一种石花菜制备新琼寡糖的方法与流程

1.本发明涉及生物发酵领域，具体地说，是涉及一种将石花菜制备新琼寡糖的方法。


背景技术：

2.琼胶寡糖来源于琼胶多糖(主要分离自某些红藻类，例如石花菜，条斑紫菜，江蓠)，具有多种生物活性。琼胶寡糖由(1
→
3)－o－β－d－半乳糖残基和(1
→
4)－o－3，6－内醚－α－l－半乳糖残基交替形成。根据琼胶寡糖非还原端的不同，可将琼胶寡糖分为非还原端为3,6
‑
内醚
‑
l
‑
半乳糖的新琼寡糖以及非还原端为d
‑
半乳糖的琼寡糖。琼胶寡糖具有多种生理活性，例如抗癌、抗氧化、抗肥胖和美白。
3.目前制备琼胶寡糖的方法主要有化学法和酶法两种，通过化学法制备琼寡糖具有反应迅速、处理底物浓度较大等优点，但是经酸解之后产物较杂，分离较为困难。因此，开发新琼寡糖的特异高效性制备技术具有重大的意义，急需设计一种石花菜制备新琼寡糖的方法来解决此类问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种石花菜制备新琼寡糖的方法。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.本发明将石花菜进行匀浆处理，时间为10～20min，匀浆的石花菜直接作为反应底物进行酶解，加入的混合酶液为(gh16
‑
1:gh16
‑
2:gh50＝2:1:1)，酶解产物纯化后，制备得到新琼寡糖，所述的gh16
‑
1琼胶酶的序列为seq id no:1。gh16
‑
2序列为seq id no:2，所述的gh16
‑
1和gh16
‑
2均为新颖的琼胶酶，与已知琼胶酶相似度低于60％，为本专利首次克隆和表达。
7.进一步地，采用异源表达的琼胶酶混合液进行酶解，使用的酶液比例为2:1:1.
8.一种石花菜制备新琼寡糖的方法，将石花菜进行匀浆，时间为20min，将匀浆产物作为反应底物加入混合酶液进行酶解，酶解产物再进行纯化制备得到新琼寡糖，所述的gh16
‑
2琼胶酶的序列为seq id no:2。
9.进一步地，所述gh16
‑
2琼胶酶的反应引物序列为
10.gh16
‑
2 tcgcggatccgaattcaagcaagggcactcgc上游引物
11.gh16
‑
2 gtgcggccgcaagcttgtcacactttttgcagcccg下游引物
12.所述gh16
‑
1琼胶酶的反应引物序列为
13.gh16
‑
1 tcgcggatccgaattcgccgattgggatgg
14.gh16
‑
1 gtgcggccgcaagcttgttattgcggtgtaaatataaaacgg
15.所述gh16
‑
1琼胶酶在转化石花菜的应用。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.(1)本发明琼胶寡糖转化速度快，仅需6h左右，耗时短。已经报道的琼胶寡糖制备方法，需要进行干燥和提取琼胶的步骤，往往需要3
‑
5d。本发明相比之前方法，周期大大缩
短。
18.(2)发明反应条件温和，所需设备简单。本发明只需在37℃即可进行酶解，无需高温高压和强酸强碱处理，同时所需主要设备为匀浆机，价格便宜。
19.(3)本发明绿色、环保、无污染。之前的琼胶寡糖制备，使用化学法从提取琼胶，会造成环境污染，而且生成的残渣无法再利用。本发明无需提取琼胶，减少污染，并且残余的产物可以再利用。
附图说明
20.图1为石花菜制备新琼寡糖的方法的不同加酶量对新琼寡糖产量的影响示意图；
21.图2为石花菜制备新琼寡糖的方法的酶解前后产物变化的tlc分析对比示意图；
22.图3为石花菜制备新琼寡糖的方法的流程示意图；
23.图4为石花菜制备新琼寡糖的方法的不同液料比对新琼寡糖产量的影响对比示意图；
24.图5为石花菜制备新琼寡糖的方法的不同处理时间对新琼寡糖产量的影响对比示意图；
具体实施方式
25.下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
26.如图1和2所示，在本实施例子中,本发明将石花菜进行匀浆处理，时间为20min，匀浆的石花菜直接作为反应底物进行酶解，加入的混合酶液为(gh16
‑
1:gh16
‑
2:gh50＝2:1:1)，酶解产物纯化后，制备得到新琼寡糖，所述的gh16
‑
1琼胶酶的序列为seq id no:1。gh16
‑
2序列为seq id no:2.
27.所述gh16
‑
2琼胶酶的引物为
28.gh16
‑
1 tcgcggatccgaattcgccgattgggatgg
29.gh16
‑
1 gtgcggccgcaagcttgttattgcggtgtaaatataaaacgg
30.所述gh16
‑
1琼胶酶的引物为
31.gh16
‑
2 tcgcggatccgaattcaagcaagggcactcgc
32.gh16
‑
2 gtgcggccgcaagcttgtcacactttttgcagcccg
33.本发明采用大肠杆菌bl21(de3)用作蛋白质表达的宿主菌，在含有100μg/ml卡那霉素的luria
‑
bertani(lb)培养基中培养大肠杆菌，如图3所述，为石花菜制备新琼寡糖的方法的流程示意图。
34.不同液料比均浆处理石花菜匀浆处理，将其湿重为5g、11g、13g、17g的石花菜分别加入20mm tris
‑
hcl(ph7.0)至总体积为150ml，匀浆15
‑
20min后作为反应底物。加入7.7u的混合酶液酶液，混匀，在37℃下进行摇床反应，后离心处理，上清沸水浴灭活3～10min，如图4所述，为不同液料比对新琼寡糖产量的影响，以150ml水溶液中加入13g石花菜作为基准数据，其它以此类推。
35.均浆处理时间优化称取5份9g石花菜加入20mm tris
‑
hcl(ph7.0)至总体积为150ml，粉碎时间分别为5min、15min、20min、25min，作为反应底物。加入7.7u的gh16
‑
1、
gh16
‑
2酶液，立即混匀并计时，在37℃下摇床反应，每个时间段取样，离心，上清沸水浴灭活3～10min，取样测定还原糖含量。如图1所述，为不同加酶量对新琼寡糖产量的影响，如图5所述为，匀浆过程中，不同处理时间对新琼寡糖产量的影响。
36.酶组合降解红藻破碎液实验将gh16
‑
1、gh16
‑
2、gh50酶液的酶活，三种琼胶酶按比例(u/u/u＝2:1:1)组合降解30ml匀浆处理的石花菜，37℃4h反应完全，离心收集上清，并检测还原糖，tlc检测样品中的琼胶寡糖聚合度。
37.表1不同酶组合对新琼寡糖产量的影响
[0038][0039]
如图2所述，为酶解前后产物变化的tlc分析，m：新琼寡糖标准品，na2是新琼二糖，na4是新琼四糖，na6是新琼六糖，c是酶解前样品，1是酶解后样品。
[0040]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。