SNP位点的基因型组合在评价毛白杨树干皮孔表型中的应用、引物组、试剂盒及其应用

snp位点的基因型组合在评价毛白杨树干皮孔表型中的应用、引物组、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子育种技术领域，特别是涉及snp位点的基因型组合在评价毛白杨树干皮孔表型中的应用、引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.毛白杨是我国特有的珍贵乡土树种，在我国北方城乡绿化中占有重要地位。洁白光滑的树皮是毛白杨区别于其它杨树树种的显著特征，该特征也使毛白杨在园林绿化中更加美观。皮孔是树木枝干表面肉眼可见的裂缝凸起，在树木茎干与外界进行气体交换过程中起重要作用。皮孔在毛白杨光滑的树皮上更加显著，是选育美观园林绿化毛白杨的重要指标。其中，单个皮孔的面积和单位面积内皮孔的数目作为影响毛白杨树皮表现的关键因子，是衡量城乡园林绿化毛白杨新品种美观与否的重要因素。
3.毛白杨树干的皮孔是一个多年生性状，表现出随着树龄增长逐渐变化的特点，在毛白杨生长7～8年后才表现出明显的个体差异。在传统的毛白杨新品种选育过程中，对于皮孔特征的选择只能通过人工肉眼观测的方法进行，而限于皮孔在林木幼龄期不显著的特点，使该方法难以在新品种早期选育中对毛白杨皮孔特征进行选择。特别是随着我国对生态文明建设的推进，对城乡园林绿化树种新品种的选育提出了更加精细化的要求，而粗放的传统选育方法很难满足毛白杨树干皮孔特征的精准选育。因此，针对城乡园林绿化需求，开发特定皮孔性状的定向分子辅助育种技术可显著提高目标性状的选育精度，缩短育种周期，是城乡园林绿化树种大规模工业应用中急需解决的核心育种技术。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了snp位点的基因型组合在评价毛白杨树干皮孔表型中的应用、引物组、试剂盒及其应用。本发明提供的snp位点的基因型组合可以在毛白杨生长的早期高效、准确筛选特定皮孔性状的城乡园林绿化毛白杨，有效缩短育种周期。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了snp位点的基因型组合在评价毛白杨树干皮孔表型中的应用，所述snp位点包括snp1和snp2；
7.所述snp1在seq id no.7所示的核苷酸序列的第1262位存在t/c多态性；
8.所述snp2在seq id no.8所示的核苷酸序列的第3477位存在g/a多态性；
9.所述snp1的基因型包括cc、tt和tc；
10.所述snp2的基因型包括aa、gg和ga；
11.以毛白杨样品树干面积75cm2计：
12.当所述基因型组合为cc-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目≤8个；
13.当所述基因型组合为cc-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤
0.43cm2，皮孔数目≤8个；
14.当所述基因型组合为cc-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目≤8个；
15.当所述基因型组合为tt-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目≥12个；
16.当所述基因型组合为tt-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目≥12个；
17.当所述基因型组合为tt-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目≥12个；
18.当所述基因型组合为tc-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目大于8个且小于12个；
19.当所述基因型组合为tc-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目大于8个且小于12个；
20.当所述基因型组合为tc-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目大于8个且小于12个。
21.本发明还提供了一种评价毛白杨树干皮孔表型的引物组，所述引物组包括：鉴定上述应用中snp1基因型的引物组一和鉴定上述应用中snp2基因型的引物组二；
22.所述引物组一包括引物对一和引物对二；所述引物对一包括pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r；所述引物对二包括pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r；
23.所述引物组二包括引物对三和引物对四；所述引物对三包括pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r；所述引物对四包括pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r；
24.所述pto-nac83-1885-tf的核苷酸序列如seq id no.1所示；
25.所述pto-nac83-1885-cf的核苷酸序列如seq id no.2所示；
26.所述pto-nac83-1885-r的核苷酸序列如seq id no.3所示；
27.所述pto-myb46-610-gf的核苷酸序列如seq id no.4所示；
28.所述pto-myb46-610-af的核苷酸序列如seq id no.5所示；
29.所述pto-myb46-610-r的核苷酸序列如seq id no.6所示。
30.本发明还提供了一种评价毛白杨树干皮孔表型的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
31.本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒在评价毛白杨树干皮孔表型中的应用。
32.本发明还提供了一种评价毛白杨树干皮孔表型的方法，包括以下步骤：
33.1)测定毛白杨样品基因组dna中两个snp位点的基因型；所述两个snp位点包括snp1和snp2；所述snp1在seq id no.7所示的核苷酸序列的第1262位存在t/c多态性；所述snp2在seq id no.8所示的核苷酸序列的第3477位存在g/a多态性；所述snp1的基因型包括cc、tt和tc；所述snp2的基因型包括aa、gg和ga；
34.2)根据步骤1)中确定的基因型组合判断毛白杨树干的皮孔特征；
35.以毛白杨样品树干面积75cm2计：
36.当所述基因型组合为cc-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目≤8个；
