一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其应用

一种
α-l-鼠李糖苷酶突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种α-l-鼠李糖苷酶突变体及其应用。


背景技术：

2.l-鼠李糖，又称鼠李糖，甲基戊糖，是甘露糖六位的一个羟基被氢取代而衍生的一种单糖，主要存在植物多糖、糖苷、植物胶及细菌多糖中，其甜度是蔗糖的33％。l-鼠李糖不仅可作为药物的中间体，用于医学检测试剂，又能作为食品添加剂，与其他物质形成风味物质，生产香精香料等。目前主要采用化学法或者生物酶解法来制备l-鼠李糖，化学法在制备过程中需酸处理和碱中和会造成副产物的生成及环境的污染；利用酶法进行生物转化，制备l-鼠李糖，反应稳定，转化率高，安全可靠。
3.α-l-鼠李糖苷酶来源广泛，在动物、植物、细菌和真菌中均有分布，微生物是该酶的主要来源。α-l-鼠李糖苷酶可作用于黄酮糖苷类物质中α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷键连接的l-鼠李糖，生成相应的黄酮单糖苷化合物及l-鼠李糖，是食品、医药等领域重要的糖苷水解酶类。天然分离的α-l-鼠李糖苷酶由于底物特异性的问题，仅对部分黄酮具有高效水解作用，而对另外部分黄酮不具有水解作用或者水解活性很低，不能对黄酮中l-鼠李糖有效释放，导致原料利用率低。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种α-l-鼠李糖苷酶突变体，该突变体r-rha1-s356a在催化柚皮苷生成l-鼠李糖的生成率与野生型相比，提高了105％。
5.为此，在本发明的第一个方面中，一种α-l-鼠李糖苷酶突变体，所述突变体是将α-l-鼠李糖苷酶氨基酸序列的第356位突变成丙氨酸，所述突变体的氨基酸序列如seq id no：1所示。
6.根据本发明的实施例的α-l-鼠李糖苷酶突变体，其将野生型α-l-鼠李糖苷酶的第356位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸。与野生型α-l-鼠李糖苷酶相比，突变体在催化柚皮苷生成l-鼠李糖的生成率提高了105％，使得其对于生物制备l-鼠李糖具有良好的应用前景。
7.可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶来源于黑曲霉jmu-ts528。
8.在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述α-l-鼠李糖苷酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.在本发明的第三个方面中，提供了一种构建体，其包含编码上述α-l-鼠李糖苷酶突变体的基因。
10.在本发明的第四个方面中，提供了上述的α-l-鼠李糖苷酶突变体在水解黄酮糖苷制备l-鼠李糖的应用。
11.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
12.图1为黑曲霉α-l-鼠李糖苷酶三维结构模拟图；
13.图2为黑曲霉α-l-鼠李糖苷酶与柚皮苷分子对接结果；
14.图3为黑曲霉α-l-鼠李糖苷酶野生型wt及突变体酶r-rha1-s356a的sds-page图；
15.图4为实施例2的hplc结果图。
具体实施方式
16.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
17.下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5
′
至3
′
的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
18.下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。
19.实施例1构建α-l-鼠李糖苷酶突变体
20.突变酶重组表达载体的构建：
21.以携带黑曲霉jmu-ts528的α-l-鼠李糖苷酶编码基因的载体为模板进行定点突变，构建突变酶重组表达载体，突变引物如表1所示。
22.表1突变引物表
[0023][0024]
定点突变参照突变试剂盒kod-plus-mutagenesis kit的说明书进行操作。包括反向pcr、dpn i消化模板、pcr产物的自身环化三个步骤；突变获得的突变酶r-rha1-s356a的编码基因如seq id no.2所示。
[0025]
反向pcr反应体系：
[0026]
表2
[0027][0028]
依次加入上述试剂后，混合均匀，然后进行pcr。pcr反应参数：94℃预变性2min，98℃变性10s，68℃延伸12min，12个循环，4℃保存。
[0029]
