一种使口蹄疫标记病毒生长适应力强的BHK21悬浮细胞克隆株及其筛选方法与流程

一种使口蹄疫标记病毒生长适应力强的bhk21悬浮细胞克隆株及其筛选方法
技术领域
1.本发明涉及一种使口蹄疫标记病毒(特别是口蹄疫标记病毒o型、a型二价3b蛋白表位缺失病毒)生长适应力强的bhk21悬浮细胞的克隆株及其筛选方法。


背景技术：

2.口蹄疫(foot and mouth disease，英文简称fmd)，是一种由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，fmdv)感染偶蹄类动物(如猪、牛、羊、鹿等)所产生的疾病，其特征为受感染偶蹄类动物的口、足等部位皮肤会出现水泡，而造成部分动物死亡，影响畜牧产业的发展甚钜，故普受各国重视。
3.用反向遗传学技术，缺失和改造了病毒的非结构蛋白优势表位基因，成功研制出口蹄疫o型和a型二价标记疫苗。该疫苗能实现自然感染与疫苗免疫动物的精准区分，解决了常规灭活疫苗干扰鉴别诊断的问题。标记疫苗是为了适应未来净化疫病的需要，能够精准识别自然感染与疫苗免疫动物，克服了常规灭活疫苗抗体干扰鉴别诊断的缺陷，对口蹄疫防控净化意义重大。
4.bhk21细胞即叙利亚仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cell)于1961年由ia-macpherson和m-g.p-stoker建系，源自5只未辨性别的1日龄仓鼠肾，该细胞广泛用于增殖病毒生产疫苗。原始的bhk21细胞株为贴壁生长型细胞，驯化成悬浮培养型细胞系可用生物反应器悬浮培养进行病毒大规模增殖，由于生物反应器的使用在提高疫苗产量的同时还可以提高疫苗的质量。1965年capstick等在生物反应器中用驯化的悬浮培养型bhk21细胞培养生产了口蹄疫疫苗，开启了bhk21细胞悬浮培养应用的新篇章。采用全悬浮细胞培养病毒时，用于生产病毒的细胞的性能以及细胞与病毒之间的适应性极大地影响病毒的产量、抗原的完整性，进而影响病毒制备疫苗的免疫效果和安全性。
5.常规bhk21悬浮细胞单细胞克隆方法，是采用在96孔细胞板中有限稀释法进行的，得到只有1个细胞的细胞孔，培养观察7天得到生长快的单克隆细胞，由于常规方法克隆的细胞本身是由贴壁细胞经过悬浮驯化培养的细胞，细胞在静止培养时在培养基质(培养板、培养瓶)上，需要传代吹打使细胞完全悬浮，弱化贴壁性。细胞扩大培养步骤繁琐，培养周期时间长。
6.为了克服常规bhk21悬浮细胞单细胞克隆方法的缺陷，发明人独创一种新的bhk21悬浮细胞琼脂糖单细胞克隆方法。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种bhk21悬浮细胞单细胞克隆株的筛选方法，可以精准地得到想要的克隆株细胞，在细胞筛选和扩大培养中缩短了培养周期，降低细胞污染的风险，提高细胞对培养基的适应力，而且由该克隆株接种毒株后生产的抗原液的有效抗原含量高。
8.本发明提供了一种bhk21悬浮细胞克隆株的筛选方法，尤其是一种使口蹄疫标记病毒生长适应力强的bhk21悬浮细胞克隆株的筛选方法，包括以下步骤：(1)bhk21悬浮细胞的复苏和培养：将冻存的bhk21悬浮细胞进行复苏；使用含有3％(v/v)胎牛血清的悬浮培养基培养；当细胞生长密度达到1
×
106cells/ml接入到250ml三角摇瓶中，分别使用40μm、70μm、100μm细胞筛网，筛出细胞颗粒均匀、饱满的bhk21悬浮细胞接入250ml三角摇瓶中，用含有3％(v/v)胎牛血清的悬浮培养基培养两代；(2)bhk21悬浮细胞克隆培养：将1.4％琼脂与2
×