37.当所述基因型组合为cc-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目≤8个；
38.当所述基因型组合为cc-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目≤8个；
39.当所述基因型组合为tt-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目≥12个；
40.当所述基因型组合为tt-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目≥12个；
41.当所述基因型组合为tt-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目≥12个；
42.当所述基因型组合为tc-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目大于8个且小于12个；
43.当所述基因型组合为tc-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目大于8个且小于12个；
44.当所述基因型组合为tc-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目大于8个且小于12个。
45.优选的，所述步骤1)中测定基因型的方法包括pcr扩增。
46.优选的，pcr扩增结果的判定包括：
47.若pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r扩增时得到扩增产物，pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r扩增时也得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为tc；
48.若pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r扩增时得到扩增产物，pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r扩增时未得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为tt；
49.若pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r扩增时未得到扩增产物，pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r扩增时得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为cc；
50.若pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r扩增时得到扩增产物，pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r扩增时得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为ga；
51.若pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r扩增时得到扩增产物，pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r扩增时未得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为gg；
52.若pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r扩增时未得到扩增产物，pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r扩增时得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为aa。
53.优选的，所述pcr扩增的反应程序包括：步骤一：94℃预变性3min；步骤二：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；以后每个循环退火温度依次降低1℃，直到42℃；步骤二共进行40个循环；步骤三：72℃延伸10min。
54.优选的，所述pcr扩增的反应体系以50μl计，包括：phusion dna polymerase 0.5μl、5
×
hf buffer 10μl、上游引物2.5μl、下游引物2.5μl、dntps1μl、dna模板4μl、mgcl21μl、dmso 1.5μl和剩余双蒸水。
55.本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒或上述方法在杨树分子育种中的应用。
56.有益效果：
57.本发明基于全基因组关联分析的策略，以毛白杨种质资源群体为依托，利用emmax软件中的混合线性模型，在全基因组水平检测与毛白杨自然群体皮孔性状显著关联的snp位点，共查找到snp1和snp2这两个位点；所述两个snp位点与杨树自然群体树干皮孔性状关联的显著性p≤1
×
10-7
。通过确定上述两个snp位点的基因型组合能够准确地评价杨树树干皮孔特征，在杨树生长的早期高效、准确地筛选树皮光滑美观的毛白杨新品种，缩短园林绿化毛白杨选育周期。
附图说明
58.图1为本发明所述两个snp标记位点的不同基因型组合，对毛白杨树干皮孔面积的基因型效应图；
59.图2为本发明所述两个snp标记位点的不同基因型组合，对毛白杨树干皮孔数目的基因型效应图；
60.图3为本发明所述两个snp标记位点的不同基因型组合，对应毛白杨树干典型的皮孔特征图像。
具体实施方式
61.本发明提供了snp位点的基因型组合在评价毛白杨树干皮孔表型中的应用，所述snp位点包括snp1和snp2；
62.所述snp1在seq id no.7所示的核苷酸序列的第1262位存在t/c多态性；
63.所述snp2在seq id no.8所示的核苷酸序列的第3477位存在g/a多态性；
64.所述snp1的基因型包括cc、tt和tc；
65.所述snp2的基因型包括aa、gg和ga；
66.以毛白杨样品树干面积75cm2计：
67.当所述基因型组合为cc-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目≤8个；
68.当所述基因型组合为cc-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目≤8个；
69.当所述基因型组合为cc-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目≤8个；
