用于细胞培育肉制造的复合微载体及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种用于细胞培育肉制造的复合微载体及其制备方法。


背景技术：

2.细胞培育肉制造具有提供真正的肉类产品的潜力，而探索更为高效的细胞培养及分化的处理手段是世界范围内细胞培育肉制造面临的重要课题。
3.细胞的培养可以通过发酵罐、细胞工厂等进行大规模的细胞生产，而关于细胞的分化、生肌相关研究目前鲜有报道。尤其是成肌细胞的分化方向的研究，尚没有发表可以有效调控促进成肌细胞分化的载体出现。因此，细胞培育肉研究中可以有效促进成肌细胞分化的相关设备、方法及载体亟待解决。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供一种可以促进贴壁的成肌细胞快速的进入分化阶段并随之促进成肌细胞实现生肌功能的用于细胞培育肉制造的复合微载体。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于细胞培育肉制造的复合微载体，它包括微载体球，所述微载体球的表面为网状结构，所述微载体球包括多糖、醛酸和蛋白，所述多糖、醛酸和蛋白的摩尔百分比为70～80％：15～25％：3～5％，在所述微载体球的表面设置表面处理层，所述表面处理层包括蛋白和多聚赖氨酸，所述蛋白和多聚赖氨酸的摩尔百分比为35～90％：10～20％。需要说明的是，上述70～80％等表达方式为区间值，即70％到80％之间。
6.优选的，所述表面处理层的蛋白包括丝素蛋白和胶原蛋白，且丝素蛋白、多聚赖氨酸和胶原蛋白的摩尔百分比为30～80％：10～20％：5～10％。
7.进一步的，所述微载体球的多糖、醛酸和蛋白的摩尔百分比为75％：20％：5％；所述表面处理层的丝素蛋白、多聚赖氨酸和胶原蛋白的摩尔百分比为75％：20％：5％。
8.一种制备用于细胞培育肉制造的复合微载体的方法，包括如下步骤：
9.第一步：在水中按照多糖、醛酸和蛋白的摩尔百分比为70～80％：15～25％：3～5％将三者混匀后灭菌，然后通过微粒发生器进入到ca2 溶液中形成微载体球；
10.第二步：将微载体球置于孔径为20
‑
100um的虑筛上，将虑筛置于酸性溶液中，摇动虑筛改变载体与虑筛接触位置，直至载体表面充满网状结构；
11.第三步：将蛋白和多聚赖氨酸配成摩尔百分比为35～90％：10～20％的溶液，将微载体球转入该溶液中10
‑
24h，完成微载体球的表面处理；
12.第四步：将表面处理后的微载体球进行晾晒，使其表面水分蒸发后呈褶皱状态，将载体转入饱和的丝素蛋白溶液中浸润保存。
13.本发明的有益效果：
14.本发明相对于基于聚苯乙烯材料合成的微载体和基于动物源蛋白合成的微载体来说，材料成本和制作成本明显降低，且环保可食用。载体表面生物相容性高。表面纹路设
计利于细胞分化伸展形成肌管生成肌纤维。
15.本发明中载体针对成肌细胞分化，可提供多种细胞培养方式，包括灌流方式、平面培养方式等形成固定形态的培育肉，也可以通过大规模培养模式形成不定型的细胞肌纤维载体螯合物。
16.本发明中的载体基于天然多糖类材料、蛋白类辅助材料以及表面处理后，可有效刺激成肌细胞贴壁后细胞的自我调控，改变细胞基因表达及信号通路，促使细胞进入分化阶段，进而促进肌管的形成及肌纤维的产生。
17.本发明中载体的比重为1.02
‑
1.05g/cm3，在不同培养基中均可实现触底供细胞附着贴壁，载体的沉降速率范围在50
‑
