aspergillus niger)、aspergillus awomari、米曲霉(aspergillus oryzae)、土曲霉(aspergillus terreus)、粗糙脉孢菌(neurospora crassa)、里氏木霉(trichoderma reesei)和绿色木霉(trichoderma viride)。
57.在第二实施方式中，所述微生物是原核生物。优选地，它是细菌，尤其是选自酸杆菌门(acidobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、产水菌门(aquificae)、拟杆菌门(bacterioidetes)、衣原体门(chlamydiae)、绿菌门(chlorobi)、绿弯菌门(chloroflexi)、产金菌门(chrysiogenetes)、蓝藻门(cyanobacteria)、脱铁杆菌门(deferribacteres)、栖热异常球菌门(deinococcus
‑
thermus)、网团菌门(dictyoglomi)、纤维杆菌门(fibrobacteres)、厚壁菌门(firmicutes)、梭杆菌门(fusobacteria)、芽单胞菌门(gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(nitrospirae)、浮霉菌门(planctomycetes)、变形菌门(proteobacteria)、螺旋体门(spirochaetes)、热脱硫杆菌门(thermodesulfobacteria)、热微菌门(thermomicrobia)、热袍菌门(thermotogae)或疣微菌门(verrucomicrobia)。优选地，所述细菌属于acaryochloris、醋酸杆菌属(acetobacter)、放线杆菌属(actinobacillus)、土壤杆菌属(agrobacterium)、脂环酸芽胞杆菌属(alicyclobacillus)、鱼腥藻属(anabaena)、倒囊藻属(anacystis)、厌氧螺菌属(anaerobiospirillum)、产水菌属(aquifex)、节杆菌属(arthrobacter)、节螺藻属(arthrospira)、固氮菌属(azobacter)、芽孢杆菌属(bacillus)、短杆菌属(brevibacterium)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、绿菌属(chlorobium)、着色菌属(chromatium)、绿棒菌属(chlorobaculum)、梭菌属(clostridium)、棒杆菌属(corynebacterium)、贪铜菌属(cupriavidus)、蓝丝菌属(cyanothece)、肠杆菌属(enterobacter)、异常球菌属(deinococcus)、欧文氏菌属(erwinia)、埃希氏杆菌属(escherichia)、地杆菌属(geobacter)、粘杆菌属(gloeobacter)、葡糖杆菌属(gluconobacter)、氢杆菌属(hydrogenobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、曼氏杆菌属(mannheimia)、生根瘤菌属(mesorhizobium)、甲基杆菌属(methylobacterium)、微杆菌属(microbacterium)、微囊藻属(microcystis)、硝化杆菌属(nitrobacter)、亚硝化单胞菌属(nitrosomonas)、硝化刺菌属(nitrospina)、硝化螺菌属(nitrospira)、念珠藻属(nostoc)、席藻属(phormidium)、原绿球藻属(prochlorococcus)、假单胞菌属(pseudomonas)、罗尔斯通氏菌属(ralstonia)、根瘤菌属(rhizobium)、红杆菌属(rhodobacter)、红球菌属(rhodococcus)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、红螺菌属(rhodospirillum)、沙门氏菌属(salmonella)、栅列藻属(scenedesmun)、沙雷氏菌属(serratia)、志贺氏菌属(shigella)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链霉菌属(streptomyces)、聚球藻属(synechoccus)、集胞藻属(synechocystis)、thermosynechococcus、束毛藻属(trichodesmium)或发酵单胞菌属(zymomonas)。更优选地，所述细菌选自根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)、产琥珀酸厌氧螺菌(anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(actinobacillus succinogenes)、aquifex aeolicus、aquifex pyrophilus、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(brevibacterium ammoniagenes)、brevibacterium immariophilum、巴氏梭菌(clostridium pasteurianum)、扬氏梭菌(clostridium ljungdahlii)、丙酮丁醇梭菌
(clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(clostridium beigerinckii)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、cupriavidus necator、耐金属贪铜菌(cupriavidus metallidurans)、阪崎肠杆菌(enterobacter sakazakii)、大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)、氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)、嗜热氢杆菌(hydrogenobacter thermophilus)、产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、产琥珀酸曼氏杆菌(mannheimia succiniciproducens)、百脉根中生根瘤菌(mesorhizobium loti)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、pseudomonas mevalonii、pseudomonas pudica、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、埃特里根瘤菌(rhizobium etli)、荚膜红杆菌(rhodobacter capsulatus)、类球红杆菌(rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌(rhodospirillum rubrum)、肠沙门氏菌(salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌(shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(shigella flexneri)、宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)、acaryochloris marina、多变鱼腥藻(anabaena variabilis)、钝顶节旋藻(arthrospira platensis)、极大节旋藻(arthrospira maxima)、chlorobium tepidum、绿棒菌(chlorobaculum sp.)、蓝丝菌(cyanothece sp.)、gloeobacter violaceus、铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)、点形念珠藻(nostoc punctiforme)、prochlorococcus marinus、细长聚球藻(synechococcus elongatus)、集胞藻(synechocystis sp.)、thermosynechococcus elongatus、红海束毛藻(trichodesmium erythraeum)和沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)。在优选实施方式中，所述微生物是大肠埃希氏杆菌，例如大肠埃希氏杆菌bl21、大肠埃希氏杆菌bl21(de3)、大肠埃希氏杆菌mg1655或大肠埃希氏杆菌w3110及其衍生株。在可选实施方式中，所述微生物是链霉菌属细菌，特别是委内瑞拉链霉菌(streptomyces venezuelae)。
58.所述微生物可能已被修饰，以提高酪氨酸和/或苯丙氨酸、优选为酪氨酸的生产。尤其是可以将负责酪氨酸和/或苯丙氨酸、优选为酪氨酸的生产的反馈抑制的基因失活。可选地或累加地，可以将用于酪氨酸和/或苯丙氨酸、优选为酪氨酸的生物合成的途径优化，尤其是通过将碳流从其他代谢途径重新导向酪氨酸和/或苯丙氨酸、优选为酪氨酸的代谢途径。这些修饰和这些基因对于本领域技术人员来说是公知的(参见us 8,809,028；pandey等，2016,biotechnol.adv.,34,634
‑
662).。
59.因此，在一个实施方式中，所述微生物产生大量酪氨酸和/或苯丙氨酸，特别是从简单碳源例如葡萄糖。
60.使产生橙皮素和/或香叶木素成为可能的修饰
61.对根据本发明所述的重组微生物进行修饰，以产生橙皮素和/或香叶木素。尤其是，为了使所述微生物能够从圣草酚和/或木犀草素分别合成橙皮素和/或香叶木素，对所述微生物进行修饰，以引入能够将圣草酚和/或木犀草素的4’位中的羟基甲基化，优选地将圣草酚和/或木犀草素的4’位中的羟基特异性甲基化的酶。
62.在第一实施方式中，所述重组微生物能够产生圣草酚和/或木犀草素：具体来说，
它已为此目的进行了修饰。在可选实施方式中，可以向所述微生物提供圣草酚和/或木犀草素，例如通过向培养基添加这些化合物。
63.在特定实施方式中，所述微生物产生橙皮素。然后可以通过化学转化、尤其是通过氧化或生物化学转化从橙皮素制备香叶木素。
64.在优选实施方式中，所述微生物产生橙皮素和香叶木素。
65.因此，所述重组微生物包含能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化，优选地能够将圣草酚和/或木犀草素的4’位中的羟基特异性甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)，以便最小化两个羟基的双重甲基化或另一个羟基的甲基化的可能性。
66.omt：o
‑
甲基转移酶
67.o
‑
甲基转移酶(omt)是一个非常大的酶家族，具有难以定义的靶。本发明人必须鉴定和选择能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位(对位)中甲基化的o
‑
甲基转移酶。
68.优选地，所述酶被选择成对圣草酚和/或木犀草素的4’位中的甲基化具有偏好性。在优选实施方式中，所述酶特异性针对圣草酚和/或木犀草素的4’位。术语“特异的”意味着由所述酶在圣草酚和/或木犀草素上引入的甲基在60％的情况下、优选地在70％的情况下、甚至更优选地在80％的情况下存在于4’位中，在其余情况下被引入到3’位中。
69.术语“4
’‑
o
‑
甲基转移酶活性”意味着通过4
’‑
o
‑
甲基转移酶将4
’‑
羟基黄酮类化合物转化成4
’‑
甲氧基黄酮类化合物。为了确定是否存在4
’‑
o
‑
甲基转移酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由4
’‑
o
‑
甲基转移酶、4
’‑
羟基黄酮类化合物和s
‑
腺苷
‑
l
‑
甲硫氨酸组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定的温育时间后，在uplc
‑
ms中观察4
’‑
甲氧基黄酮类化合物的出现，并与预期的标准品进行比较。
70.在本发明的情况下，所述4
’‑
羟基黄酮类化合物是圣草酚或木犀草素，它们将分别被转化成它们的4
’‑
甲氧基黄酮类化合物形式，即橙皮素或香叶木素。
71.因此，所述微生物可以包含编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶的异源核酸序列。
72.这种酶仅存在于高等真核生物，特别是植物中。
73.在一个实施方式中，所述o
‑
甲基转移酶(omt)是来自于拟南芥的酶。在另一个实施方式中，所述o
‑
甲基转移酶(omt)源自于高等真核生物，优选地来自于哺乳动物。特别地，所述o
‑
甲基转移酶(omt)是人类(智人)起源的。
74.在特定实施方式中，所述omt选自：包含选自seq id no：87和89的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
75.在一个实施方式中，所述omt选自：包含选自seq id no：89的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
76.在另一个实施方式中，所述omt选自：包含选自seq id no：87的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
77.因此，所述omt可以来自于拟南芥。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号nm_118755.4和np_567739.1下。所述蛋白质也描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号q9c5d7下，更特别是在seq id no：87中。
78.可选地，所述omt来自于智人。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，
分别在参考编号nm_007310.2和np_009294.1下。所述蛋白质也描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号p21964下，更特别是在seq id no：89中。
79.所述来自于智人的omt具有接受圣草酚和木犀草素作为甲基化底物的优点，而来自于拟南芥的omt对圣草酚具有强烈偏好性。相反，如果希望相对于香叶木素更有利于橙皮素的合成，则来自于拟南芥的omt可能具有优势。
80.在优选实施方式中，所述omt是来自于柑橘属，特别是克莱门柚或甜橙的omt。在特别优选实施方式中，所述omt选自：包含选自seq id no：91和93的序列的酶和与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
81.优选地，所述omt选自：包含选自seq id no：91的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
82.可选地，所述omt选自：包含选自seq id no：93的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
83.上述来自于柑橘属和拟南芥的omt具有将圣草酚在4’位中特异性甲基化的优点。
84.在所述微生物的设计期间，本发明人观察到该甲基化步骤构成限速步骤之一。令人吃惊的是，尽管在所述微生物、特别是酵母中存在辅因子s
‑
腺苷
‑
l
‑
甲硫氨酸，但添加增加这种辅因子的合成的酶可以消除这个步骤的限制特点。因此，在优选实施方式中，所述微生物还包含编码合成s
‑
腺苷
‑
l
‑
甲硫氨酸的酶s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的异源或内源序列。这种酶属于ec 2.5.1.6类别。
85.在一个实施方式中，所述微生物包含编码具体来说能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列和编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的异源或内源核酸序列。
86.在一个实施方式中，所述samt源自于酵母，特别是酿酒酵母，最特别地所述微生物是酵母。
87.在特定实施方式中，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶是包含选自seq id no：81的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶活性的多肽。
88.例如，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶可以来自于酿酒酵母。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号nm_001180810.3下，蛋白质序列在编号np_010790.3下。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号p19358下。
89.在一个实施方式中，将编码如上所定义的samt的序列的新拷贝引入到所述微生物中。在另一个实施方式中，当所述微生物是酿酒酵母时，将编码samt的内源基因的启动子用强启动子代替。因此，相对于野生型微生物所述samt的表达提高；因此，所述samt在所述修饰的微生物中过表达。
90.因此，在优选实施方式中，所述微生物包含编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶的异源核酸序列和编码能够产生s
‑
腺苷
‑
l
‑
甲硫氨酸的s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的异源或内源核酸序列。
91.f3’h：黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶
92.为了从柚皮素/芹菜素制备橙皮素和/或香叶木素，几种生物合成策略是可行的。事实上，需要制造两个修饰：4’位中羟基的甲基化和3’位的羟基化。因此，为了提高4’位中
羟基的甲基化的特异性，似乎符合逻辑的是首先进行已经存在的羟基的甲基化，然后在3’位中添加第二个羟基。相反，本发明人得出结论，必需首先进行羟基化，然后再甲基化，尽管存在由于第二个羟基的引入而造成的甲基化特异性问题的风险。
93.为此，本发明人必须鉴定和选择能够接受柚皮素和/或芹菜素作为底物并且在这些化合物的3’位中添加羟基的酶。优选地，所述酶被选择成对柚皮素和/或芹菜素的3’位中的羟基化具有偏好性。在优选实施方式中，所述酶特异性针对柚皮素和/或芹菜素的3’位，特别是为了避免在3’和5’位中的双重羟基化，并且优选地也避免5’位中的羟基化。
94.黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)是执行在柚皮素和/或芹菜素的3’位中添加羟基的酶。这种酶属于ec 1.14.14.82类别。它也被称为黄酮类化合物3
’‑
羟化酶。
95.术语“黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性”意味着通过cpr依赖性f3’h酶将黄酮类化合物转化成3
’‑
羟化的黄酮类化合物。为了确定是否存在黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶在nad(p)h、o2和黄酮类化合物存在下，在最适条件(ph、离子等)下体外温育，通过uplc
‑
ms观察3
’‑
羟化的黄酮类化合物的出现，并与预期的标准品进行比较。优选地，所述黄酮类化合物是柚皮素或芹菜素，并且所述3
’‑
羟化的黄酮类化合物是柚皮素或芹菜素的3
’‑
羟化的形式，即圣草酚或木犀草素。
96.因此，所述微生物可以包含编码能够在柚皮素和/或芹菜素的3’位中添加羟基的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列。
97.在一个实施方式中，所述f3’h是植物酶，尤其是来自于葱属(allium)、拟南芥属(arabidopsis)、芸苔属(brassica)、翠菊属(callistephus)、金鱼花属(columnea)、柑橘属、石竹属(dianthus)、龙胆属(gentiana)、大丁草属(gerbera)、大豆属(glycine)、草莓属(fragaria)、番薯属(ipomoea)、苹果属(malus)、紫罗兰属(matthiola)、蓝眼菊属(osteospermum)、稻属(oryza)、原毛平革菌属(phanerochaete)、紫苏属(perilla)、欧芹属(petroselinum)、天竺葵属(pelargonium)、水兰属(pilosella)、矮牵牛属(petunia)、岩桐属(sinningia)、高粱属(sorghum)、蝴蝶草属(torenia)、葡萄属(vitis)或玉蜀黍属(zea)的植物，例如洋葱(allium cepa)、拟南芥、欧洲油菜(brassica napus)、杂交金鱼花(columnea hybrida)、翠菊、甜橙、克莱门柚、康乃馨(dianthus caryophyllus)、野草莓(fragaria vesca)、普通草莓(fragaria x ananassa)、非洲菊、大豆、三花龙胆(gentiana triflora)、牵牛花(ipomoea nil)、圆叶牵牛(ipomoea purpurea)、三色牵牛(ipomoea tricolor)、紫罗兰(matthiola incana)、苹果(malus domestica)、蓝眼菊、水稻(oryza sativa)、黄孢原毛平革菌、山柳兰、荷兰芹、天竺葵(pelargonium x hortorum)、回回苏、矮牵牛、sinningia cardinalis、高粱(sorghum bicolor)、蝴蝶草(torenia sp)、蝴蝶草杂交栽培种(torenia hybrid cultivar)、葡萄(vitis vinifera)或玉米。在更特定实施方式中，所述f3’h是来自于葱属、芸苔属、翠菊属、金鱼花属、柑橘属、石竹属、龙胆属、大丁草属、大豆属、草莓属、番薯属、苹果属、紫罗兰属、蓝眼菊属、稻属、原毛平革菌属、紫苏属、欧芹属、天竺葵属、水兰属、矮牵牛属、岩桐属、高粱属、蝴蝶草属、葡萄属或玉蜀黍属的植物，例如洋葱、欧洲油菜、杂交金鱼花、翠菊、甜橙、克莱门柚、康乃馨、野草莓、普通草莓、非洲菊、大豆、三花龙胆、牵牛花、圆叶牵牛、三色牵牛、紫罗兰、苹果、蓝眼菊、水稻、黄孢原毛平革菌、山柳兰、荷兰芹、天竺葵、回回苏、矮牵牛、sinningia cardinalis、高粱、蝴蝶草、蝴蝶草
杂交栽培种、葡萄或玉米的酶。
98.优选地，所述f3’h是来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、克莱门柚、蓝眼菊、黄孢原毛平革菌、阿维链霉菌、甜橙、拟南芥或山柳兰的酶。特别地，所述f3’h可以是来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙和山柳兰的酶。
99.在特定实施方式中，所述f3’h选自：包含选自seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和95、特别是seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：1、5、7、11、17、19和95、特别是seq id no：1、5、7、11、17和19的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用柚皮素和/或芹菜素作为底物并在3’位中进行羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。在特定实施方式中，所述f3’h是包含选自seq id no：5、7和17的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。在优选实施方式中，所述f3’h是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。最特别优选地，所述f3’h可以是包含选自seq id no：7、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、75、80、85、90或95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。
