大黄鱼白细胞介素2基因启动子序列及其应用的制作方法

技术特征：
1.大黄鱼il-2基因启动子，其特征在于其序列为：2.如权利要求1所述大黄鱼il-2基因启动子的活性分析方法，其特征在于包括以下步骤：1)采用clontech公司绿色荧光蛋白表达系统以及promega公司双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子的活性，并分析免疫刺激物大肠杆菌脂多糖lps、人工合成双链rnapoly(i:c)、t细胞活化剂植物凝集素pha、刀豆蛋白con-a、钙离子霉素ci、佛波酯pma对其活性的影响；2)将大黄鱼il-2基因启动子区片段插入clontech公司绿色荧光蛋白报告基因载体pegfp1中，使绿色荧光蛋白基因位于该启动子的控制下，得到重组表达载体pegfp1-il2p，将该重组载体转染鲤鱼上皮瘤细胞(epc细胞)，45～50h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况；3)将大黄鱼il-2基因启动子序列插入promega公司荧光素酶报告基因载体pgl3-basic中，使萤火虫荧光素酶基因位于该启动子的控制下，构建得到重组载体pgl3-il2p；用pgl3-il2p和海肾荧光素酶报告基因载体prl-tk共同转染epc细胞，45～50h后收集转染细胞，利用双荧光素酶报告基因检测系统分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活，通过计算二者比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性；4)将空载体pgl3-basic和重组载体pgl3-il2p分别与海肾荧光素酶报告基因载体prl-tk共同转染人jurkat-t细胞，以空载体pgl3-basic转染细胞的荧光素酶相对活性作为对照，计算出该启动子的相对活性；再用pbs、lps、poly(i:c)、pha、con-a、ci、pma及ci pma分别刺激pgl3-il2p和prl-tk共转染的jurkat-t细胞，通过分析各处理组荧光素酶相对活性的变化，确定大黄鱼il-2基因启动子的活性是否受刺激物诱导的影响。3.如权利要求1所述大黄鱼il-2基因启动子，其特征在于其克隆及其启动子活性的鉴定在构建大黄鱼il-2基因的表达调控机理实验系统中应用。4.如权利要求1所述大黄鱼il-2基因启动子在构建真核表达载体在鱼类或哺乳类细胞中高效表达外源基因中的应用。5.如权利要求1所述大黄鱼il-2基因启动子在构建转基因鱼中的应用。

技术总结
大黄鱼白细胞介素2基因启动子序列及其应用，提供大黄鱼IL-2基因启动子序列、大黄鱼IL-2基因启动子的活性分析方法、大黄鱼IL-2基因启动子的应用。采用基因组步移的方法克隆大黄鱼IL-2基因启动子，提供大黄鱼IL-2基因启动子序列；经报告基因分析实验证实该序列具有启动子活性，且其活性不受免疫刺激物LPS、Poly的影响，但在T细胞活化剂PHA、Con-A、CI、PMA等的诱导下可显著上调。该启动子的克隆及其活性鉴定，为研究大黄鱼IL-2基因的表达调控提供良好的实验系统，为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将其应用于转基因鱼构建创造条件，具有重要的理论和实际意义。具有重要的理论和实际意义。具有重要的理论和实际意义。


技术研发人员：敖敬群 慕鹏飞 汪玉华 陈新华
受保护的技术使用者：自然资源部第三海洋研究所
技术研发日：2021.12.30
技术公布日：2022/4/8