培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，孵育使之凝固；将制备好的单细胞悬液加入6孔板，并加入0.8％琼脂糖溶液作为上层胶；待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次；根据细胞的生长速度培养1周后显微镜下观察克隆大小，挑出单个的细胞克隆株进行扩大培养；(3)软琼脂培养和细胞克隆能力测定：用含10％胎牛血清的2
×
deme培养液，按1∶1比例与1.4％浓度琼脂糖溶液混合制培养液，将该培养液直接铺板，并在0.8％浓度琼脂糖溶液中，分别添加最终浓度为2％的胎牛血清rp培养基、1.5％胎牛血清rp培养基、1％胎牛血清rp培养基、0.5％胎牛血清rp培养基，再与终浓度为10个/ml bhk21悬浮细胞充分混合后铺板进行培养；将含有15个以上细胞的集落判定为一个克隆并计算细胞克隆形成率；从对照组血清含量2％浓度、和血清含量为0.5％浓度的rp培养皿中，取出克隆细胞，转移到常规的悬浮培养基中，传代、扩大培养，筛选得到bhk21悬浮细胞克隆株。
9.本发明的目的还在于由本发明的筛选方法得到的bhk21悬浮细胞克隆株。
10.本发明还提供了一种bhk21悬浮细胞克隆株bhk21-klxf-qz5，其特征在于，其生物保藏编号是：cctcc no.c2021125，保藏时间是2021.12.25，保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国湖北省武汉大学。
11.本发明还提供了bhk21细胞系bhk21-klxf-qz5悬浮细胞克隆株或者根据本发明筛选方法获得的bhk21悬浮细胞克隆株在制备病毒抗原中的应用。
12.本发明的有益效果：
13.1.针对兽用疫苗悬浮细胞bhk21细胞，建立了一种新型的细胞克隆方法；该方法和以往的常规有限稀释法相对比，在收获克隆株时间上缩短了1倍。
14.2.本方法和以往的常规有限稀释法相对比，本克隆株不用从贴壁细胞或半悬浮半贴壁细胞再驯化成悬浮细胞。增大了“克隆株”细胞对培养基的适应率。
15.3.无血清驯化培养的优点是将高通量细胞克隆/筛选技术与无血清大规模悬浮培养技术相结合，预计可将抗原培养水平提升约500倍；将无血清培养技术与亲和层析技术相结合，预计可将疫苗纯度由0.4-20％提升至2-4倍，甚至预计可以达到更高的纯度，预计可基本消除疫苗的副反应；在疫苗纯度增加的情况下，预计可最大限度地利用动物免疫系统资源，提高抗原免疫原性，大幅度提高疫苗的免疫效力，预计在临床上可将动物一次免疫后保护期内中和抗体由普遍低于64提高到接近200(中和抗体达到32即可有效预防动物口蹄疫)，这就可以减少动物免疫接种次数，从而改写口蹄疫疫苗的免疫程序，具有重大的临床意义。
16.4.该“克隆株”为使口蹄疫标记疫苗o型、a型二价3b蛋白表位缺失病毒生长适应力强的bhk21悬浮细胞，解决了抗原含量低的难题。口蹄疫标记疫苗病毒在扩大培养过程中通常需要复壮，在本发明的单独的克隆株上表现出标记疫苗病毒繁殖稳定。
附图说明
17.图1是在24h-72h之间由单个生命力旺盛的bhk21单个细胞所形成的bhk21悬浮细胞克隆簇。
18.图2是在132-168h之间bhk21悬浮细胞形成的团状克隆簇。
19.图3是在50ml离心管中扩大培养的细胞的光学显微镜照片。
20.图4显示了经过无血清驯化培养的克隆株细胞。
21.图5显示了用电子细胞自动计数仪对bhk21悬浮细胞克隆株无血清培养10代的细胞评估。
22.图6显示了bhk21-klxf-qz5克隆株与未按照本发明方法克隆的bhk21悬浮细胞(即克隆前的bhk21悬浮细胞)的生长曲线对比图。
具体实施方式
23.下面，参照附图对本发明的具体实施方式进行详细的说明。