用dpn i酶切质粒模板：
[0030]
向上述得到的pcr反应液中(25μl)加入1μl的dpn i，轻轻吸打混匀后，在37℃条件下反应1h。
[0031]
反向pcr产物的自身环化
[0032]
另取一个pcr管，向其中加入7μl的无菌水；1μl的t4 polynuleotide kinase 5μl的ligation high；2μl的上述dpn i酶切步骤中得到的反应液，将混匀后的pcr管放在pcr仪中16℃条件下反应1h，得到重组质粒ppic9k-s356a。
[0033]
重组质粒转化表达宿主：
[0034]
将上述构建好的重组质粒全部转入大肠杆菌dh5α感受态，混匀后置于冰上30min，结束后将大肠杆菌dh5α感受态放入温度42℃下热激90s后置于冰上缓和2min，再加入1ml未添加amp的lb培养基，结束后将大肠杆菌dh5α感受态放于37℃下2h，结束后取菌体200μl涂布于含1
‰
amp的lb培养基上，于37℃恒温培养箱培养直至长出单菌落。
[0035]
从氨苄抗性筛选平板挑取单菌落进行菌落pcr鉴定含ppic9k-s356a的重组质粒，提取pcr阳性菌落的质粒进行测序，验证阳性克隆。
[0036]
将验证正确的ppic9k-s356a的阳性克隆子提取质粒并使用sal i将所提质粒线性化，采用电击转化法转化至毕赤酵母smd1168中，涂于md平板中30℃培养直至长出单菌落。从md平板上挑取单菌落，转接于含g418(终浓度为2.5mg/ml)抗性的ypd平板上，在恒温培养箱中30℃条件下倒置培养至有单菌落生长。挑取单菌落，转接于10ml的ypd液体培养基中，在30℃、180rpm条件下过夜培养18h，将活化菌液进行保种和阳性鉴定。
[0037]
α-l-鼠李糖苷酶的诱导表达和纯化：
[0038]
含有突变型或野生型α-l-鼠李糖苷酶基因的基因工程菌菌液按照1％的接种量接种于50ml ypd液体培养基(含1mg/ml氨苄抗性)，30℃、200rpm/min培养16h，测量确定其od
600
达到3.0～5.0。静置3～4h弃上清，将菌体全部转接至100mlbmmy培养基，30℃，培养7d，培养期间每隔24h则向培养基中加入0.5％无水甲醇；培养结束，离心收集上清即为酶液。
[0039]
利用亲和层析得到野生型酶(wt)和突变酶(r-rha1-s356a)的单一蛋白条带，sds-page分析如图3所示，图中1是wt，2是r-rha1-s356a。突变酶的分子质量与野生型酶一致，大小约为100kda。
[0040]
实施例2α-l-鼠李糖苷酶wt及r-rha1-s356a在催化柚皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷、
新橙皮苷、枸橘苷水解释放l-鼠李糖效率的测定
[0041]
以0.5mmol/l的柚皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷、新橙皮苷、枸橘苷为底物，测定wt和r-rha1-s356a的转化率，反应体系为：1ml 0.5mmol/l柚皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷、新橙皮苷、枸橘苷，980μl的0.02mol/l柠檬酸-磷酸盐缓冲液(ph 4.0)，在60℃条件下温育10min后迅速加入20μl酶液(wt或r-rha1-s356a)，反应10min后放入100℃的沸水中煮沸10min终止反应。
[0042]
用1ml注射器取1ml反应液，通过0.22μm的水相滤膜注入1.5ml的液相瓶中，最后通过安捷伦1260液相色谱仪测定残余底物浓度，测定残余底物浓度表明不同酶的底物特异性转化率，即l-鼠李糖的生成率。空白对照是在对应的ph条件下，100℃下处理30min的灭活wt和r-rha1-s356a。
[0043]
结果如表3和图4所示，r-rha1-s356a与wt相比，水解柚皮苷释放l-鼠李糖的效率由23.85％提高至48.89％，提高了105％，对于其他黄酮类化合物并未改变，对于生物制备l-鼠李糖具有广阔的应用前景，为黄酮糖苷类化合物的工业化应用提供了重要的工具酶。
[0044]
表3：
[0045][0046]
综上，根据本发明的实施例，通过分子对接，分析与柚皮苷作用的氨基酸，利用定点突变的方法得到一株α-l-鼠李糖苷酶突变体r-rha1-s356a，发现了该突变体具有优良的酶学特性。与wt相比，在催化柚皮苷时，转化率提高了105％，但对其他黄酮类化合物并未改变，对于生物制备l-鼠李糖具有广阔的应用前景，为黄酮糖苷类化合物的工业化应用提供了重要的工具酶。
[0047]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0048]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。