70.当所述基因型组合为tt-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目≥12个；
71.当所述基因型组合为tt-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目≥12个；
72.当所述基因型组合为tt-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目≥12个；
73.当所述基因型组合为tc-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目大于8个且小于12个；
74.当所述基因型组合为tc-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤
0.43cm2，皮孔数目大于8个且小于12个；
75.当所述基因型组合为tc-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目大于8个且小于12个。
76.在本发明中，所述seq id no.7所示的核苷酸序列为：
77.78.其中加粗的大写碱基t为snp1突变前的位点，下划线所示的核苷酸序列为pto-nac83基因序列；
79.所述seq id no.8所示的核苷酸序列为：
80.[0081]81.其中加粗的大写碱基g为snp2突变前的位点，下划线所示的核苷酸序列为pto-myb46基因序列。
[0082]
在本发明中，所述毛白杨样品树干面积75cm2优选包括：以毛白杨胸径处起，沿树高方向15厘米与沿树周长5厘米范围内的树干树皮面积；所述毛白杨胸径处优选包括10年生毛白杨树高1.3米处位置。
[0083]
本发明提供的snp位点的基因型组合可以在毛白杨生长的早期高效、准确筛选特定皮孔性状的城乡园林绿化毛白杨，有效缩短育种周期。判断机理同上，在此不再赘述。本发明对所述pto-nac83基因上游第1885位碱基和pto-myb46基因下游第610位碱基这两个位点基因型的测定方法没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的测定方法即可。
[0084]
本发明提供了一种评价毛白杨树干皮孔表型的引物组，所述引物组包括：鉴定上述应用中snp1基因型的引物组一和鉴定上述应用中snp2基因型的引物组二；
[0085]
所述引物组一包括引物对一和引物对二；所述引物对一包括pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r；所述引物对二包括pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r；
[0086]
所述引物组二包括引物对三和引物对四；所述引物对三包括pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r；所述引物对四包括pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r；
[0087]
所述pto-nac83-1885-tf的核苷酸序列如seq id no.1所示：5
’‑
ataaaatctatatagaataatgat-3’；
[0088]
所述pto-nac83-1885-cf的核苷酸序列如seq id no.2所示：5
’‑
ataaaatctatatagaataatgac-3’；
[0089]
所述pto-nac83-1885-r的核苷酸序列如seq id no.3所示：5
’‑
gttatattattacaaaatgatatc-3’；
[0090]
所述pto-myb46-610-gf的核苷酸序列如seq id no.4所示：5
’‑
tatatatatataaagagatcagtg-3’；
[0091]
所述pto-myb46-610-af的核苷酸序列如seq id no.5所示：5
’‑
tatatatatataaagagatcagta-3’；
[0092]
所述pto-myb46-610-r的核苷酸序列如seq id no.6所示：5
’‑
aagagataaatgagtgagaagaag-3’。
[0093]
在本发明中，上述引物在扩增时的引物对优选为pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r组合，pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r组合，pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r组合，pto-myb46-610-cf和pto-myb46-610-r组合。
[0094]
本发明通过对待测位点(snp1和snp2)设计引物，引物的设计要求是正向引物的3’末端对应snp功能位点，并将对应snp位点的3’末端上的核苷酸进行锁核酸(lna)修饰，从而得到上述引物组。通过上述的引物组可以快速、准确地确定与树干皮孔性状显著关联的snp位点的基因型，通过确定的snp位点的基因型组合可以判断毛白杨树干的皮孔特征，从而毛白杨生长的早期高效、准确筛选特定皮孔性状的城乡园林绿化毛白杨，有效缩短育种周期。
[0095]
本发明还提供了一种评价毛白杨树干皮孔表型的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。本发明提供的试剂盒可以快速、准确地判断毛白杨树干的皮孔特征。判断机理同上，在此不在赘述。
[0096]
本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒在评价毛白杨树干皮孔表型中的应用。
本发明所述引物组或试剂盒的评价机理同上，在此不在赘述。
[0097]
本发明还提供了一种评价毛白杨树干皮孔表型的方法，包括以下步骤：
[0098]
1)测定毛白杨样品基因组dna中两个snp位点的基因型；所述两个snp位点包括snp1和snp2；所述snp1在seq id no.7所示的核苷酸序列的第1262位存在t/c多态性；所述snp2在seq id no.8所示的核苷酸序列的第3477位存在g/a多态性；所述snp1的基因型包括cc、tt和tc；所述snp2的基因型包括aa、gg和ga；
[0099]
2)根据步骤1)中确定的基因型组合判断毛白杨树干的皮孔特征；
[0100]
以毛白杨样品树干面积75cm2计：
[0101]
当所述基因型组合为cc-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目≤8个；
[0102]
当所述基因型组合为cc-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目≤8个；
[0103]