100.因此，所述f3’h可以来自于回回苏。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号ab045593.1和bab59005.1下，更特别是在seq id no：2和1中。
101.所述f3’h可以来自于黄孢原毛平革菌。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号ab597870.1和bal05157.1下，更特别是在seq id no：4和3中。
102.所述f3’h可以来自于矮牵牛。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号af155332.1和aad56282.1中，更特别是在seq id no：6和5中。
103.所述f3’h可以来自于翠菊。在一个实施方式中，编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号af313488.1和aag49298.1下，更特别是在seq id no：8和7中。在另一个实施方式中，编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号af313489.1和aag49299.1下，更特别是在seq id no：10和9中。
104.所述f3’h可以来自于非洲菊。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号dq218417.1和aba64468.1下，更特别是在seq id no：12和11中。
105.所述f3’h可以来自于蓝眼菊。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号dq250711.1和abb29899.1下，更特别是在seq id no：14和13中。
106.所述f3’h可以来自于克莱门柚。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号xm_006440673.1和xp_006440736.1下，更特别是在seq id no：16和15中。
107.所述f3’h可以来自于甜橙。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号xm_006477592.2和xp_006477655.1下，更特别是在seq id no：18和17中。
108.所述f3’h可以来自于山柳兰。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号dq319866.2和abc47161.1下，更特别是在seq id no：20和19中。
109.所述f3’h可以来自于阿维链霉菌。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi
中，分别在参考编号sav_4539和wp_010985964.1下，更特别是在seq id no：22和21中。
110.所述f3’h可以来自于拟南芥。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号nm_120881.2和np_196416.1下，更特别是在seq id no：96和95中。
111.优选地，所述f3’h是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。最特别优选地，所述f3’h是包含选自seq id no：7、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。
112.根据优选实施方式，所述f3’h是包含选自seq id no：7的序列的酶和包含与序列seq id no：7具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。
113.根据另一个特定实施方式，所述f3’h是包含选自seq id no：17的序列的酶和包含与序列seq id no：17具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。
114.根据另一个特定实施方式，所述f3’h是包含选自seq id no：95的序列的酶和包含与序列seq id no：95具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。
115.根据另一个特定实施方式，所述f3’h是包含选自seq id no：11的序列的酶和包含与序列seq id no：11具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽。
116.因此，在一个实施方式中，所述微生物包含编码特别是能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，和编码特别是能够在柚皮素和/或芹菜素的3’位中添加羟基的黄酮类化合物3
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单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列。
117.cpr：细胞色素p450还原酶
118.黄酮类化合物3
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单加氧酶(f3’h)需要nadph的存在才能进行羟基的添加。
119.因此，在优选实施方式中，所述微生物包含编码细胞色素p450还原酶这种nadph
‑
细胞色素p450还原酶的异源或内源核酸。这种酶属于ec 1.6.2.4类别。
120.因此，在特定实施方式中，所述微生物包含编码特别是能够在柚皮素和/或芹菜素的3’位中添加羟基的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，和编码细胞色素p450还原酶的异源或内源核酸。
121.细胞色素p450还原酶源自于真核生物，尤其是酵母例如酵母属的酵母，或来自于植物，例如拟南芥属、阿密属(ammi)、海榄雌属(avicennia)、山茶属(camellia)、喜树属(camptotheca)、长春花属(catharanthus)、柑橘属、大豆属、向日葵属(helianthus)、百脉根属(lotus)、松叶菊属(mesembryanthemum)、菜豆属(phaseolus)、小立碗藓属(physcomitrella)、松属(pinus)、杨属(populus)、芸香属(ruta)、甘蔗属(saccharum)、茄属(solanum)、豇豆属(vigna)、葡萄属或玉蜀黍属的植物。
122.在优选实施方式中，所述细胞色素p450还原酶源自于真核生物，例如酵母，特别是酿酒酵母，或来自于植物，例如长春花(catharanthus roseus)或拟南芥。
123.在特定实施方式中，所述细胞色素p450还原酶选自：包含选自seq id no：23、25、
27、29和31的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽。在优选实施方式中，所述细胞色素p450还原酶可以选自：包含选自seq id no：25的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽。
124.例如，所述细胞色素p450还原酶可以来自于长春花。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号x69791.1下，蛋白质序列在编号caa49446.1下，更特别地分别在seq id no：24和23中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号q05001下。
125.所述细胞色素p450还原酶可以来自于酿酒酵母。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号nm_001179172.1下，蛋白质序列在编号np_011908.1下，更特别地分别在seq id no：26和25中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号p16603下。
126.所述细胞色素p450还原酶可以是嵌合的。它被描述在aigrain等人的文章中(2009,embo reports,10,742
‑
747)。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列分别描述在seq id no：28和27中。
127.此外，所述细胞色素p450还原酶可以来自于拟南芥。当所述细胞色素p450源自于拟南芥时，它可以被命名为atr。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号nm_118585.4下，蛋白质序列在编号np_194183.1下，更特别地分别在seq id no：30和29中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号q9sb48下。
128.此外，所述细胞色素p450还原酶可以来自于拟南芥，并且可以被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号nm_179141.2下，蛋白质序列在编号np_849472.2下，更特别地分别在seq id no：32和31中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号q9sum3下。
129.在一个实施方式中，将编码如上所定义的cpr的序列的新拷贝引入到酵母中。在另一个实施方式中，当所述酵母是酿酒酵母并且当所述cpr源自于同一酵母时，将编码cpr的内源基因的启动子用强启动子代替。因此，相对于野生型酵母所述cpr的表达提高；因此，cpr在所述修饰的酵母中过表达。
130.在特定实施方式中，所述f3’h和cpr来自于同一起源、同一物种。
131.fns：黄酮合酶
132.香叶木素可以从木犀草素生产。它也可以从圣草酚，通过将它转化成木犀草素然后从木犀草素制备香叶木素，或通过将它转化成橙皮素然后从橙皮素制备香叶木素来获得。能够将圣草酚转化成木犀草素和/或将橙皮素转化成香叶木素的酶是黄酮合酶(fns)。在特定实施方式中，所述黄酮合酶还能够将圣草酚转化成木犀草素。
133.因此，所述微生物可以包含编码黄酮合酶、特别是能够从圣草酚产生木犀草素和/或从橙皮素产生香叶木素的黄酮合酶的异源核酸序列。
134.术语“黄酮合酶活性”意味着通过fnsi酶(cpr不依赖性)或fnsii酶(cpr依赖性)将黄烷酮转化成黄酮。
135.为了确定是否存在黄酮合酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：在fnsi的
情况下将由黄酮合酶(fnsi)、黄烷酮、2
‑
酮基戊二酸和o2组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育，并且在fnsii的情况下将由fnsii酶、黄烷酮、nad(p)h和o2组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温浴时间后，在uplc
‑
ms中观察对应于所述黄烷酮的黄酮的出现，并与预期的标准品进行比较。优选地，所述黄烷酮是圣草酚或橙皮素，其将被分别转化成它们的黄酮形式，即木犀草素或香叶木素。
136.因此，在特定实施方式中，所述微生物包含编码特别是能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，以及编码黄酮合酶，特别是能够从圣草酚产生木犀草素和/或从橙皮素产生香叶木素的黄酮合酶的异源核酸序列。
137.优选地，所述黄酮合酶是源自于植物，例如犬毒芹属(aethusa)、当归属(angelica)、金鱼草属(antirrhinum)、芹属(apium)、拟南芥属、翠菊属、山茶属、毒参属(conium)、孜然芹属(cuminum)、菜蓟属(cynara)、大丽花属(dahlia)、旋蒴苣苔属(dorcoceras)、沟酸浆属(erythranthe)、忍冬属(lonicera)、苜蓿属(medicago)、稻属、紫苏属、欧芹属、香茶属(plectranthus)、杨属、风毛菊属(saussurea)、黄芩属(scutellaria)或玉蜀黍属，特别是拟南芥属、忍冬属、苜蓿属、稻属、欧芹属、杨属或玉蜀黍属，尤其是拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨(populus deltoides)、玉米、翠菊、芹菜、孜然、毒欧芹、圆叶当归、毒芹、茶树、朝鲜蓟、水母雪莲、毛喉鞘蕊花、黄芩、旋蒴苣苔、金鱼草、回回苏、大丽花或erythranthe lewisii，特别是来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨或玉米，优选为荷兰芹或忍冬属例如金银花和灰毡毛忍冬的酶。
138.在特定实施方式中，所述黄酮合酶(fns)选自：包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。特别地，所述黄酮合酶(fns)选自：包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。优选地，所述fns选自：包含选自seq id no：37的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
139.存在两种类型的黄酮合酶(fns)：黄酮合酶1(fnsi)和黄酮合酶2(fnsii)。从黄烷酮和2
‑
酮基戊二酸开始，fnsi能够产生相应的黄酮。fnsi酶属于ec 1.14.11.22类别。fnsii属于p450组，并需要细胞色素p450还原酶的存在。fnsii酶属于ec 1.14.13类别。
140.在一个实施方式中，所述fns是i型黄酮合酶。在另一个实施方式中，所述fns是ii型黄酮合酶。在其他实施方式中，所述微生物包含i型黄酮合酶和ii型黄酮合酶。
141.在优选实施方式中，所述微生物包含编码i型黄酮合酶(fnsi)的异源核酸序列。fnsi的优点在于它不需细胞色素p450还原酶起作用。
142.所述fnsi可以是来自于植物例如荷兰芹、水稻、美洲黑杨、蒺藜状苜蓿、芹菜、孜然、毒欧芹、圆叶当归或毒芹，特别是荷兰芹、水稻、美洲黑杨或蒺藜状苜蓿，优选为荷兰芹的黄酮合酶。
143.所述fnsi可以是包含选自seq id no：37、101、111、115、117和119的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。在特定情况下，所述fnsi可以是包含选自seq id no：37的序列的酶和包含与该
序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
144.例如，所述fnsi可以来自于荷兰芹。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号ay817680.1下，蛋白质序列在编号aax21541.1下。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号q7xzq8下。所述氨基酸序列和核酸序列分别描述在seq id no：37和38中。
145.所述fnsi也可以来自于圆叶当归。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号dq683352.1下，蛋白质序列在abg78793.1下。所述氨基酸序列和核酸序列分别描述在seq id no：101和102中。
146.所述fnsi也可以来自于芹菜。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号ay817676.1下，蛋白质序列在aax21537.1下。所述氨基酸序列和核酸序列分别描述在seq id no：111和112中。
147.所述fnsi也可以来自于孜然。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号dq683349.1下，蛋白质序列在abg78790.1下。所述氨基酸序列和核酸序列分别描述在seq id no：115和116中。
148.所述fnsi也可以来自于毒欧芹。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号dq683350.1下，蛋白质序列在编号dq683350.1下。所述氨基酸序列和核酸序列分别描述在seq id no：117和118中。
149.所述fnsi也可以来自于毒芹。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号dq683354.1下，蛋白质序列在编号abg78795.1下。所述氨基酸序列和核酸序列分别描述在seq id no：119和120中。
150.在另一个实施方式中，所述微生物包含编码ii型黄酮合酶(fnsii)的异源核酸序列。
151.所述fnsii可以是来自于植物例如拟南芥、玉米、忍冬属例如金银花和灰毡毛忍冬、翠菊、蒺藜状苜蓿、茶树、朝鲜蓟、水母雪莲、毛喉鞘蕊花、黄芩、旋蒴苣苔、金鱼草、回回苏、大丽花或erythranthe lewisii的黄酮合酶，特别是来自于拟南芥、玉米或忍冬属例如金银花和灰毡毛忍冬的黄酮合酶。
152.在特定实施方式中，所述黄酮合酶(fnsii)选自：包含选自seq id no：33、35、103、105、107、109、113、121、123、125、127、129、131和133的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：33和35的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
153.在一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于金银花的fnsii。在这个实施方式中，所述酶可以是在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号ku127576.1下并且蛋白质序列在编号amq91109.1下，更特别地是分别在seq id no：34和33中描述的酶。
154.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于灰毡毛忍冬的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号ku127580.1和amq91113.1下，更特别地分别在seq id no：36和35中。
155.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于朝鲜蓟的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号jn825735.1和afg31000.1下，更特别
地分别在seq id no：104和103中。
156.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于回回苏的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号ab045592.1和bab59004.1下，更特别第分别在seq id no：106和105中。
157.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于大丽花的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号ab769842.1和bam72335.1下，更特别地分别在seq id no：108和107中。
158.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于翠菊的fnsii。
159.编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号af188612.1和aaf04115.1下，更特别地分别在seq id no：110和109中。
160.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于蒺藜状苜蓿的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号dq354373.1和abc86159.1下，更特别地分别在seq id no：114和113中。
161.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于茶树的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号fj169499.1和ach99109.1下，更特别地分别在seq id no：122和121中。
162.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于水母雪莲的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号kf170286.1和agv40781.1下，更特别地分别在seq id no：124和123中。
163.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于毛喉鞘蕊花的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号kf606861.1和ahj89438.1下，更特别地分别在seq id no：126和125中。
164.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于黄芩的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号kt963454.1和amw91729.1下，更特别地分别在seq id no：128和127中。
165.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于旋蒴苣苔的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号kv013332.1和kzv23934.1下，更特别地分别在seq id no：130和129中。
166.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于金鱼草的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号ab028151.1和baa84071.1下，更特别地分别在seq id no：132和131中。
167.在另一个实施方式中，所述黄酮合酶fns是源自于erythranthe lewisii的fnsii。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号kx710102.1和aor81894.1下，更特别地分别在seq id no：134和133中。
168.在特定实施方式中，所述微生物包含编码ii型黄酮合酶(fnsii)和i型黄酮合酶的异源核酸序列，所述ii型黄酮合酶(fnsii)和i型黄酮合酶例如选自seq id no：33、35、103、105、107、109、113、121、123、125、127、129、131和133的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽以及包含选自seq id no：37、101、111、115、117和119的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、