24.若未特别指明，实施例中所用的技术手段是本领域技术人员的常规手段；若未特别指明，实施例中的生物和化学材料均为市售。
25.本发明提供一种使口蹄疫标记病毒生长适应力强的bhk21悬浮细胞克隆株的筛选方法，包括如下步骤：
26.(1)bhk21悬浮细胞克隆株的制备：
27.a.bhk21悬浮细胞的复苏和培养：将冻存的同一批次的2支bhk21悬浮细胞(商购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心)进行复苏，使用添加有3％(v/v)胎牛血清的悬浮培养基(bs-smf iv无血清培养基，来自苏州沃美生物技术有限公司，品牌倍进)在100ml细胞培养瓶中培养。当细胞生长的密度达到1
×
106细胞/ml分别接入到250ml三角摇瓶中，分别使用40μm；70μm；100μm细胞筛网，筛出细胞颗粒均匀、饱满的bhk21悬浮细胞接入250ml三角摇瓶中，用添加有3％(v/v)胎牛血清的悬浮培养基培养两代。
28.b.bhk21悬浮细胞克隆培养：将1.4％琼脂糖与2
×
培养基(2倍的bs-smf iv无血清培养基)混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37℃孵育30min使之凝固；每孔的细胞含量为3个/ml。将1ml细胞悬液加入99ml无血清培养基(bhk21悬浮细胞密度调整到300个/ml)制备单细胞悬液。将制备好的单细胞悬液加入6孔板，并加入0.8％琼脂糖溶液作为上层胶，每孔1.3ml。待其凝固后，再在上面加入培养基(即含有2％胎牛血清的bs-smf iv培养基)，每3天更换一次；根据细胞的生长速度培养1～2周后显微镜下观察克隆大小，每个克隆》50个细胞，挑出单个的细胞克隆株放入加有悬浮培养基的50ml离心管中分离扩大培养。
29.其中单细胞克隆株传代放大培养流程为：
30.6孔板1孔(或培养皿1个)
→
1个50ml离心管
→
1个50ml离心管
→
1个125ml锥形细胞培养瓶。
31.c.软琼脂培养和细胞克隆能力测定：用蒸馏水分别制备出1.4％和0.8％浓度的琼脂糖溶液，高压灭菌。按常规方法用含10％胎牛血清的2
×
deme培养液，按1∶1比例与1.4％浓度琼脂糖溶液混合制培养液，将含1.4％浓度的琼脂糖的混合培养液直接铺板，并在0.8％浓度琼脂糖溶液中，分别添加最终浓度为2％的胎牛血清rp培养基(rpmi 1640)、1.5％胎牛血清rp培养基、1％胎牛血清rp培养基、0.5％胎牛血清rp培养基(共4组，其中2％
的胎牛血清rp培养基作为对照组)，再与终浓度为10个/ml bhk21悬浮细胞充分混合后铺板，37℃5％co2培养。每日观察细胞成活及克隆形成的情况，持续培养15天。将含有15个以上细胞的集落判定为一个克隆并按公式(克隆形成数目/接种细胞数目
×
100％)计算细胞克隆形成率。从血清含量为2％浓度(对照组)、和血清含量为0.5％浓度的rp培养皿中，取出克隆细胞，转移到常规的悬浮培养基中，传代、扩大培养，可以获得对照组和0.5％血清含量实验组的克隆株(从中筛选得到bhk21悬浮细胞克隆株bhk21-klxf-qz5)。
32.表1不同含量血清rp培养基“细胞克隆形成的增殖率”33.从表1可以看到，0.5％胎牛血清rp培养基实验组在24-72h时的细胞增殖率为15％，132-168h的细胞增殖率为98％。
34.图1为在0.5％胎牛血清rp培养基实验组中观察到的在24h-72h时由单个生命力旺盛的bhk21单个细胞所形成的bhk21悬浮细胞克隆簇，细胞克隆增值率达到15％左右，细胞活力旺盛。
35.图2是在0.5％胎牛血清rp培养基实验组中观察到的在132-168时bhk21悬浮细胞形成的团状克隆簇，得到“克隆株”细胞，细胞克隆增殖率达到98％，细胞活力旺盛。