当所述基因型组合为cc-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目≤8个；
[0104]
当所述基因型组合为tt-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目≥12个；
[0105]
当所述基因型组合为tt-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目≥12个；
[0106]
当所述基因型组合为tt-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目≥12个；
[0107]
当所述基因型组合为tc-aa时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≥0.5cm2，皮孔数目大于8个且小于12个；
[0108]
当所述基因型组合为tc-gg时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值≤0.43cm2，皮孔数目大于8个且小于12个；
[0109]
当所述基因型组合为tc-ga时，则毛白杨样品树干的单个皮孔面积的平均值大于0.43cm2且小于0.5cm2，皮孔数目大于8个且小于12个。
[0110]
本发明通过确定上述两个snp位点的基因型组合能够准确地评价杨树树干皮孔特征，在杨树生长的早期高效、准确地筛选树皮光滑美观的毛白杨新品种，缩短园林绿化毛白杨选育周期。判断机理同上，在此不再赘述。
[0111]
在本发明中，所述毛白杨样品基因组dna的制备方法优选包括由毛白杨样品的叶片提取得到。本发明对所述样品基因组dna的提取方法没有特殊要求，采用本领域常规的植物基因组提取方法即可。在本发明具体实施过程中，优选采用植物基因组dna提取试剂盒。
[0112]
在本发明中，所述步骤1)中测定基因型的方法优选包括pcr扩增；所述pcr扩增的引物或试剂盒包括上述引物组或上述试剂盒；pcr扩增结果的判定包括：
[0113]
若pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r扩增时得到扩增产物，pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r扩增时也得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为tc；
[0114]
若pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r扩增时得到扩增产物，pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r扩增时未得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为
tt；
[0115]
若pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r扩增时未得到扩增产物，pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r扩增时得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为cc；
[0116]
若pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r扩增时得到扩增产物，pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r扩增时得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为ga；
[0117]
若pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r扩增时得到扩增产物，pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r扩增时未得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为gg；
[0118]
若pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r扩增时未得到扩增产物，pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r扩增时得到扩增产物，则毛白杨样品snp位点的基因型为aa。
[0119]
在本发明中，检测扩增产物的方法优选包括电泳或测序；更优选为电泳，如得到电泳条带，则得到扩增产物，若未得到电泳条带，则未得到扩增产物；
[0120]
所述pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r的扩增产物大小优选为48bp；
[0121]
所述pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r的扩增产物大小优选为48bp；
[0122]
所述pto-myb46-610-tf和pto-myb46-610-r的扩增产物大小优选为48bp；
[0123]
所述pto-myb46-610-cf和pto-myb46-610-r的扩增产物大小优选为48bp。
[0124]
在本发明中，所述pcr扩增的反应程序优选包括：步骤一：94℃预变性3min；步骤二：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；以后每个循环退火温度依次降低1℃，直到42℃；步骤二共进行40个循环；步骤三：72℃延伸10min。
[0125]
在本发明中，所述pcr扩增的反应体系以50μl计，优选包括：phusion dna polymerase 0.5μl、5
×
hf buffer 10μl、上游引物2.5μl、下游引物2.5μl、dntps1μl、dna模板4μl、mgcl21μl、dmso 1.5μl和剩余双蒸水。在本发明中，所述上游引物优选包括pto-nac83-1885-tf、pto-nac83-1885-cf、pto-myb46-610-gf或pto-myb46-610-cf；所述下游因为优选包括pto-nac83-1885-r或pto-myb46-610-r。本发明对所述扩增反应体系的各个试剂的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
[0126]
在本发明中，所述上游引物和下游引物的工作浓度均优选为10μmol/l；所述dna模板的工作浓度均优选为5ng/μl；所述phusion dnapolymerase的酶活优选为2u/μl；所述dntps的浓度优选为2.5μmol/l；所述mgcl2的浓度优选为25mmol/l。