70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为选自seq id no：33和35的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽以及包含选自seq id no：37的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
169.所述ii型fns即fnsii需要细胞色素p450还原酶(cpr)的存在。因此，如果所述微生物不包含细胞色素p450还原酶，则必需引入异源细胞色素p450还原酶。如果所述微生物已经包含一种细胞色素p450还原酶，则可以设想将内源细胞色素p450还原酶过表达(例如通过将启动子用强启动子代替或通过添加编码序列的一个或多个拷贝)或也引入异源细胞色素p450还原酶。
170.在特定实施方式中，所述ii型fns和cpr来自于同一起源、同一物种。
171.酶的组合
172.因此，所述微生物优选地包含能够从柚皮素和/或芹菜素产生橙皮素和/或香叶木素的酶。
173.在第一个特定实施方式中，所述重组微生物包含：
174.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化，特别是能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)优选地来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙和山柳兰，优选为包含选自seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的序列的f3’h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选选自：包含选自seq id no：1、5、7、11、17和19的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：5、7和17的序列的f3’h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；
175.‑
任选的编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)优选地是来自于酿酒酵母或来自于植物例如长春花或拟南芥的cpr，优选为包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；
176.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选地选自包含序列seq id no：89的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；和
177.‑
任选的编码能够从黄烷酮产生黄酮，特别是能够将柚皮素转化成芹菜素和/或将圣草酚转化成木犀草素，优选地将圣草酚转化成木犀草素的黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)优选为来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰
芹、美洲黑杨或玉米，优选地来自于金银花、灰毡毛忍冬和荷兰芹的fns，优选为包含选自seq id no：33、35和37的序列的fns和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
178.在另一个特定实施方式中，所述重组微生物包含：
179.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)优选地来自于拟南芥、回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙、克莱门柚、蓝眼菊、黄孢原毛平革菌、阿维链霉菌或山柳兰，优选为包含选自seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和95的序列的f3’h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，非常特别是包含选自seq id no：7的序列的f3’h和包含与序列seq id no：7具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；
180.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于克莱门柚、甜橙、拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：91、93、87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：91和93的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；和
181.‑
任选的编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)优选为来自于酿酒酵母或来自于植物例如长春花或拟南芥的cpr，优选为包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是选自：包含选自seq id no：25的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；和
182.‑
任选的编码能够从黄烷酮产生黄酮，特别是能够将柚皮素转化成芹菜素和/或将圣草酚转化成木犀草素，优选地将圣草酚转化成木犀草素的黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)优选为来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨、玉米、翠菊、芹菜、孜然、毒欧芹、圆叶当归、毒芹、茶树、朝鲜蓟、水母雪莲、毛喉鞘蕊花、黄芩、旋蒴苣苔、金鱼草、回回苏、大丽花或erythranthe lewisii，特别是来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨或玉米，优选地来自于金
银花、灰毡毛忍冬和荷兰芹的fns，优选为包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的fns和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
183.在另一个特定实施方式中，所述重组微生物包含：
184.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化，特别是能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)优选地来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙、克莱门柚、蓝眼菊、黄孢原毛平革菌、阿维链霉菌或山柳兰，特别是来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙或山柳兰，优选为包含选自seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的序列的f3’h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：1、5、7、11、17和19的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：5、7和17的序列的f3’h和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；
185.‑
编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)优选为来自于酿酒酵母或来自于植物例如长春花或拟南芥的cpr，优选为包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；
186.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选地选自包含序列seq id no：89的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；和
187.‑
编码能够从黄烷酮产生黄酮，特别是能够将柚皮素转化成芹菜素和/或将圣草酚转化成木犀草素，优选地将圣草酚转化成木犀草素的黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)优选为来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨、玉米、翠菊、芹菜、孜然、毒欧芹、圆叶当归、毒芹、茶树、朝鲜蓟、水母雪莲、毛喉鞘蕊花、黄芩、旋蒴苣苔、金鱼草、回回苏、大丽花或erythranthe lewisii，特别是来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨或玉米，优选地来自于金银花、灰毡毛忍冬和荷兰芹的fns，优选为包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的fns和包含与这些序
列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
188.在另一个特定实施方式中，所述重组微生物包含：
189.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：7、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：7的序列的酶和包含与该序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；和
190.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于克莱门柚、甜橙、拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：91、93、87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：91和93的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；和
191.‑
任选的编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)是包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，非常特别是包含选自seq id no：25的序列的cpr和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；和
192.‑
任选的编码黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)是包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
193.在另一个特定实施方式中，所述重组微生物包含：
194.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含
4.3.1.23类别。
208.术语“苯丙氨酸解氨酶活性”意味着利用苯丙氨酸解氨酶将苯丙氨酸转化成反式
‑
肉桂酸。为了确定是否存在苯丙氨酸解氨酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由苯丙氨酸解氨酶和苯丙氨酸组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定的温浴时间后，在uplc
‑
ms中观察反式
‑
肉桂酸的出现并与预期的标准品比较。
209.酪氨酸解氨酶(tal)也可能具有如上所定义的苯丙氨酸解氨酶(pal)活性和/或二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)活性。
210.因此，所述微生物可以包含编码酪氨酸解氨酶的异源核酸序列。
211.优选地，这种酶是由红杆菌属的细菌或黄杆菌属(flavobacteriaceae)的细菌产生的酶。在特定实施方式中，这种酶由荚膜红杆菌或类球红杆菌产生。在另一个特定实施方式中，这种酶由约氏黄杆菌产生。在另一个实施方式中，这种酶由酵母，特别是红酵母属的酵母例如黏红酵母产生。其他生物体也产生这种酶，例如茶树、普通草莓、ralstonia metallidurans或玉米。
212.在特定实施方式中，所述酪氨酸解氨酶选自：包含选自seq id no：39和41的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽。
213.在特定实施方式中，所述tal来自于约氏黄杆菌。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号kr095306.1下，蛋白质序列在编码ake50827.1下，更特别是在seq id no：40和39中。
214.在特别优选实施方式中，所述tal来自于黏红酵母。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号kf765779.1下，蛋白质序列在编号agz04575.1下，更特别地分别在seq id no：42和41中。
215.在特别优选实施方式中，所述酪氨酸解氨酶选自：包含选自seq id no：41的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽。
216.4cl：4
‑
香豆酰辅酶a连接酶
217.4cl是4
‑
香豆酰辅酶a连接酶。这种酶能够从对香豆酸和辅酶a产生4
‑
香豆酰辅酶a并从咖啡酸和辅酶a产生咖啡酰辅酶a。这种酶属于ec 6.2.1.12类别。
218.术语“4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性”意味着通过4
‑
香豆酰辅酶a连接酶将对香豆酸转化成对香豆酰辅酶a或将咖啡酸转化成咖啡酰辅酶a。为了确定是否存在4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由4
‑
香豆酰辅酶a连接酶、对香豆酸或咖啡酸、atp和辅酶a组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在uv分光光度计上分别以333nm和346nm的波长观察对香豆酰辅酶a或咖啡酰辅酶a的出现，并与预期的标准品进行比较。
219.因此，所述微生物可以包含编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶的异源核酸序列。
220.优选地，这种酶是由植物产生的酶，例如冷杉属(abies)、拟南芥属、藿香属(agastache)、紫穗槐属(amorpha)、芸苔属、柑橘属、银杉属(cathaya)、雪松属(cedrus)、番红花属(crocus)、落叶松属(larix)、羊茅属(festuca)、大豆属、胡桃属(juglans)、油杉属(keteleeria)、紫草属(lithospermum)、黑麦草属(lolium)、百脉根属、番茄属
(lycopersicon)、苹果属、苜蓿属、松叶菊属、烟草属(nicotiana)、长苞铁杉属(nothotsuga)、稻属、菜豆属、天竺葵属、欧芹属、小立碗藓属、云杉属(picea)、李属(prunus)、金钱松属(pseudolarix)、黄杉属(pseudotsuga)、蔷薇属(rosa)、悬钩子属(rubus)、ryza、甘蔗属、碱蓬属(suaeda)、松属、杨属、茄属、盐芥属(thellungiella)、小麦属(triticum)、铁杉属(tsuga)、葡萄属或玉蜀黍属。可选地，这种酶是由微生物例如曲霉、球腔菌(mycosphaerella)、分枝杆菌(mycobacterium)、奈瑟氏菌(neisseria)、脉孢菌(neurospora)、链霉菌、红杆菌或耶氏酵母产生的酶。
221.在优选实施方式中，这种酶是由植物，优选为拟南芥、克莱门柚或荷兰芹，特别是拟南芥或荷兰芹产生的酶，或由细菌，优选为链霉菌属，特别是棒状链霉菌，产生的酶。
222.在特定实施方式中，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶选自：包含选自seq id no：43、45、47、49、97和99的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽。
223.在另一个特定实施方式中，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶是包含选自seq id no：43、45、47和49、优选为seq id no：45和49的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽。
224.在第一特定实施方式中，所述4cl来自于拟南芥。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号ay099747.1下，蛋白质序列在编号aam20598.1下，更特别地分别在seq id no：44和43中。
225.在第二特定实施方式中，所述4cl来自于荷兰芹。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列分别在编号x13324.1或x13325.1下，蛋白质序列分别在编号caa31696.1或caa31697.1下。所述蛋白质被描述在uniprotkb/swiss prot中，分别在参考编号p14912和p14913下，更特别地分别在seq id no：46和45、48和47中。优选地，所述4cl来自于荷兰芹并被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号x13324.1下，蛋白质序列在编号caa31696.1下，以及在uniprotkb/swiss prot中在参考编号p14912下，更特别地分别在seq id no：46和45中。
226.在第三特定实施方式中，所述4cl来自于棒状链霉菌。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号cp016559.1下，蛋白质序列在编号anw18832.1下，更特别地分别在seq id no：50和49中。
227.在第四特定实施方式中，所述4cl来自于克莱门柚。这个酶的核苷酸序列和蛋白质序列分别描述在seq id no：100和99中。
228.在第五特定实施方式中，所述4cl来自于拟南芥，并且这个酶的核苷酸序列和蛋白质序列分别描述在seq id no：98和97中。
229.在优选实施方式中，所述4cl是包含选自seq id no：45、97和99、优选为seq id no：97和45的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽。最特别优选地，所述4cl是包含选自seq id no：45的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽。
230.chs：查尔酮合酶
231.chs是查尔酮合酶。这种酶能够从4
‑
香豆酰辅酶a和丙二酰辅酶a产生柚皮素
‑
查尔
酮并且从咖啡酰辅酶a和丙二酰辅酶a产生圣草酚
‑
查尔酮。这种酶属于ec 2.3.1.74类别。
232.术语“查尔酮合酶活性”意味着利用查尔酮合酶将对香豆酰辅酶a和丙二酰辅酶a转化成柚皮素
‑
查尔酮或将咖啡酰辅酶a和丙二酰辅酶a转化成圣草酚
‑
查尔酮。为了确定是否存在查尔酮合酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由查尔酮合酶、香豆酰辅酶a或咖啡酰辅酶a和丙二酰辅酶a组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在hplc
‑
ms中分别观察柚皮素
‑
查尔酮或圣草酚
‑
查尔酮的出现，并与预期的标准品进行比较。
233.因此，所述微生物包含编码查尔酮合酶的异源核酸序列。
234.这种酶可以是由植物，尤其是拟南芥属、燕麦属(avena)、秋英属(cosmos)、柑橘属、胡萝卜属(daucus)、荞麦属(fagopyrum)、香雪兰属(freesia)、大豆属、甘草属(glycyrrhiza)、葎草属(humulus)、金丝桃属(hypericum)、大麦属(hordeum)、胡桃属、苜蓿属、菜豆属、小立碗藓属、紫背苔属(plagiochasma)、欧芹属、葛藤属(pueraria)、悬钩子属(rubus)、黑麦属(secale)、黄芩属、蝇子草属(silene)、白芥属(sinapis)、菠菜属(spinacia)、繁缕属(stellaria)、小麦属、郁金香属(tulipa)、马鞭草属(verbena)、葡萄属或xanthisma属植物，例如拟南芥、燕麦(avena sativa)、黄秋英(cosmos sulphureus)、甜橙、胡萝卜(daucus carota)、荞麦(fagopyrum esculentum)、小苍兰(freesia hybrid cultivar)、大豆、刺甘草(glycyrrhiza echinata)、蛇麻草(humulus lupulus)、金丝桃(hypericum androsaemum)、大麦、胡桃(juglans sp.)、紫花首蓿(medicago sativa)、普通菜豆(phaseolus vulgaris)、小立碗藓(physcomitrella patens)、plagiochasma appendiculatum、荷兰芹、野葛(pueraria montana var.lobata)、覆盆子(rubus idaeus)、黑麦(secale cereale)、黄芩、蝇子草(silene sp.)、白芥(sinapis alba)、菠菜(spinacia oleracea)、长须银柴胡(stellaria longipes)、小麦(triticum aestivum)、郁金香杂交种(tulipa hybrid cultivar)、马鞭草(verbena sp.)、葡萄或xanthisma gracile产生的酶
235.优选地，这种酶是由植物，例如柑橘属植物特别是甜橙或大麦，或由细菌，优选为链霉菌属，特别是棒状链霉菌产生的酶。
236.在特定实施方式中，所述查尔酮合酶选自：包含选自seq id no：51、53、55和57的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：53和55的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽。
237.在特别优选实施方式中，所述查尔酮合酶是包含选自seq id no：53的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽。
238.在第一特定实施方式中，所述chs来自于大麦。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号y09233.1下，蛋白质序列在编号caa70435.1下，更特别地分别在seq id no：52和51中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号q96562下。
239.在第二特定实施方式中，所述chs来自于甜橙。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号ab009351.1下，蛋白质序列在baa81664.1下，更特别地分别在seq id no：54和53中。
240.在第三特定实施方式中，所述chs来自于甜橙。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号xm_006489733.1下，蛋白质序列在编号xp_006489796.1下，更特别地分别在seq id no：56和55。