36.图3是在50ml离心管中扩大培养的细胞的光学显微镜照片。
37.得到的“克隆株”可以通过筛选扩大培养。
38.(2)bhk21悬浮克隆株细胞无血清驯化：血清含量0.5％rp培养基实验组的克隆株细胞在250ml摇瓶扩大培养到2.7
×
106细胞/ml的密度时分别使用40μm、70μm、100μm细胞筛网，筛出细胞颗粒均匀、饱满的bhk21悬浮细胞接入250ml三角摇瓶中，用无血清悬浮培养基连续驯化培养10代以上。培养10代的细胞如图4所示。用电子细胞自动计数仪对bhk21悬浮克隆株细胞无血清培养10代的细胞进行评估，如图5所示。
39.如图5所示，通过用无血清悬浮培养基连续驯化培养10代，在电子细胞自动计数仪中可以得到总细胞密度在4.16
×
106/ml，活细胞浓度3.68
×
106/ml。细胞活率99.12％。细胞形态均匀，平均直径16.89μm,接团率为10.37％。以上实验数据证明克隆驯化株bhk21-klxf-qz5的生物特性稳定，符合用于生产用细胞种子。
40.(3)口蹄疫标记毒株o/rv-1株和a/rv-2株(参见专利文献cn109536461a和cn104826098a)在悬浮克隆株细胞上的适应力实验：无血清培养基克隆株(即经无血清驯化后的克隆株)在培养细胞数较低(细胞数为4.0
×
106cells/ml)时在细胞上清中即可产生较高的毒价；同时细胞病变快，在接毒后7h-8h病变就达到90％，即可收毒，收毒时间早，毒价为10
8.7
tcid
50
/ml；而克隆前的细胞(a步骤中的复苏的另外一支细胞)在接毒后8h-10h毒价
达到最高，毒价为10
7.7
tcid
50
/ml；经对比，无血清培养基克隆株的细胞病变较快，毒价高于克隆前的细胞的毒价，在产毒时间上也有明显优势。
41.(4)bhk21悬浮克隆株生产的抗原液的质量分析：克隆前的bhk21悬浮细胞(指a步骤中的复苏的另外一支细胞)和bhk21无血清悬浮克隆株分别在5000ml细胞摇瓶中培养，培养体积为2000ml，培养条件为5％co2，37℃，120rpm。培养38h后按照moi 0.01-0.1分别接种口蹄疫标记o/rv-1，a/rv-2毒株，当细胞病变达到75％～85％时收获病毒液，冻融3次，5000r/min、4℃离心30min去沉淀，收获上清，即得o/rv-1抗原液。对培养后得到的抗原液(上清)，测定毒价；同时用lorry法测定总蛋白，比较两种抗原的总蛋白量；并用高效液相色谱检测比较有效抗原含量(146s含量)。
42.表2
43.(5)bhk21无血清驯化悬浮细胞单细胞克隆株原始细胞库的建立：根据培养过程中细胞的长势和形态情况，挑选优势细胞进行保种冻存，需满足1000ml锥形细胞培养瓶中的细胞密度达到4
×
106个/ml以上、细胞活力在97％以上，冻存71支建立原始细胞库。冻存方法:取细胞悬浮以l000rpm离心7min后弃上清，用细胞冻存液重新悬浮离心后的细胞并调整细胞浓度为5
×
108个/ml，每支冻存管按l.5ml分装，贴标签后按常规方法在液氮中保存，标签要标记细胞编号、细胞株名称、克隆株号、细胞代次和冻存日期等信息，建立原始细胞库，保存种子细胞。
44.(6)挑选高密度bhk21无血清驯化悬浮细胞单细胞克隆株，建立主细胞库：从原始细胞库中复苏单细胞克隆株并培养，传代时使用无血清培养基，每次传代时调整细胞初始密度为1-2
×
105个/ml，弃去多细胞传代培养，在7代内以4-5
×
106个/ml接种培养，能在48小时细胞密度达到12.4
×
106个/ml以上的单克隆株冻存200支，建立主细胞库，冻存制作无血清悬浮培养单克隆细胞株，绘制细胞的生长曲线。同期也按上述方法复苏克隆前的bhk21悬浮型细胞进行培养比较(参见图6)。