[0127]
本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒或上述方法在杨树分子育种中的应用。本发明中所述引物组、试剂盒和方法能够高效、准确地在毛白杨苗期确定待测样品未来大树的树干皮孔表型特征，准确评价其在园林绿化中的应用潜力，有效缩短特定用途园林绿化毛白杨的选育周期。上述方法在具体育种应用过程中，通过检测毛白杨样品中上述两个位点的基因型，根据园林绿化实际需求，筛选不同基因型组合进行下一步育种操作。
[0128]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种评价毛白杨树干皮孔表型的引物组、试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0129]
实施例1
[0130]
一种评价毛白杨树干皮孔表型的引物组，所述引物组由以下引物组成：鉴定seq id no.7所示的核苷酸序列的第1262位(pto-nac83基因上游第1885位)碱基(snp1)基因型的引物组一和鉴定seq id no.8所示的核苷酸序列的第3477位(pto-myb46基因下游第610
位)碱基(snp2)基因型的引物组二；
[0131]
所述引物组一包括引物对一和引物对二；所述引物对一包括pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r；所述引物对二包括pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r；
[0132]
所述引物组二包括引物对三和引物对四；所述引物对三包括pto-myb46-610-gf和pto-myb46-610-r；所述引物对四包括pto-myb46-610-af和pto-myb46-610-r；
[0133]
所述pto-nac83-1885-tf的核苷酸序列如seq id no.1所示：5
’‑
ataaaatctatatagaataatgat-3’；
[0134]
所述pto-nac83-1885-cf的核苷酸序列如seq id no.2所示：5
’‑
ataaaatctatatagaataatgac-3’；
[0135]
所述pto-nac83-1885-r的核苷酸序列如seq id no.3所示：5
’‑
gttatattattacaaaatgatatc-3’；
[0136]
所述pto-nac83-1885-tf和pto-nac83-1885-r的扩增产物大小为48bp；
[0137]
所述pto-nac83-1885-cf和pto-nac83-1885-r的扩增产物大小为48bp；
[0138]
所述pto-myb46-610-gf的核苷酸序列如seq id no.4所示：5
’‑
tatatatatataaagagatcagtg-3’；
[0139]
所述pto-myb46-610-af的核苷酸序列如seq id no.5所示：5
’‑
tatatatatataaagagatcagta-3’；
[0140]
所述pto-myb46-610-r的核苷酸序列如seq id no.6所示：5
’‑
aagagataaatgagtgagaagaag-3’；
[0141]
所述pto-myb46-610-tf和pto-myb46-610-r的扩增产物大小为48bp；
[0142]
所述pto-myb46-610-cf和pto-myb46-610-r的扩增产物大小为48bp；
[0143]
上述引物组由生工生物工程股份有限公司(sangon biotech)合成。
[0144]
实施例2
[0145]
利用实施例1得到的引物组，对毛白杨自然群体104株个体的皮孔指标进行评价，由以下步骤组成：
[0146]
1)提取所选毛白杨个体基因组dna：在毛白杨种质资源库(树龄10年)采集所选毛白杨个体的叶片，采集后迅速放入液氮(-196℃)中保存；利用dneasy plant mini kit(qiagen china,shanghai,china)试剂盒对叶片样品的基因组dna进行提取；
[0147]
2)采用锁核酸法(lna)测定待测毛白杨个体基因组dna中snp1和snp2的基因型；所述snp1在seq id no.7所示的核苷酸序列的第1262位存在t/c多态性(pto-nac83基因上游第1885位)；所述snp2在seq id no.8所示的核苷酸序列的第3477位存在g/a多态性(pto-myb46基因下游第610位)：利用实施例1得到的引物组，以步骤1)所获得的的基因组dna为模板进行pcr扩增；
[0148]
pcr反应体系为：
[0149]
phusion dnapolymerase(2u/μl)：0.5μl
[0150]
hf buffer(5x)：10μl
[0151]
上游引物(10μmol/l)：2.5μl
[0152]
下游引物(10μmol/l)：2.5μl
[0153]
dntps(2.5μmol/l)：1μl
[0154]
基因组dna模板(5ng/μl)：4μl
[0155]
mgcl2(25mmol/μl)：1μl
[0156]
dmso(100％)：1.5μl
[0157]
双蒸水：27μl
[0158]
pcr扩增程序如下：步骤一：94℃预变性3min；步骤二：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min。以后每个循环依次降低1℃，直到42℃；步骤二进行40个循环；步骤三：72℃延伸10min。
[0159]
对不同白毛杨个体的位点进行测定的同时，对所选个体进行皮孔表型的测定，由以下步骤组成：(1)拍摄每株个体胸径(树高1.3米)处，15厘米(沿树高方向)
×
5厘米(沿周长)范围内的树干树皮图像。为了全面反映单株个体的皮孔特征，每株个体分别在东南西北各拍摄一次，取平均值来代表整株树的皮孔特征。(2)通过iamgej软件，计算每个图片中单个皮孔面积的平均值(la)，皮孔数目(ln)两个性状。具体测定结果见表1和部分测定结果见图1～图3。
[0160]
表1待测毛白杨个体两个预定位点的基因型及树干皮孔性状
[0161]
[0162]
[0163]
[0164][0165]
由表1可知，当snp1和snp2的基因型组合为cc-aa时，毛白杨树干的皮孔面积较大，数目较少；当snp1和snp2的基因型组合为cc-gg时，毛白杨树干的皮孔面积小，数目少，树皮最为光滑；当snp1和snp2的基因型组合为tt-gg时，毛白杨树干的皮孔面积小，数目较多。
[0166]
综上所述，本发明提供的引物组、试剂盒和方法能够快速准确的确定待测毛白杨树干的皮孔特征，在毛白杨生长的早期高效、准确地筛选树皮光滑美观的毛白杨新品种，缩短园林绿化毛白杨新品种的育种周期。
[0167]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。