241.在第四特定实施方式中，所述chs来自于棒状链霉菌。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号cp016559.1下，蛋白质序列在anw16917.1下，更特别地分别在seq id no：58和57中。
242.由于查尔酮合酶催化的反应需要丙二酰辅酶a的存在，因此所述微生物可以被修饰以提高丙二酰辅酶a的合成。
243.chi：查尔酮异构酶
244.chi是查尔酮异构酶。它能够从柚皮素查尔酮产生柚皮素并从圣草酚查尔酮产生圣草酚。这种酶属于ec 5.5.1.6类别。
245.术语“查尔酮异构酶活性”意味着通过查尔酮异构酶将柚皮素查尔酮或圣草酚查尔酮转化成柚皮素或圣草酚。为了确定是否存在查尔酮异构酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由查尔酮异构酶、柚皮素查尔酮或圣草酚查尔酮组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在hplc
‑
ms中分别观察柚皮素或圣草酚的出现，并与预期的标准品进行比较。
246.因此，所述微生物包含编码查尔酮异构酶的异源核酸序列。
247.这种酶可以源自于植物，尤其是拟南芥属、银杏属(ginkgo)、文心兰属(oncidium)、紫苏属、柑橘属或胡芦巴属(trigonella)的植物，例如拟南芥、银杏(ginkgo biloba)、文心兰(oncidium gower ramsey)、白苏(perilla frutescens)、甜橙或胡芦巴(trigonella foenum
‑
graecum)。
248.优选地，这种酶是由植物例如拟南芥产生的酶，或由细菌，优选为链霉菌属(streptomyces)，特别是棒状链霉菌产生的酶。
249.在特定实施方式中，所述查尔酮异构酶选自：包含选自seq id no：59和61的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽。
250.在优选实施方式中，所述查尔酮异构酶选自：包含选自seq id no：61的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽。
251.在第一特定实施方式中，所述chi来自于棒状链霉菌。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号cp016559.1下，蛋白质序列在编号anw16918.1下，更特别地分别在seq id no：60和59中。
252.在第二特定实施方式中，所述chi来自于拟南芥。它被描述在ncbi的genbank数据库中，核酸序列在编号nm_115370.4下，蛋白质序列在编号np_191072.1下，更特别地分别在seq id no：62和61中。
253.fns：黄酮合酶
254.芹菜素可以使用黄酮合酶(fns)从柚皮素制备。它能够从柚皮素产生芹菜素。
255.因此，所述微生物可以包含编码特别是能够从柚皮素产生芹菜素的黄酮合酶的异源核酸序列，和/或编码特别是能够从圣草酚产生木犀草素的黄酮合酶的异源核酸序列，
和/或编码特别是能够从橙皮素产生香叶木素的黄酮合酶的异源核酸序列。
256.所述fns可以从上文中描述的fns中选择。
257.从苯丙氨酸开始
258.可选地或另外地，所述微生物还可以包含从苯丙氨酸合成对香豆酸所需的酶。
259.在这种情形中，所述微生物还可以包含编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列和编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列。
260.pal属于ec 4.3.1.24类别。它能够从苯丙氨酸产生肉桂酸。
261.术语“苯丙氨酸解氨酶活性”意味着利用苯丙氨酸解氨酶将苯丙氨酸转化成反式
‑
肉桂酸。为了确定是否存在苯丙氨酸解氨酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由苯丙氨酸解氨酶和苯丙氨酸组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在uplc
‑
ms中观察反式
‑
肉桂酸的出现，并与预期的标准品进行比较。
262.在现有技术中已经描述了几种酶。优选地，所述酶源自于植物，例如拟南芥属、藿香属、凤梨属(ananas)、天门冬属(asparagus)、芸苔属、bromheadia、刺竹属(bambusa)、甜菜属(beta)、桦木属(betula)、柑橘属、黄瓜属(cucumis)、山茶属、辣椒属(capsicum)、决明子属(cassia)、长春花属、鹰嘴豆属(cicer)、西瓜属(citrullus)、咖啡属(coffea)、南瓜属(cucurbita)、狗牙根属(cynodon)、胡萝卜属、石斛兰属(dendrobium)、石竹属、毛地黄属(digitalis)、薯蓣属(dioscorea)、桉属(eucalyptus)、gallus、银杏属、大豆属、大麦属、向日葵属、番薯属、莴苣属(lactuca)、紫草属、百脉根属、番茄属、苜蓿属、苹果属、木薯属(manihot)、苜蓿属、松叶菊属、烟草属、木犀榄属(olea)、稻属、菜豆属、松属、杨属、豌豆属(pisum)、鳄梨属(persea)、欧芹属、蝴蝶兰属(phalaenopsis)、刚竹属(phyllostachys)、小立碗藓属、云杉属、梨属(pyrus)、李属、栎属(quercus)、萝卜属(raphanus)、地黄属(rehmannia)、悬钩子属、茄属、高粱属、楔柱豆属(sphenostylis)、繁缕属、柱花草属(stylosanthes)、小麦属、三叶草属(trifolium)、越橘属(vaccinium)、豇豆属、葡萄属、玉蜀黍属或百日菊属(zinnia)的植物。例如，可以提到的是来自于拟南芥或荷兰芹的酶。
263.此外，苯丙氨酸解氨酶(pal)也可能具有如下所定义的酪氨酸解氨酶(tal)活性和/或二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)活性。
264.在优选实施方式中，所述pal来自于甜橙。
265.在特定实施方式中，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)选自：包含选自seq id no：63、65和77的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽。
266.在优选实施方式中，所述pal选自：包含选自seq id no：65和77的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽。最特别优选地，所述pal选自：包含选自seq id no：65的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽。
267.在特定实施方式中，所述来自于甜橙的pal被描述在ncbi的genbank数据库中，核苷酸序列在编号xm_006481431.2下，蛋白质序列在编号xp_006481494.1下，更特别地分别在seq id no：64和63中。
268.在另一个特定实施方式中，所述来自于甜橙的pal被描述在ncbi的genbank数据库
中，核苷酸序列在编号xm_006488000.2下，蛋白质序列在编号xp_006488063.1下，更特别地分别在seq id no：66和65中。
269.在另一个特定实施方式中，所述来自于拟南芥的pal被描述在ncbi的genbank数据库中，核苷酸序列在编号nm_115186.4下，蛋白质序列在编号np_190894.1下，更特别地分别在seq id no：78和77中。
270.任选地，如果设想从酪氨酸和苯丙氨酸开始生物合成，则所述pal和tal可以用苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶(ptal)代替或补充。ptal属于ec 4.3.1.25类别。
271.c4h属于ec 1.14.13.11类别。它能够从肉桂酸产生对香豆酸。
272.术语“反式
‑
肉桂酸4
‑
单加氧酶活性”意味着通过反式
‑
肉桂酸4
‑
单加氧酶(cpr依赖性)将反式
‑
肉桂酸转化成对香豆酸。为了确定是否存在反式
‑
肉桂酸4
‑
单加氧酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由反式
‑
肉桂酸4
‑
单加氧酶、肉桂酸、nadph、h

和o2组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在uplc
‑
ms中观察4
‑
羟基肉桂酸(对香豆酸)的出现，并与预期的标准品进行比较。
273.在现有技术中已经描述了几种酶。优选地，所述酶源自于植物，例如拟南芥属、阿密属、海榄雌属、山茶属、喜树属、长春花属、柑橘属、大豆属、向日葵属、百脉根属、松叶菊属、physcomitreila、菜豆属、松属、杨属、芸香属、甘蔗属、茄属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属的植物。
274.在优选实施方式中，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)来自于甜橙或拟南芥。
275.在特定实施方式中，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)选自：包含选自seq id no：67、69和79的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽。
276.在优选实施方式中，所述c4h选自：包含选自seq id no：79的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽。
277.在特定实施方式中，所述来自于甜橙的c4h被描述在ncbi的genbank数据库中，核苷酸序列在编号nm_001288840.1下，蛋白质序列在编号np_001275769.1下，更特别地分别在seq id no：68和67中。
278.在另一个特定实施方式中，所述来自于甜橙的c4h被描述在ncbi的genbank数据库中，核苷酸序列在编号nm_001288895.1下，蛋白质序列在编号np_001275824.1下，更特别地分别在seq id no：70和69中。
279.在另一个特定实施方式中，所述来自于拟南芥的c4h被描述在ncbi的genbank数据库中，核苷酸序列在编号nm_128601.3下，蛋白质序列在编号np_180607.1下，更特别地分别在seq id no：80和79中。
280.通过咖啡酸进行
281.在其他实施方式中，圣草酚的生物合成可以包括从酪氨酸合成l
‑
dopa(3,4
‑
二羟基
‑
l
‑
苯丙氨酸)，然后从l
‑
dopa(3,4
‑
二羟基
‑
l
‑
苯丙氨酸)合成咖啡酸。为此，需要下述酶。为了将酪氨酸转变成l
‑
dopa(3,4
‑
二羟基
‑
l
‑
苯丙氨酸)，需要两个亚基hpab和hpac。
282.hpab是4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab).
283.优选地，该酶是由细菌、优选为大肠埃希氏杆菌产生的酶。
284.在特定实施方式中，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶(hpab)是包含选自seq id no：83的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶活性的多肽。
285.在特定实施方式中，所述hpab来自于大肠埃希氏杆菌。它被描述在ncbi的genbank数据库中，蛋白质序列在编号caq34705.1下，更特别是在seq id no：83中。编码该酶的核酸序列描述在seq id no：84中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号a0a140ng21下。
286.hpac是4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基。因此，所述微生物可以包含编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)的异源核酸序列。
287.术语“对香豆酸3
‑
羟化酶活性”意味着使用由hpab(4
‑
羟基苯乙酸3
‑
羟化酶氧化酶)和hpac(4
‑
羟基苯乙酸3
‑
羟化酶还原酶)组成的酶复合体将对香豆酸转化成咖啡酸和/或将l
‑
酪氨酸转化成l
‑
dopa。为了确定是否存在对香豆酸3
‑
羟化酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由酶hpab、hpac、对香豆酸或l
‑
酪氨酸、fad和nadh组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在hplc
‑
ms中观察咖啡酸或l
‑
dopa的出现，并与预期的标准品进行比较。
288.优选地，这种酶是由细菌、优选为大肠埃希氏杆菌产生的酶。
289.在特定实施方式中，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶(hpac)是包含选自seq id no：85的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶活性的多肽。
290.在特定实施方式中，所述hpac来自于大肠埃希氏杆菌。它被描述在ncbi的genbank数据库中，蛋白质序列在编号caq34704.1下，更特别是在seq id no：85中。编码该酶的核酸序列被描述在seq id no：86中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号a0a140ng67下。
291.合在一起，hpab和hpac能够从酪氨酸产生l
‑
dopa(3,4
‑
二羟基
‑
l
‑
苯丙氨酸)。
292.因此，所述微生物可以包含编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶(hpab)的异源核酸序列和编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶(hpac)的异源核酸序列。
293.此外，这个途径还需要存在能够从l
‑
dopa(3,4
‑
二羟基
‑
l
‑
苯丙氨酸)合成咖啡酸的酶，即二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)。该酶属于ec 4.3.1.11类别。
294.术语“二羟基苯丙氨酸解氨酶活性”意味着利用二羟基苯丙氨酸解氨酶将l
‑
dopa转化成反式
‑
咖啡酸。为了确定是否存在二羟基苯丙氨酸解氨酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由二羟基苯丙氨酸解氨酶和l
‑
dopa(左旋多巴)组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在uplc
‑
ms中观察反式
‑
咖啡酸的出现，并与预期的标准品进行比较。
295.此外，二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)也可能具有酪氨酸解氨酶(tal)活性和/或苯丙氨酸解氨酶(pal)活性。
296.因此，所述微生物可以包含编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)的异源核酸序列、编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)的异源核酸序列和编码二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)的异源核酸序列。
297.作为使用hpab和hpac或与它们组合的替代方式，可以使用将酪氨酸转变成l
‑
dopa
的酶和将对香豆酸转变成咖啡酸的酶。
298.这些酶分别是：4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶，也被称为4
‑
甲氧基苯甲酸酯单加氧酶(o
‑
脱甲基化)，其具有l
‑
酪氨酸羟化酶活性，属于ec 1.14.99.15类别；和对香豆酸3
‑
羟化酶，其具有对香豆酸3
‑
羟化酶活性，属于ec 1.14.13类别。
299.这些各种不同的酶均形成细胞色素p450(cyp)家族的一部分。
300.术语“l
‑
酪氨酸羟化酶活性”意味着使用对香豆酸3
‑
羟化酶(cpr依赖性)将对香豆酸转化成咖啡酸和/或将l
‑
酪氨酸转化成l
‑
dopa。为了确定是否存在l
‑
酪氨酸羟化酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由对香豆酸3
‑
羟化酶、对香豆酸或l
‑
酪氨酸和必需的辅因子组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在hplc
‑
ms中观察咖啡酸或l
‑
dopa的出现，并与预期的标准品进行比较。
301.术语“对香豆酸3
‑
羟化酶活性”意味着使用对香豆酸3
‑
羟化酶(cpr依赖性)将对香豆酸转化成咖啡酸和/或将l
‑
酪氨酸转化成l
‑
dopa。为了确定是否存在对香豆酸3
‑
羟化酶活性，可以进行酶测试，其由下述步骤组成：将由对香豆酸3
‑
羟化酶、对香豆酸或l
‑
酪氨酸组成的混合物在最适条件(ph、温度、离子等)下体外温育。在一定温育时间后，在hplc
‑
ms中观察咖啡酸或l
‑
dopa的出现，并与预期的标准品进行比较。
302.因此，所述重组微生物可以包含编码能够将酪氨酸转变成l
‑
dopa并且也将对香豆酸转变成咖啡酸的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶(cyp)的异源核酸序列。
303.在一个实施方式中，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶是细菌酶，尤其是来自于沼泽红假单胞菌、恶臭假单胞菌或大肠埃希氏杆菌的细菌酶，植物酶，尤其是来自于甜菜(βeta vulgaris)的植物酶，哺乳动物酶，尤其是来自于穴兔(oryctolagus cuniculus)的哺乳动物酶，或真菌酶，尤其是来自于黏红酵母的真菌酶。在特定实施方式中，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶是来自于沼泽红假单胞菌、西班牙糖丝菌(saccharothrix espanaensis)或甜菜的酶。
304.在特定实施方式中，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶选自：包含选自seq id no：73和75的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有l
‑
酪氨酸水解酶活性的多肽。
305.所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶也可以来自于甜菜。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列分别描述在seq id no：74和73中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号p0dki2下。
306.此外，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶可以来自于西班牙糖丝菌。编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号nc_005296.1和wp_011157377.1下，更特别是在seq id no：76和75中。所述蛋白质描述在uniprotkb/swiss prot中参考编号q6n8n2下。
307.在一个实施方式中，所述微生物可以包含编码4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶的异源核酸序列和编码二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)的异源核酸序列。
308.因此，所述重组微生物可以包含编码能够将对香豆酸转变成咖啡酸的香豆酸3
‑
羟化酶(coum3h)的异源核酸序列。
309.在一个实施方式中，所述香豆酸3
‑
羟化酶是细菌酶，尤其是来自于糖丝菌属(saccharothrix)的细菌酶。
310.在特定实施方式中，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶选自：包含选自seq id no：71的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有香豆酸3
‑
羟化酶活性的多肽。
311.编码该酶的核酸序列和蛋白质序列描述在ncbi中，分别在参考编号dq357071.1和abc88666.1下，更特别是在seq id no：72和71中。
312.在一个实施方式中，所述微生物可以包含编码香豆酸3
‑
羟化酶的异源核酸序列和编码二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)的异源核酸序列。
313.酶的其他组合
314.因此，除了如上所述从柚皮素和/或芹菜素生物合成圣草酚和/或木犀草素所需的酶之外，所述微生物优选地还包含用于从酪氨酸和/或苯丙氨酸、优选地从酪氨酸产生柚皮素和/或芹菜素的酶。
315.因此，根据特定实施方式，所述微生物包含编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，编码f3’h酶的异源核酸序列，和任选的编码fns酶的异源核酸序列和编码cpr酶的异源核酸序列，并且还包含编码酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列、编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列、编码查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列和编码查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列。
316.在一个实施方式中，所述微生物包含：
317.‑
编码来自于黏红酵母或约氏黄杆菌的酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)特别是包含选自seq id no：41和39的序列的tal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
318.‑
编码来自于拟南芥、克莱门柚、荷兰芹或棒状链霉菌的4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)特别是包含选自seq id no：97、99、45、43、47和49的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：97、99和45的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；和
319.‑
编码来自于甜橙、大麦或棒状链霉菌的查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)特别是包含选自seq id no：53、51、55和57的序列的chs和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；和
320.‑
编码来自于拟南芥或棒状链霉菌的查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)特别是包含选自seq id no：61和59的序列的chi和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：61的序列的chi和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序