45.细胞冻存液的组分：10％二甲基亚砜(dmso) 90％胎牛血清(均为体积百分数)
46.(7)高密度无血清驯化悬浮培养单细胞克隆株的生物反应器培养:取无血清驯化培养的高密度悬浮培养单克隆细胞株，用生物反应器无血清培养基流加培养方式连续培养
两批。初始接种细胞密度4.0
×
106个/ml，初始培养体积为5.0l。
47.表3生物反应器5.0l的参数
48.(8)保藏
49.取生物反应器培养密度达到2.0
×
108个/ml主细胞库冻存的bhk21/klxf/qz5克隆株细胞，用加干冰的包装快运至中国典型培养物保藏中心(武汉)进行保藏，以防单一地方保藏时发生意外造成资源丢失。bhk21/klxf/qz5克隆株分类命名：仓鼠肾细胞bhk21/klxf/qz5，保藏编号为：c2021125，保存日期：2021年12月25日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国湖北省武汉大学。
50.(9)结果
51.9.1通过单细胞克隆筛选，最后保留6株优势细胞株建立原始细胞库，细胞均为均匀的悬浮细胞，细胞编号和冻存信息见表4。
52.表4
53.9.2从原始细胞库中复苏后进行挑选，其中bhk21/klxf/qz5克隆株细胞，在第3代时培养48小时细胞密度达到12.4
×
106个/ml，冻存200支建立主细胞库。
54.9.3从主细胞库中复苏bhk21/klxf/qz5克隆株细胞，无血清培养基摇瓶培养3代以后以5.3
×
106个/ml接种培养，在48h时平均细胞达87.9
×
106个/ml。而克隆前该细胞在48h时平均细胞为52.1
×
106个/ml，克隆株的细胞密度提高了35.8
×
106个/ml，并且克隆株在96h时细胞平均密度还在89.7
×
106个/ml，此时克隆前该细胞平均细胞密度下降到50.1
×
106个/ml。bhk21/klxf/qz5克隆株细胞在无血清培养基摇瓶培养中可以连续传代，且满足高密度的克隆细胞株。
55.9.4 bhk21/klxf/qz5克隆株细胞和该克隆前细胞用无血清培养基在生物反应器流加培养对比得出：96h时克隆株细胞平均密度达到120
×
105个/ml，而克隆前该细胞在96h时平均细胞为59.7
×
105个/ml，克隆株的细胞密度提高了近一倍，并且克隆株在120h时细胞平均密度还在122.6
×
105个/ml，此时克隆前该细胞平均细胞密度下降到60.1
×
105个/ml。bhk21/klxf/qz5克隆株细胞用无血清培养基在生物反应器流加培养中，生物特性和稳
定性比克隆前效果好。
56.9.5 1000l生物反应器全悬浮无血清培养bhk21/klxf/qz5克隆株细胞，细胞密度达到3-5
×
106个/毫升时病毒感染复数moi 0.01-0.1接种口蹄疫病毒标记毒株o/rv-1株和a/rv-2株，制备病毒原液，搅拌速度不超过40rpm，培养2天收获病毒液，使用制备型低速连续流离心机离心出去细胞碎片，同时收获上清液和沉淀；沉淀在triton-x-100存在的条件下裂解口蹄疫病毒感染细胞和细胞碎片，triton-x-100的终浓度为0.1-0.2％，反复冻融3次后超声3次，用制备型低速连续流离心机离心收集上清液，合并上清液。经检测结果为：口蹄疫病毒标记毒株o/rv-1株和a/rv-2株滴度≥18logtcid
50
/ml；总蛋白量为5-7克；口蹄疫病毒标记毒株146s含量为70-85μg/ml；bhk21/klxf/qz5细胞残余dna量≤5000pg/ml。
57.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。