列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽。
321.优选地，在这个实施方式中，所述微生物包含上述酶omt和f3’h以及任选的fns和cpr的组合之一，特别是：
322.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于克莱门柚、甜橙、拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：91、93、87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：91和93的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：91的序列的omt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；和
323.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：7、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：7的序列的酶和包含与该序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；和
324.‑
任选的编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)是包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是选自：包含选自seq id no：25的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；和
325.‑
任选的编码黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)是包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：33、35和37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
326.优选地，在这个实施方式中，所述微生物还包含：
327.‑
编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)特别是包含选自seq id no：63、65和77、优选为seq id no：65和77的序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多
肽，更特别优选为包含选自seq id no：65的序列的苯丙氨酸解氨酶(pal)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽；和
328.‑
编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)特别是包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：79的序列的肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽。
329.在另一个实施方式中，所述微生物包含：
330.‑
编码酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)选自：包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
331.‑
编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)选自：包含选自seq id no：97、99和45的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；和
332.‑
编码查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)选自：包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；和
333.‑
编码查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)选自：包含选自seq id no：61的序列的chi和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽。
334.优选地，在这个实施方式中，所述微生物包含上述酶omt和f3’h以及任选的fns和cpr的组合之一，特别是：
335.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于克莱门柚、甜橙、拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：91、93、87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：91和93的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：91的序列的omt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；和
336.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：7、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，
最特别优选为包含选自seq id no：7的序列的酶和包含与该序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；和
337.‑
任选的编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)是包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是选自：包含选自seq id no：25的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；和
338.‑
任选的编码黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)是包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：33、35和37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
339.优选地，在这个实施方式中，所述微生物还包含：
340.‑
编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)特别是包含选自seq id no：63、65和77、优选为seq id no：65和77的序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽，更特别优选为包含选自seq id no：65的序列的苯丙氨酸解氨酶(pal)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽；和
341.‑
编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)特别是包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽，更特别优选为包含选自seq id no：79的序列的肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽。
342.在另一个特定实施方式中，所述微生物包含：
343.‑
编码能够从酪氨酸产生对香豆酸的酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)优选地来自于黏红酵母或约氏黄杆菌，特别是包含选自seq id no：39和41的序列的tal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
344.‑
编码能够从对香豆酸和辅酶a产生香豆酰辅酶a的4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)优选地来自于拟南芥、荷兰芹或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：43、45、47和49的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％
序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；
345.‑
编码能够从4
‑
香豆酰辅酶a和丙二酰辅酶a产生柚皮素
‑
查尔酮的查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)优选地来自于甜橙、大麦或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：51、53、55和57的序列的chs和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选选自：包含选自seq id no：53和55的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；
346.‑
编码能够从柚皮素查尔酮产生柚皮素的查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)优选地来自于拟南芥或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：59和61的序列的chi和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：61的序列的chi和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽；
347.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)优选地来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙和山柳兰，优选为包含选自seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的序列的f3’h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：1、5、7、11、17和19的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：5、7和17的序列的f3’h和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：7的序列的f3’h和包含与序列seq id no：7具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；
348.‑
编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)优选为来自于酿酒酵母或来自于植物例如长春花或拟南芥的cpr，优选为包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：25的序列的cpr和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；
349.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选地选自包含序列seq id no：89的酶和包含与该序列具有至少
60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；
350.‑
任选的编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的异源或内源核酸序列，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)特别是来自于酿酒酵母的samt，例如包含选自seq id no：81的序列的samt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶活性的多肽；和
351.‑
任选的编码能够将柚皮素转化成芹菜素、将圣草酚转化成木犀草素和/或将橙皮素转化成香叶木素，优选地将圣草酚转化成木犀草素的黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)优选为来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨、玉米、翠菊、芹菜、蒺藜状苜蓿、孜然、毒欧芹、圆叶当归、毒芹、茶树、朝鲜蓟、水母雪莲、毛喉鞘蕊花、黄芩、旋蒴苣苔、金鱼草、回回苏、大丽花或erythranthe lewisii，特别是来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨或玉米，优选地来自于金银花、灰毡毛忍冬和荷兰芹的fns，优选为包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的fns和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽。
352.在特定实施方式中，所述微生物包含如前面的实施方式中所述的编码酶4cl、chs、chi、f3’h、cpr和omt的异源核酸序列以及任选的编码酶samt和fns的异源核酸序列，并且还包含：
353.‑
编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)特别是包含选自seq id no：63、65和77的序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：65的序列的pal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽，以及编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)特别是包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有能够从苯丙氨酸产生对香豆酸的肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：79的序列的c4h和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽。
354.在另一个特定实施方式中，所述微生物包含如前面的实施方式中所述的编码酶4cl、chs、chi、f3’h、cpr和omt的异源核酸序列以及任选的编码酶samt和fns的异源核酸序列，并且还包含：
355.‑
编码能够从l
‑
dopa(3,4
‑
二羟基
‑
l
‑
苯丙氨酸)产生咖啡酸的二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)的异源核酸序列；
356.‑
编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)的异源核酸序列，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)优选地选自：包含选自seq id no：83的序列的hpab和包含与其具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加
氧酶加氧酶活性的多肽，以及编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)的异源核酸序列，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)优选地选自：包含选自seq id no：85的序列的hpac和包含与其具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶活性的多肽；或编码能够将酪氨酸转变成l
‑
dopa并且也将对香豆酸转变成咖啡酸的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶的异源核酸序列，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶优选地选自：包含选自seq id no：73和75的序列的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有l
‑
酪氨酸羟化酶活性的多肽；或编码能够将对香豆酸转变成咖啡酸的对香豆酸3
‑
羟化酶的异源核酸序列，所述对香豆酸3
‑
羟化酶优选地选自：包含选自seq id no：71的序列的对香豆酸3
‑
羟化酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有对香豆酸3
‑
羟化酶活性的多肽。
357.在另一个特定实施方式中，所述微生物包含如前面的实施方式中所述的编码酶4cl、chs、chi、f3’h、cpr和omt的异源核酸序列以及任选的编码酶samt和fns的异源核酸序列，并且还包含：
358.‑
编码能够从酪氨酸产生对香豆酸的酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)优选地来自于黏红酵母或约氏黄杆菌，特别是包含选自seq id no：39和41的序列的tal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
359.‑
任选的编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)特别是包含选自的seq id no：63、65和77序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽，和编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列，所述编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)特别是包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有能够从苯丙氨酸产生对香豆酸的肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽；
360.‑
任选的编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)的异源核酸序列，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)优选地选自：包含选自seq id no：83的序列的hpab和包含与其具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶活性的多肽，和编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)的异源核酸序列，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)优选地选自：包含选自seq id no：85的序列的hpac和包含与其具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶活性的多肽；或编码能够将酪氨酸转变成l
‑
dopa并且也将对香豆酸转变成咖啡酸的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶的异源核酸序列，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶优选地选自：包含选自seq id no：73和75的序列的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有l
‑
酪氨酸水解酶活性的多肽；或编码能够将对香豆酸转变成咖啡酸的对香豆酸3
‑
羟化酶的异源核酸序列，所述对香豆酸3
‑
羟化酶优选地选自：包含选自seq id no：71的序列的对香豆酸3
‑
羟化酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有对香豆酸3
‑
羟化酶活性的多肽；
361.‑
任选的编码能够从l
‑
dopa(3,4
‑
二羟基
‑
l
‑
苯丙氨酸)产生咖啡酸的二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)的异源核酸序列。
362.在另一个特定实施方式中，所述微生物包含：
363.‑
编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)选自：包含选自seq id no：65的序列的苯丙氨酸解氨酶(pal)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽；
364.‑
编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)选自：包含选自seq id no：79的序列的肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽；
365.‑
编码酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)选自：包含选自seq id no：41的序列的酪氨酸解氨酶(tal)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
366.‑
编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)选自：包含选自seq id no：45或97的序列的4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；
367.‑
编码查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)选自：包含选自seq id no：53的序列的查尔酮合酶(chs)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；
368.‑
编码查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)选自：包含选自seq id no：61的序列的查尔酮异构酶(chi)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽；
369.‑
编码黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)选自：包含选自seq id no：7的序列的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)和包含与序列seq id no：7具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；
370.‑
编码黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)选自：包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽；和
371.‑
编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)选自：包含选自seq id no：25的序列的细胞色素p450还原酶(cpr)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；和
372.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)选自：包含选自seq id no：91和93的序列的o
‑
甲基转移酶(omt)和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：91的序列的omt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
373.优选地，所述微生物还包含编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的异源或内源核酸
序列，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)特别是包含选自seq id no：81的序列的samt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶活性的多肽。
374.所述酶或一组酶的起源可以被选择成使得它们的起源相同或相近。例如，所述酶或一组酶可以从细菌，例如从同一属或同一物种的细菌获得。在另一个实例中，所述酶或一组酶可以从植物，例如从同一属或同一物种的植物获得。原因是这些共同的起源能够使所述酶一起最适地发挥作用。
375.在一个实施方式中，所述微生物包含用于酪氨酸生物合成的代谢途径。尤其是，所述微生物可能已被修饰，以具有相对于野生型菌株提高的酪氨酸生产。尤其是，所述微生物可能已被修饰，以使碳流重新导向酪氨酸生物合成。此外，所述微生物可能已被修饰，以降低或抑制酪氨酸生物合成反馈抑制。
376.在另一个实施方式中，所述微生物包含用于苯丙氨酸生物合成的代谢途径。尤其是，所述微生物可能已被修饰，以具有相对于野生型菌株提高的苯丙氨酸生产。尤其是，所述微生物可能已被修饰，以使碳流重新导向苯丙氨酸生物合成。此外，所述微生物可能已被修饰，以降低或抑制苯丙氨酸生物合成反馈抑制。
377.在另一个实施方式中，所述微生物包含用于苯丙氨酸和酪氨酸生物合成的代谢途径。尤其是，所述微生物可能已被修饰，以具有相对于野生型菌株提高的苯丙氨酸和酪氨酸生产。尤其是，所述微生物可能已被修饰，以使碳流重新导向苯丙氨酸和酪氨酸生物合成。此外，所述微生物可能已被修饰，以降低或抑制苯丙氨酸和酪氨酸生物合成反馈抑制。
378.重组核酸和表达盒
379.编码如前所述的酶的每个核酸序列被包括在表达盒中。优选地，所述编码核酸序列已被优化用于在宿主微生物中表达。所述编码核酸序列被操作性连接到所述基因的表达、尤其是转录和翻译所需的元件。这些元件被选择成在宿主重组微生物中有功能。这些元件可以包括例如转录启动子、转录激活子、终止子序列和起始和终止密码子。随着需要在其中表达的宿主细胞而选择这些元件的方法对于本领域技术人员来说是公知的。
380.优选地，所述启动子是强启动子。所述启动子任选地可以是可诱导的。
381.例如，如果所述微生物是原核的，则所述启动子可以选自下述启动子：lacl，lacz，plact，ptac，para，pbad，噬菌体t3或t7的rna聚合酶启动子，多角体蛋白启动子，λ噬菌体的pr或pl启动子。在一个特定实施方式中，所述启动子是plac。如果所述微生物是真核的，特别是酵母，则所述启动子可以选自下述启动子：启动子ptdh3，启动子ptef1，启动子ptef2，启动子pccw12，启动子phhf2，启动子phtb2和启动子prpl18b。可以在酵母中使用的诱导型启动子的实例是启动子teto
‑
2、gal10、gal10
‑
cyc1和pho5。
382.包含编码所描述的酶或它们中的一些的组合的核酸序列的表达盒的全部或一部分，可以被包含在共同的表达载体或不同的表达载体中。
383.因此，本发明涉及一种载体，其包含编码omt的核酸序列和选自下述的至少一个核酸序列：编码f3’h的核酸序列，编码cpr的核酸序列，编码fns的核酸序列，编码samt的核酸序列，编码tal的核酸序列，编码4cl的核酸序列，编码chs的核酸序列，编码chi的核酸序列，编码pal的核酸序列，编码c4h的核酸序列，编码hpab的核酸序列和编码dal的核酸序列，这些酶中的每一者如上所定义，并且还包括其组合。
384.优选地，所述载体包含编码omt的核酸序列和选自下述的至少一个核酸序列：编码f3’h的核酸序列，编码cpr的核酸序列，编码fns的核酸序列，编码tal的核酸序列，编码4cl的核酸序列，编码chs的核酸序列，编码chi的核酸序列，以及任选的编码pal的核酸序列和编码c4h的核酸序列。
385.根据一个实施方式，所述载体包含：
386.‑
编码特别是能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选地选自包含序列seq id no：89的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；和
387.‑
选自下述的至少一个核酸序列：
388.o编码能够在柚皮素和/或芹菜素的3’位中添加羟基，特别是能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)优选地来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙、克莱门柚、蓝眼菊、黄孢原毛平革菌、阿维链霉菌或山柳兰，特别是来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙或山柳兰，优选为包含选自seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的序列的f3’h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：1、5、7、11、17和19的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：5、7和17的序列的f3’h和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；
389.o编码细胞色素p450还原酶的核酸序列，所述细胞色素p450还原酶优选为来自于酿酒酵母或来自于植物例如长春花或拟南芥的cpr，优选为包含选自seq id no：23、25、27和29的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23和25的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；
390.o编码特别是能够将柚皮素转变成芹菜素、将圣草酚转变成木犀草素和/或将橙皮素转变成香叶木素，优选地将圣草酚转变成木犀草素的黄酮合酶(fns)的核酸序列，所述黄酮合酶(fns)优选为来自于拟南芥、荷兰芹、玉米、金银花、灰毡毛忍冬、翠菊、芹菜、蒺藜状苜蓿、孜然、毒欧芹、圆叶当归、毒芹、茶树、朝鲜蓟、水母雪莲、毛喉鞘蕊花、黄芩、旋蒴苣苔、金鱼草、回回苏、大丽花或erythranthe lewisii，特别是来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨或玉米，优选地来自于金银花、灰毡毛忍冬和荷兰芹的fns，优选为包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的fns和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列
同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽；
391.o编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的核酸序列，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)特别是来自于酿酒酵母的samt，例如包含选自seq id no：81的序列的samt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶活性的多肽；
392.o编码特别是能够从酪氨酸产生对香豆酸的酪氨酸解氨酶(tal)的核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)优选地来自于黏红酵母或约氏黄杆菌，特别是包含选自seq id no：39和41的序列的tal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
393.o编码特别是能够从对香豆酸和辅酶a产生4
‑
香豆酰辅酶a并从咖啡酸和辅酶a产生咖啡酰辅酶a的4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)优选地来自于拟南芥、荷兰芹或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：43、45、47和49的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：45和49的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；
394.o编码特别是能够从4
‑
香豆酰辅酶a和丙二酰辅酶a产生柚皮素
‑
查尔酮并从咖啡酰辅酶a和丙二酰辅酶a产生圣草酚
‑
查尔酮的查尔酮合酶(chs)的核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)优选地来自于甜橙、大麦或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：51、53、55和57的序列的chs和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：53和55的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；
395.o编码特别是能够从柚皮素查尔酮产生柚皮素并从圣草酚
‑
查尔酮产生圣草酚的查尔酮异构酶(chi)的核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)优选地来自于拟南芥或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：59和61的序列的chi和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽；
396.o编码特别是能够从苯丙氨酸产生肉桂酸的苯丙氨酸解氨酶(pal)的核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)优选为包含选自seq id no：63、65和77的序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽；
397.o编码特别是能够从肉桂酸产生对香豆酸的肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的核酸序列，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)优选为包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性
的多肽；
398.o编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)的核酸序列，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)优选地选自包含序列seq id no：83的hpab和包含与其具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶活性的多肽，和编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)的核酸序列，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)优选地选自：包含选自seq id no：85的序列的hpac和包含与其具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶活性的多肽；或编码能够将酪氨酸转变成l
‑
dopa并且也将对香豆酸转变成咖啡酸的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶优选地选自：包含选自seq id no：73和75的序列的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有l
‑
酪氨酸水解酶活性的多肽的核酸序列；或编码能够将对香豆酸转变成咖啡酸的对香豆酸3
‑
羟化酶的异源核酸序列，所述对香豆酸3
‑
羟化酶优选地选自：包含选自seq id no：71的序列的对香豆酸3
‑
羟化酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有对香豆酸3
‑
羟化酶活性的多肽的异源核酸序列，和
399.o编码二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)的核酸序列。
400.在优选实施方式中，所述载体包含：
401.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于克莱门柚、甜橙、拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：91、93、87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：91和93的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：91的序列的omt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；
402.和选自下述的至少一个核酸序列：
403.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：7、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：7的序列的酶和包含与该序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；和
404.‑
编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)是包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是包
含选自seq id no：25的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；和
405.‑
编码黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)是包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：33、35和37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽；和
406.‑
编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的核酸序列，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)特别是来自于酿酒酵母的samt，例如包含选自seq id no：81的序列的samt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶活性的多肽；
407.‑
编码酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)来自于黏红酵母或约氏黄杆菌，特别是包含选自seq id no：41和39的序列的tal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
408.‑
编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)来自于拟南芥、克莱门柚、荷兰芹或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：97、99、45、43、47和49的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：97、99和45的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；和
409.‑
编码查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)来自于甜橙、大麦或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：53、51、55和57的序列的chs和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；和
410.‑
编码查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)来自于拟南芥或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：61和59的序列的chi和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：61的序列的chi和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽。
411.优选地，所述载体包含这些序列中的每一者。
412.任选地，在这个实施方式中，所述载体还可以包含：
413.‑
编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)特别是
包含选自seq id no：63、65和77、优选为seq id no：65和77的序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽，更特别优选为包含选自seq id no：65的序列的苯丙氨酸解氨酶(pal)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽；和
414.‑
编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)特别是包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：79的序列的肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽。
415.在另一个优选实施方式中，所述载体包含：
416.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于克莱门柚、甜橙、拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：91、93、87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：91和93的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：91的序列的omt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；
417.和选自下述的至少一个核酸序列：
418.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：7、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：7的序列的酶和包含与该序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；
419.‑
编码酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)选自：包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；和
420.‑
编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)选自：包含选自seq id no：97、99和45的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；和
421.‑
编码查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)选自：包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；和
422.‑
编码查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)选自：包含选自seq id no：61的序列的chi和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性
的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽；编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)是包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：25的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；和
423.‑
编码黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)是包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽；和
424.‑
编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的核酸序列，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)特别是来自于酿酒酵母的samt，例如包含选自seq id no：81的序列的samt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶活性的多肽。
425.优选地，在这个实施方式中，所述编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列编码的4cl选自：包含选自seq id no：45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽。优选地，在这个实施方式中，所述载体还包含：
426.‑
编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)特别是包含选自seq id no：63、65和77、优选为seq id no：65和77的序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽，更特别优选为包含选自seq id no：65的序列的苯丙氨酸解氨酶(pal)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽；和
427.‑
编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)特别是包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：79的序列的肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽。
428.在特定实施方式中，所述载体包含：
429.‑
编码特别是能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶的核酸序列，和编码特别是能够在柚皮素和/或芹菜素的3’位中添加羟基的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列；或
430.‑
编码特别是能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列；编码特别是能够在柚皮素和/或芹菜素的3’位中添加羟基的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列；和编码细胞色素p450还原酶的异源核酸序列；或
431.‑
编码特别是能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列；和编码能够将柚皮素转化成芹菜素、将圣草酚转化成木犀草素和/或将橙
皮素转化成香叶木素，优选地将圣草酚转化成木犀草素的黄酮合酶(fns)的异源核酸序列；或
432.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶的异源核酸序列；编码能够在柚皮素和/或芹菜素的3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列；编码细胞色素p450还原酶的异源核酸序列；和编码能够将柚皮素转化成芹菜素、将圣草酚转化成木犀草素和/或将橙皮素转化成香叶木素，优选地将圣草酚转化成木犀草素的黄酮合酶(fns)的异源核酸序列。
433.因此，所述载体可以包含从其中选择的几个核酸序列，尤其是从其中选择的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸序列。
434.所述载体尤其可以包含如上所述的特定编码序列的组合。
435.载体包含编码序列，所述编码序列可以是异源的，只要所述编码序列可以为所述宿主微生物进行优化即可，可以在异源启动子控制之下，和/或可以与不源自于同一起源生物和/或不以同样的排列方式存在的编码序列组合。
436.所述载体可以是能够在其中插入外来核酸的任何dna序列，所述载体使得可以将外来dna引入到宿主微生物中。例如，所述载体可以是质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体，尤其是yac或bac。
437.所述表达载体可以包含编码选择标志物的核酸序列。所述选择标志物可以是一种或多种抗生素的抗性基因或营养缺陷型基因。所述营养缺陷型基因可以是例如ura3、leu2、his5或trp1。所述抗生素抗性基因优选可以是例如氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素、遗传霉素和/或诺尔丝菌素的抗性基因。
438.载体在宿主微生物中的引入是本领域技术人员公知的方法。尤其是几种方法被描述在《分子生物学现代方法》(current protocols in molecular biology)，13.7.1
‑
13.7.10或ellis t.等，integrative biology,2011,3(2),109
‑
118中。
439.所述宿主微生物可以被瞬时或稳定转化/转染，并且所述核酸、表达盒或载体可以以游离体形式或并入在宿主微生物的基因组中的形式包含在其中。
440.所述表达载体还可以包含允许所述载体、表达盒或核酸在宿主微生物的基因组中定点插入的一个或多个序列。
441.全部或一部分包含编码如上所述的酶或某些酶的组合的核酸序列的表达盒，可以被插入到所述重组微生物的染色体中。
442.相反，全部或一部分包含编码如上所述的酶或某些酶的组合的核酸序列的表达盒，可以以游离体形式，尤其是质粒形式保留。
443.任选地，所述微生物可能包含编码如前所述的酶的核酸序列的几个拷贝。尤其是，它可能包含编码如前所述的酶的核酸序列的2至10个拷贝，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝。
444.本发明涉及一种制备根据本发明所述的微生物的方法，所述方法包括将如上所定义的载体引入到所述微生物中，并选择包含所述载体的微生物。本发明还涉及一种制备根据本发明所述的微生物的方法，所述方法包括将编码特别是能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶的核酸序列引入到所述微生物中，并选择包含所述核酸序列的微生物。所述方法还可以包括引入选自下述的一个或多个核酸序列：
445.‑
编码能够在柚皮素和/或芹菜素的3’位中添加羟基，特别是能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)优选地来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙、克莱门柚、蓝眼菊、黄孢原毛平革菌、阿维链霉菌或山柳兰，特别是来自于回回苏、矮牵牛、翠菊、非洲菊、甜橙或山柳兰，优选为包含选自seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的序列的f3’h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：1、5、7、11、17和19的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：5、7和17的序列的f3’h和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：7的序列的f3’h和包含与序列seq id no：7具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽；
446.‑
编码细胞色素p450还原酶的核酸序列，所述细胞色素p450还原酶优选为来自于酿酒酵母或来自于植物例如长春花或拟南芥的cpr，优选为包含选自seq id no：23、25、27和29的序列的cpr和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23和25的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：25的序列的cpr和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；
447.‑
编码特别是能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：89的序列的酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；
448.‑
编码能够将柚皮素转化成芹菜素、将圣草酚转化成木犀草素和/或将橙皮素转化成香叶木素，优选地将圣草酚转化成木犀草素的黄酮合酶(fns)的核酸序列，所述黄酮合酶(fns)优选为来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨、玉米、翠菊、芹菜、蒺藜状苜蓿、孜然、毒欧芹、圆叶当归、毒芹、茶树、朝鲜蓟、水母雪莲、毛喉鞘蕊花、黄芩、旋蒴苣苔、金鱼草、回回苏、大丽花或erythranthe lewisii，特别是来自于拟南芥、金银花、灰毡毛忍冬、蒺藜状苜蓿、水稻、荷兰芹、美洲黑杨或玉米，优选地来自于金银花、灰毡毛忍冬和荷兰芹的fns，优选为包含选自seq id no：33、35、37、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的序列的fns和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：33、35和37的序列的fns和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一
性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽；
449.‑
编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的核酸序列，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)特别是来自于酿酒酵母的samt，例如包含选自seq id no：81的序列的samt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶活性的多肽；
450.‑
编码特别是能够从酪氨酸产生对香豆酸的酪氨酸解氨酶(tal)的核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)优选地来自于黏红酵母或约氏黄杆菌，特别是包含选自seq id no：39和41的序列的tal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
451.‑
编码特别是能够从对香豆酸和辅酶a产生香豆酰辅酶a并从咖啡酸和辅酶a产生咖啡酰辅酶a的4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的核酸序列，所述4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)优选地来自于拟南芥、荷兰芹或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：43、45、47和49的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：45和49的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；
452.‑
编码特别是能够从4
‑
香豆酰辅酶a和丙二酰辅酶a产生柚皮素
‑
查尔酮并从咖啡酰辅酶a和丙二酰辅酶a产生圣草酚
‑
查尔酮的查尔酮合酶(chs)的核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)优选地来自于甜橙、大麦或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：51、53、55和57的序列的chs和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：53和55的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；
453.‑
编码特别是能够从柚皮素
‑
查尔酮产生柚皮素并从圣草酚
‑
查尔酮产生圣草酚的查尔酮异构酶(chi)的核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)优选地来自于拟南芥或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：59和61的序列的chi和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：61的序列的chi和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽；
454.‑
编码特别是能够从苯丙氨酸产生肉桂酸的苯丙氨酸解氨酶(pal)的核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)优选为包含选自seq id no：63、65和77的序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：65的序列的pal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽；
455.‑
编码特别是能够从肉桂酸产生对香豆酸的肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的核酸序列，所
述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)优选为包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：79的序列的c4h和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽；
456.‑
编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)的核酸序列，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶亚基(hpab)优选地选自包含序列seq id no：83的hpab和包含与其具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶加氧酶活性的多肽，和编码4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)的核酸序列，所述4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶亚基(hpac)优选地选自包含序列seq id no：85的hpac和包含与其具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
羟基苯乙酸3
‑
单加氧酶还原酶活性的多肽；或编码能够将酪氨酸转变成l
‑
dopa并且也将对香豆酸转变成咖啡酸的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶的核酸序列，所述4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶优选地选自：包含选自seq id no：73和75的序列的4
‑
甲氧基苯甲酸酯o
‑
脱甲基酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有l
‑
酪氨酸水解酶活性的多肽；或编码能够将对香豆酸转变成咖啡酸的对香豆酸3
‑
羟化酶的异源核酸序列，所述对香豆酸3
‑
羟化酶优选地选自：包含选自seq id no：71的序列的对香豆酸3
‑
羟化酶和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有对香豆酸3
‑
羟化酶活性的多肽；和
457.‑
编码二羟基苯丙氨酸解氨酶(dal)的核酸序列。
458.优选地，所述方法包括引入如上所述的特定编码序列的组合。
459.根据优选实施方式，所述方法包括引入：
460.‑
编码能够将圣草酚和/或木犀草素在4’位中甲基化的o
‑
甲基转移酶(omt)的异源核酸序列，所述o
‑
甲基转移酶(omt)优选为来自于克莱门柚、甜橙、拟南芥或智人的omt，优选为包含选自seq id no：91、93、87和89的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有尤其是使用圣草酚和/或木犀草素作为底物并在4’位中进行甲基化的o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：91和93的序列的omt和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：91的序列的omt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽；
461.和选自下述的至少一个核酸序列：
462.‑
编码能够将柚皮素和/或芹菜素在3’位中羟基化的黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)的异源核酸序列，所述黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶(f3’h)特别是包含选自seq id no：7、11、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：7、17和95的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：7的序列的酶和包含与该序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列并具有黄酮类化合物3
’‑
单加氧酶活性
的多肽；和
463.‑
编码细胞色素p450还原酶(cpr)的异源核酸序列，所述细胞色素p450还原酶(cpr)是包含选自seq id no：23、25、27、29和31的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，优选地选自：包含选自seq id no：23、25和29的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：25的序列的cpr和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有细胞色素p450还原酶活性的多肽；和
464.‑
编码黄酮合酶(fns)的异源核酸序列，所述黄酮合酶(fns)是包含选自seq id no：33、35和37的序列的酶和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：37的序列的黄酮合酶(fns)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有黄酮合酶活性的多肽；和
465.‑
编码s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)的核酸序列，所述s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(samt)特别是来自于酿酒酵母的samt，例如包含选自seq id no：81的序列的samt和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有s
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶活性的多肽，和
466.‑
编码酪氨酸解氨酶(tal)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)来自于黏红酵母或约氏黄杆菌，特别是包含选自seq id no：41和39的序列的tal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：41的序列的tal和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有酪氨酸解氨酶活性的多肽；
467.‑
编码4
‑
香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的异源核酸序列，所述酪氨酸解氨酶(tal)来自于拟南芥、克莱门柚、荷兰芹或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：97、99、45、43、47和49的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：97、99和45的序列的4cl和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：45的序列的4cl和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有4
‑
香豆酰辅酶a连接酶活性的多肽；和
468.‑
编码查尔酮合酶(chs)的异源核酸序列，所述查尔酮合酶(chs)来自于甜橙、大麦或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：53、51、55和57的序列的chs和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽，特别是包含选自seq id no：53的序列的chs和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮合酶活性的多肽；和
469.‑
编码查尔酮异构酶(chi)的异源核酸序列，所述查尔酮异构酶(chi)来自于拟南芥或棒状链霉菌，特别是包含选自seq id no：61和59的序列的chi和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽，优选为包含选自seq id no：61的序列的chi和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序
列同一性的序列并具有查尔酮异构酶活性的多肽。
470.优选地，所述方法包括引入所有这些序列。
471.优选地，所述方法还包括引入：
472.‑
编码苯丙氨酸解氨酶(pal)的异源核酸序列，所述苯丙氨酸解氨酶(pal)特别是包含选自seq id no：63、65和77、优选为seq id no：65和77的序列的pal和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽，更特别优选为包含选自seq id no：65的序列的苯丙氨酸解氨酶(pal)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性的多肽；和
473.‑
编码肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)的异源核酸序列，所述肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)特别是包含选自seq id no：67、69和79的序列的c4h和包含与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽，最特别优选为包含选自seq id no：79的序列的肉桂酸4
‑
羟化酶(c4h)和包含与该序列具有至少60、70、80、85、90或95％序列同一性的序列并具有肉桂酸4
‑
羟化酶活性的多肽。
474.香叶木素和/或橙皮素的生产
475.本发明涉及根据本发明所述的微生物用于生产香叶木素和/或橙皮素的用途。在第一优选实施方式中，本发明涉及根据本发明所述的微生物用于生产香叶木素的用途。在第二优选实施方式中，本发明涉及根据本发明所述的微生物用于生产橙皮素的用途。在优选实施方式中，本发明涉及根据本发明所述的微生物用于生产香叶木素和橙皮素的用途。
476.本发明还涉及一种生产香叶木素和/或橙皮素的方法，所述方法包括培养根据本发明所述的微生物，尤其是在允许或有利于香叶木素和/或橙皮素的生产的条件下培养根据本发明所述的微生物，和任选地回收和/或纯化生产的香叶木素和/或橙皮素。
477.香叶木素和/或橙皮素可以是最终产品或用于制备其他产品的合成或生物合成中间体。
478.在试图生产橙皮素的实施方式中，来自于克莱门柚、甜橙或拟南芥或哺乳动物起源、优选为人类起源(智人)的o
‑
甲基转移酶(omt)是优选的，优选地来自于克莱门柚、甜橙或拟南芥，甚至更优选地来自于克莱门柚。具体来说，在这个实施方式中，所述omt可以选自seq id no：91、93、89和87的酶和与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选地选自seq id no：91、93和87的酶和与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，最特别优选地选自seq id no：91的酶和与该序列具有至少60,70,80,85,90或95％同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
479.在试图生产橙皮素的实施方式中，所述微生物中不必需存在黄酮合酶，特别是能够从圣草酚产生木犀草素和/或从橙皮素产生香叶木素的黄酮合酶。
480.在试图生产香叶木素的实施方式中，来自于拟南芥或甜橙或哺乳动物起源、优选为人类起源(智人)的o
‑
甲基转移酶(omt)是优选的，优选地来自于人类起源或甜橙。具体来说，在这个实施方式中，所述omt可以选自seq id no：93、89和87的酶和与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选地选自seq id no：93和89的酶和与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，最特别优选地选自seq id no：93的酶和与该序列具有至少60、70、80、85、
90或95％同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
481.在试图生产香叶木素和橙皮素的实施方式中，哺乳动物起源、优选为人类起源(智人)或来自于克莱门柚、甜橙或拟南芥的o
‑
甲基转移酶(omt)是优选的，优选为人类起源或来自于甜橙。具体来说，在这个实施方式中，所述omt可以选自seq id no：91、93、87和89的酶和与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽，优选地选自seq id no：93和91的酶和与这些序列之一具有至少60、70、80、85、90或95％同一性并具有o
‑
甲基转移酶活性的多肽。
482.用于培养根据本发明所述的微生物的条件可以根据本领域技术人员公知的常规技术进行改编。
483.将所述微生物在适合的培养基中培养。术语“适合的培养基”通常是指提供对所述微生物的维持和/或生长来说必需或有益的营养物例如碳源、氮源如硫酸铵、磷源如磷酸二氢钾、微量元素如铜、碘、铁、镁、锌或钼盐、维生素和其他生长因子例如氨基酸或其他生长促进剂的培养基。如果需要，可以添加消泡剂。根据本发明，这种适合的培养基可以是化学限定的或复合的。因此，所述培养基可以与合成培养基在组成上一致或相近，正如由verduyn等人(yeast.1992.8:501
–
17)确定并由visser等人(biotechnology and bioengineering.2002.79:674
–
81)改变的，或者是可商购的例如ynb培养基(酵母氮源基础培养基，mp biomedicals或sigma
‑
aldrich)。尤其是，所述培养基可以包含简单碳源例如葡萄糖、果糖、木糖、乙醇、甘油、半乳糖、蔗糖、纤维素、纤维二糖、淀粉、葡萄糖聚合物、糖蜜或这些糖的副产品。
484.优选地，橙皮素和/或香叶木素通过根据本发明所述的微生物的生产在不向所述培养基供应柚皮素、芹菜素、圣草酚和/或木犀草素，优选地不向所述培养基供应柚皮素、芹菜素、圣草酚和木犀草素的情况下获得。
485.根据本发明，可以设想用于感兴趣的分子的工业规模生产的任何培养方法。有利情况下，所述培养在生物反应器中进行，尤其是采取分批、补料分批、恒化和/或连续培养模式。在过程中使用维生素的受控补料也可能对生产率有益(alfenore等，appl.microbiol.biotechnol.2002.60:67
–
72)。
486.所述培养通常在生物反应器中进行，可能具有使用适合的培养基在三角瓶中的固体和/或液体预培养步骤。
487.通常，用于培养根据本发明所述的微生物的条件可以由本领域技术人员根据所述微生物容易地改变。例如，尤其是对于酵母来说，培养温度在20℃至40℃之间，优选地在28℃至35℃之间，对于酿酒酵母来说更具体为约30℃。
488.根据本发明所述的微生物可以培养1至30天，优选为1至10天。
489.根据本发明所述的微生物优选地能够产生最低量为1mg/l培养基，优选地10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/l培养基，任选地150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/l培养基的香叶木素和/或橙皮素。
附图说明
490.图1：用于生产橙皮素和香叶木素的代谢途径的描述。
491.图2：通过菌株fl_405(f3’h4 cpr2)从柚皮素生产圣草酚。对照菌株：cf235。在菌
株fl
‑
405中观察柚皮素峰的消失和圣草酚峰的出现。
492.图3：通过菌株fl_405(f3’h4 cpr2)从芹菜素生产木犀草素。对照菌株：cf235。在菌株fl
‑
405中观察芹菜素峰的消失和木犀草素峰的出现。
493.图4：通过菌株sc744(fnsii1 cpr2)从柚皮素生产芹菜素。对照菌株：cf234。在所述菌株中观察柚皮素峰的消失和芹菜素峰的出现。
494.图5：通过sc744(fnsii1 cpr2)从圣草酚生产木犀草素。对照菌株：cf234。在所述菌株中观察圣草酚峰的消失和木犀草素峰的出现。
495.图6：通过菌株sc1500生产圣草酚和木犀草素。对照菌株：cf237。观察圣草酚和木犀草素峰。
496.图7：通过菌株sc 1612(met sam)和sc 1614(met sam)从圣草酚生产橙皮素。对照菌株：cf235。在所述菌株中观察圣草酚峰的消失和橙皮素峰的出现。
497.图8：通过菌株sc 1612(met sam)和sc 1614(met sam)从木犀草素生产香叶木素。对照菌株：cf235。在所述菌株中观察木犀草素峰的消失和香叶木素峰的出现。
498.图9：通过菌株sc744(fnsii cpr)从橙皮素生产香叶木素。对照菌株：cf234。在所述菌株中观察橙皮素峰的消失和香叶木素峰的出现。
499.图10：通过大肠埃希氏杆菌ec26(met sam)从圣草酚生产橙皮素。对照菌株：大肠埃希氏杆菌mh1。在所述菌株中观察圣草酚峰的消失和橙皮素峰的出现。
500.图11：通过大肠埃希氏杆菌ec26(met sam)从木犀草素生产香叶木素。对照菌株：大肠埃希氏杆菌mh1。在所述菌株中观察木犀草素峰的消失和香叶木素峰的出现。
501.图12：通过大肠埃希氏杆菌ec30(fnsii)从橙皮素生产香叶木素。对照菌株：大肠埃希氏杆菌mh1。在所述菌株中观察橙皮素峰的消失和香叶木素峰的出现。
502.图13：通过菌株sc1508生产橙皮素和香叶木素。对照菌株：cf237。观察橙皮素和香叶木素峰。
503.图14：通过大肠埃希氏杆菌ec41(met sam)从圣草酚生产橙皮素。对照菌株：大肠埃希氏杆菌mh1。在所述菌株中观察圣草酚峰的消失和橙皮素峰的出现。
504.图15：通过大肠埃希氏杆菌ec43(met sam)从圣草酚生产橙皮素。对照菌株：大肠埃希氏杆菌mh1。在所述菌株中观察圣草酚峰的消失和橙皮素峰的出现。
505.图16：通过大肠埃希氏杆菌ec43(met sam)从木犀草素生产香叶木素。对照菌株：大肠埃希氏杆菌mh1。在所述菌株中观察木犀草素峰的消失和香叶木素峰的出现。
506.图17：通过菌株sc2408生产橙皮素和香叶木素。对照菌株：cf237。观察橙皮素和香叶木素峰。
507.图18：通过菌株sc2409生产橙皮素和香叶木素。对照菌株：cf237。观察橙皮素和香叶木素峰。
508.图19：通过菌株sc2147、sc2151、sc1612和sc1614生产橙皮素和高圣草酚。对照菌株：cf235。
509.图20：通过菌株sc2147、sc2151、sc1612和sc1614生产香叶木素和金圣草黄素。对照菌株：cf235。
510.图21：通过菌株sc2408、sc2409和sc1508生产橙皮素和香叶木素。对照菌株：cf237。
511.图22：通过菌株sc2424、sc2425、sc2426、sc2427、sc2428和sc1500生产圣草酚和木犀草素。对照菌株：cf237。
512.图23：通过菌株sc2429至sc2434、sc2436至sc2444、sc2446至sc2454、sc2456至sc2464和sc2466从柚皮素生产香叶木素。
513.[表1]序列描述
[0514]
[0515]
[0516]
[0517]
[0518]
[0519][0520]
实施例
[0521]
材料和方法
[0522]
菌株
[0523]
在实施例中使用的酵母从酿酒酵母fy1679
‑
28a(tettelin等，1995https://doi.org/10.1016/s1067
‑
2389(06)80008
‑
7)获得。这种酵母对尿嘧啶、色氨酸、组氨酸和亮氨酸四重营养缺陷。
[0524]
在实施例中使用的细菌菌株从大肠埃希氏杆菌mh1获得。
[0525]
标准品
[0526]
标准品从供应商extrasynth
è
se,france获得(柚皮素、芹菜素、圣草酚、木犀草素、橙皮素和香叶木素)。
[0527]
基因克隆
[0528]
被优化以在酵母中表达的基因由eurofins genomics,ebersberg,germany或biomatik,cambridge,canada或twist biosciences,san francisco,usa或dc biosciences,dundee,uk合成。来自于酿酒酵母的基因cpr2(seq id no：26)通过pcr从基因组dna扩增。
[0529]
所述通过合成或pcr扩增获得的基因在5’和3’末端处包含bbsi(gaagac)或bsai(ggtctc)限制性位点。
[0530]
将所有基因、启动子和终止子限制克隆在用于在酵母中表达的载体psbk或用于在大肠埃希氏杆菌中表达的载体psb1k3中。启动子和(wargner等，2015doi:10.1016/j.fgb.2015.12.001)通过pcr从酿酒酵母或大肠埃希氏杆菌的基因组dna回收。
[0531]
载体psbk包含用于酵母的ura或leu或trp或his选择标志物，载体psb1k3包含卡那霉素抗性标志物。
[0532]
培养条件
[0533]
将菌株在24孔板(starlab,orsay,fr)中，在1ml增补有20g/l葡萄糖的最低氮源基础培养基(dutscher,brumath,fr)(对于酵母来说)和1ml增补有4g.l
‑1葡萄糖的m9(对于大肠埃希氏杆菌来说)中，在30℃培养72小时，并以200rpm连续搅拌。在某些情况下，以100mg.l
‑1的浓度添加柚皮素或芹菜素以确定f3’h的活性，以100mg.l
‑1的浓度添加柚皮素或圣草酚以确定fnsii的活性，以100mg.l
‑1的浓度添加圣草酚或木犀草素以确定met的活性。每种菌株使用在相同条件下培养的24小时预培养物以0.2的od接种。
[0534]
分析方法
[0535]
样品的制备：将1ml培养物在
‑
80℃冷冻，然后在0.10mbar下冷冻干燥12小时。然后将样品转移到1ml二甲基亚砜(dmso)中，以1000rpm搅拌30秒，然后在室温下以3000rpm离心5分钟。在离心后，将已知体积的上清液添加到已知体积的溶解在甲醇中的内标混合物中。
[0536]
所述内标的终浓度是：
[0537]
香叶木苷c13
ꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5mg/l
[0538]
香叶木素c13
ꢀꢀꢀꢀꢀ
0.015mg/l
[0539]
通过uhplc
‑
tq分析：将样品使用偶联到quantis三重四级杆ms(thermo)的vanquish
‑
h uhplc机器(thermo)进行分析。柱是与hsst3 1.8μm 2.1
×
5mm预柱组合的waters acquity uplc@usst3柱(8μm 2.1
×
100mm)。
[0540]
流动相a是在lc/ms级水中的0.1％甲酸溶液，流动相b是在纯lc/ms级乙腈中的0.1％甲酸溶液。柱温为50℃，样品更换器的温度为10℃。
[0541]
为了检测感兴趣的黄酮类化合物，使用了两种色谱条件：
[0542]
[表2]色谱条件方法1
[0543]
时间(min)流速(ml/min)流动相a(％)流动相b(％)00.5732780.57327
[0544]
[表3]色谱条件方法2
[0545]
时间(min)流速(ml/min)流动相a(％)流动相b(％)00.583173.750.5831740.573278.50.5732711.00.5505013.00.5010013.50.5831715.00.58317
[0546]
对于感兴趣的分子来说监测的离子和片段化条件是：
[0547]
[表4]对于方法1来说
[0548][0549]
[表5]对于方法2来说
[0550][0551]
f3’h
[0552]
用于每种f3’h的构建物在带有ura选择标志物的载体中制造(表6)。包含每种sam2和各种cpr中的仅仅一者的构建物在带有leu选择标志物的载体中产生(表7)。也产生了仅包含ura或leu选择标志物的两个载体作为对照。所述标志物基因使得可以检测和选择已并入感兴趣的基因的细胞。
[0553]
[表6]测试的各种不同f3’h构建物的列表
[0554][0555][0556]
[表7]使用各种不同cpr制造的构建物的列表
[0557][0558]
分别使用表6中列出的所有f3’h产生了几个菌株，以便可以使用表7的构建物对它们各自进行测试。
[0559]
这些各种不同的组装体能够检查f3’h的酶活性，并且也能确定最高效的f3’h
‑
cpr对。
[0560]
例如，菌株fl 405含有构建物fl 26和fl 401。
[0561]
含有构建物tt ura和tt leu的对照菌株(不含基因)被称为cf235。
[0562]
fnsii
[0563]
对于每种下述fnsii，制造了在trp载体中的构建物(表8)。将各自含有sam2和不同的cpr的带有leu选择标志物的相同载体用于测试所述fnsii(表9)。
[0564]
[表8]包含所测试的各种不同fnsii的构建物
[0565]
[0566]
[表9]使用各种不同cpr制造的构建物的列表
[0567][0568]
分别使用表8中列出的每种fnsii的构建物和表9的每种cpr的构建物产生了几个菌株。
[0569]
这些各种不同的组装体能够检查fnsii的酶活性，并且也能确定最高效的fnsii。
[0570]
例如，菌株sc 744含有构建物fl 620和fl 401。
[0571]
含有构建物tt trp和tt leu的对照菌株(不含基因)被称为cf234。
[0572]
制造了类似的构建物以测试seq id no：101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的fnsii。
[0573]
直至圣草酚/木犀草素的酵母
[0574]
还测试了包含直至圣草酚和木犀草素的途径的菌株：
[0575]
‑
包含构建物fl 26、fl 602、fl 808和fl 822的菌株sc1500；和
[0576]
‑
包含构建物fl 1031 fl 602 fl 822 tt his的菌株sc2424；
[0577]
‑
包含构建物fl 26 fl 602 fl 822 tt his的菌株sc2425；
[0578]
‑
包含构建物fl 31 fl 602 fl 822 tt his的菌株sc2426；
[0579]
‑
包含构建物fl 1031、fl 602、fl 808和fl 822的菌株sc2427；和
[0580]
‑
包含构建物fl 31 fl 602 fl 808 fl 822的菌株sc2428。[表10]用于包含直至圣草酚和木犀草素的途径的菌株的构建物的列表
[0581]
[0582][0583]
含有构建物tt ura、tt trp、tt his和tt leu的对照菌株(不含基因)被称为cf237。
[0584]
met：
[0585]
为了测试每种met，制备了表11中呈现的构建物。所述标志物基因使得能够检测和选择已并入感兴趣的基因的细胞。
[0586]
[表11]为测试各种不同met而制造的构建物的列表
[0587][0588]
产生了4个菌株sc 1612、sc 1614、sc 2147和sc 2151，其中sc 1612带有fl 121和fl 266，sc 1614带有fl 121和fl 268，sc 2147带有fl 475和fl 121，并且sc 2151带有fl 469和fl 121，用于将圣草酚转变成橙皮素，以便确定哪种met最为高效。
[0589]
含有构建物tt leu和tt ura的对照菌株(不含基因)被称为cf235。
[0590]
f3’h、met、fns、cpr：从柚皮素生产香叶木素
[0591]
[表12]用于在酿酒酵母(sc)中测试酶的构建物的列表
[0592][0593]
构建了下述菌株：
[0594]
sc2429：fl 1111 fl 1031 fl 121
[0595]
sc2430：fl 1112 fl 1031 fl 121
[0596]
sc2431：fl 1113 fl 1031 fl 121
[0597]
sc2432：fl 1114 fl 1031 fl 121
[0598]
sc2433：fl 1115 fl 1031 fl 121
[0599]
sc2439：fl 1111 fl 1031 tt leu
[0600]
sc2440：fl 1112 fl 1031 tt leu
[0601]
sc2441：fl 1113 fl 1031 tt leu
[0602]
sc2442：fl 1114 fl 1031 tt leu
[0603]
sc2443：fl 1115 fl 1031 tt leu
[0604]
sc2434：fl 1116 fl 1031 fl 121
[0605]
sc2436：fl 1118 fl 1031 fl 121
[0606]
sc2437：fl 1119 fl 1031 fl 121
[0607]
sc2438：fl 1120 fl 1031 fl 121
[0608]
sc2444：fl 1116 fl 1031 tt leu
[0609]
sc2446：fl 1118 fl 1031 tt leu
[0610]
sc2447：fl 1119 fl 1031 tt leu
[0611]
sc2448：fl 1120 fl 1031 tt leu
[0612]
sc2449：fl 1111 fl 26 fl 121
[0613]
sc2450：fl 1112 fl 26 fl 121
[0614]
sc2451：fl 1113 fl 26 fl 121
[0615]
sc2452：fl 1114 fl 26 fl 121
[0616]
sc2453：fl 1115 fl 26 fl 121
[0617]
sc2459：fl 1111 fl 26 tt leu
[0618]
sc2460：fl 1112 fl 26 tt leu
[0619]
sc2461：fl 1113 fl 26 tt leu
[0620]
sc2462：fl 1114 fl 26 tt leu
[0621]
sc2463：fl 1115 fl 26 tt leu
[0622]
sc2454：fl 1116 fl 26 fl 121
[0623]
sc2456：fl 1118 fl 26 fl 121
[0624]
sc2457：fl 1119 fl 26 fl 121
[0625]
sc2458：fl 1120 fl 26 fl 121
[0626]
sc2464：fl 1116 fl 26 tt leu
[0627]
sc2466：fl 1118 fl 26 tt leu
[0628]
sc2467：fl 1119 fl 26 tt leu
[0629]
sc2468：fl 1120 fl 26 tt leu
[0630]
含有构建物tt ura、tt trp、tt his和tt leu的对照菌株(不含基因)被称为cf237。
[0631]
直至橙皮素/香叶木素的大肠埃希氏杆菌
[0632]
[表13]用于在大肠埃希氏杆菌中测试酶的构建物的列表
[0633][0634]
直至橙皮素/香叶木素的酵母
[0635]
还测试了包含直至橙皮素/香叶木素的途径的3个菌株。菌株sc 1508包含表14的构建物fl 121 fl 268 fl 602 fl 808。菌株sc 2408包含表14的构建物fl 121 fl 469 fl 602 fl 808。菌株sc 2409包含表14的构建物fl 121 fl 475 fl 602 fl 808。
[0636]
[表14]在本实施例中使用的构建物的列表
[0637][0638][0639]
含有构建物tt leu、tt ura、tt trp和tt his的对照菌株(不含基因)被称为
cf237。
[0640]
结果
[0641]
f3’h
[0642]
下面的表15和16示出了通过将包含表6中列出的f3’h和表7的构建物的菌株分别在柚皮素和芹菜素存在下培养而获得的圣草酚(表15)和木犀草素(表16)的生产。
[0643]
[表15]圣草酚的浓度(单位为mg.l
‑1)
[0644][0645][0646]
ql：低于定量极限
[0647]
所述各种不同的菌株确实能够根据所使用的f3’h和cpr从柚皮素产生不同浓度的圣草酚(参见图2)。
[0648]
[表16]木犀草素的浓度(单位为mg.l
‑1)
[0649][0650]
ql：低于定量极限
[0651]
所述各种不同的菌株确实能够根据所使用的f3’h和cpr从芹菜素产生不同浓度的木犀草素(参见图3)。
[0652]
fns
[0653]
下面的表17和18示出了通过将包含表8中列出的fnsii和表9的构建物的菌株分别在柚皮素和圣草酚存在下培养而获得的芹菜素(表17)和木犀草素(表18)。
[0654]
[表17]芹菜素的浓度(单位为mg.l
‑1)
[0655][0656]
[表18]木犀草素的浓度(单位为mg.l
‑1)
[0657][0658]
所述各种不同的菌株确实能够根据所使用的fns从柚皮素和圣草酚产生不同浓度的芹菜素和木犀草素(图4和5)。
[0659]
使用seq id no：101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133的fnsii获得了类似的结果。
[0660]
f3’h、met、fns、cpr：从柚皮素生产香叶木素
[0661]
通过菌株sc2429至sc2434、sc2436至sc2444、sc2446至sc2454、sc2456至sc2464和sc2466至sc2468从柚皮素生产香叶木素的结果呈现在图23中。
[0662]
所有所述菌株均能从柚皮素生产香叶木素。香叶木素的生产主要通过添加cpr来提高。
[0663]
直至圣草酚/木犀草素的菌株
[0664]
菌株sc2424、sc2425、sc2426、sc2427、sc1500和sc2428含有所述途径的所有酶，并且能够从葡萄糖生产木犀草素和圣草酚。
[0665]
菌株sc1500的结果对应于图6，其中观察到圣草酚和木犀草素峰。对于菌株sc2424、sc2425、sc2426、sc2427和sc2428获得了类似的结果。菌株sc2424、sc2425、sc2426、sc2427、sc1500和sc2428中的每一者的圣草酚和木犀草素的生产呈现在图22中。
[0666]
应该指出，向生物合成途径添加酶pal和c4h能够获得明显更高的圣草酚和木犀草素浓度。这些浓度可以比使用除了pal和c4h之外含有相同酶的菌株所获得浓度高多达6倍(参考图22，例如通过将不含pal/c4h的菌株sc2425与含有pal/c4h的菌株sc1500比较或将不含pal/c4h的菌株sc2426与含有pal/c4h的菌株sc2428比较)。
[0667]
met
[0668]
通过菌株sc1612、sc1614、sc2147和sc2151从圣草酚和木犀草素生产橙皮素和香叶木素的结果分别呈现在图7、8、19和20中。
[0669]
酵母菌株sc1612、sc1614、sc2147和sc2151确实能够生产橙皮素和/或香叶木素。
[0670]
从圣草酚开始，菌株sc2147、sc2151和sc1612能够特异性生产橙皮素，即特异性将圣草酚的4’位中的羟基甲基化(图19)。菌株sc1614就其本身而言产生橙皮素和高圣草酚的混合物。
[0671]
此外，值得注意的是，菌株sc2151能够生产约40mg/l的橙皮素(图19)。菌株sc2147、sc1612和sc1614就其本身而言能够从木犀草素产生香叶木素(图20)。
[0672]
fnsii
[0673]
通过菌株sc744从橙皮素生产香叶木素的结果呈现在图9中。
[0674]
酵母菌株sc744确实能够从橙皮素产生香叶木素。
[0675]
大肠埃希氏杆菌
[0676]
通过菌株ec26、ec41和ec43从圣草酚生产橙皮素的结果呈现在图10、14和15中，并且通过菌株ec26和ec43从木犀草素生产香叶木素的结果呈现在图11和16中。
[0677]
大肠埃希氏杆菌菌株ec26、ec41和ec43确实能够产生橙皮素和/或香叶木素。
[0678]
通过菌株ec30从橙皮素生产香叶木素的结果呈现在图12中。
[0679]
大肠埃希氏杆菌菌株ec30确实能够从橙皮素产生香叶木素。
[0680]
直至橙皮素/香叶木素的菌株
[0681]
通过酵母菌株sc1508、sc2408和sc2409从葡萄糖生产橙皮素和香叶木素的结果呈现在图13、17和18中。
[0682]
含有所述途径的所有酶的酵母菌株sc1508、sc2408和sc2409能够从葡萄糖生产橙皮素和/或香叶木素(图21)。值得注意的是，菌株sc 2408产生约25mg/l的橙皮素和约5mg/l的香叶木素。