100cm/min之间，保证了载体在培养基中的沉降不会对细胞造成较大的影响，两者结合后有利于成肌细胞在载体上的贴附，可有效促进细胞的贴壁效率。
附图说明
18.图1为载体微球初始形态图；
19.图2为载体微球高温高压灭菌后形态图；
20.图3为载体微球表面处理图；
21.图4为载体微球接种细胞图；
22.图5为载体微球细胞增殖图；
23.图6为载体微球细胞分化图；
24.图7为载体微球细胞级联成肌图；
具体实施方式
25.下面结合附图1
‑
7对本发明做详细介绍：
26.本发明用于细胞培育肉制造的复合微载体主要包括微载体球，微载体球为不规则的球体，微载体球的表面为网状结构，微载体球包括多糖、醛酸和蛋白，然后在所述微载体球的表面涂布表面处理层，表面处理层包括蛋白和多聚赖氨酸。微载体球所提供的的细胞附着位点间距小于细胞直径，即多糖、蛋白、羧基化合物等提供的羟、羧、氨基位点距离不超过30um。微载体球中的醛酸也可通过其他富含羟、羧、氨基成分进行有效替代。
27.本发明选取藻类提取的天然多糖作为主要材料，其特点是白色无味，溶于水而不溶于乙醇，具有一定粘性，并且该多糖在ph＝6
‑
9时其结构及粘性相对稳定，并且随着ph增加，其亲水性提升，该材料最大的特点是ph敏感性，可在温和条件下形成凝胶结构，而且可以有效保证载体混合物中蛋白、酶及对细胞的活性物质的活力。
28.本发明中基于亲水基团和生物相容性两点评价材料提高载体生物相容性的，本发明选择醛酸作为增加载体亲水性材料，醛酸类物质的羧酸基可作为阴离子表面活性剂的亲水基增加载体的亲水性，加入生物相容性高的蛋白目的有两个：一是蛋白类的氨基可以作为阳离子表面活性剂亲水基团增加亲水性，而是蛋白类物质与细胞接触后可以进行有效的结合从而促进细胞的贴壁、形态变化。
29.本发明中，多糖优选海藻酸钠，醛酸优选古罗糖醛酸，微载体球的蛋白选用丝素蛋白。表面处理层的蛋白采用丝素蛋白和胶原蛋白。
30.作为复合微载体的第一实施例：微载体球的海藻酸钠、古罗糖醛酸和丝素蛋白的摩尔百分比为75％：20％：5％；表面处理层的丝素蛋白、多聚赖氨酸和胶原蛋白的摩尔百分比为75％：20％：5％。
31.其制备方法如下：a.载体材料前处理：在40℃水中按照摩尔百分比75:20:5加入海藻酸钠、古罗糖醛酸和丝素蛋白，充分混匀，然后将混合液体通过121℃、30分钟进行高压灭菌，冷却后转入4℃冷藏备用。通过高温高压灭菌，可以调整载体的初始状态，使其韧性提高，尺寸变小，还可以促进载体表面亲水基团和细胞接触蛋白的暴露，利于细胞培养过程中细胞的贴壁。
32.b.复合微载体微粒的制备：将灭菌完成的液相载体通过微粒发生器，调节液滴直径400um，通过发生器将液滴打入ca2 溶液中，使液滴与ca2 发生反应从而凝固成球形微粒。本发明中载体制备过程微粒发生系统制备的原理是当有ca2 、sr2 等阳离子存在时，藻类多糖中醛酸的g单元上的羧基阳离子与二价阳离子发生离子交换反应，g单元堆积形成交联网络结构，从而形成凝胶微球。基于此原理，本发明中微粒发生系统将藻类多糖及其他混合物溶液通过微粒发生器管壁流出，进入到ca2 溶液中，形成载体微球，进而形成载体初始形态。
33.c.复合微载体塑形处理：将孔径为50um的吸水性虑筛置于酸性溶液中(优选的，将其置于浓度为20％的柠檬酸溶液中)，对载体表面进行溶解，摇动虑筛改变载体与虑筛接触位置30min/次，直至载体表面充满网状结构。将载体置于70％湿度的空气中使载体失水。
34.d.复合微载体表面处理：将丝素蛋白、多聚赖氨酸、胶原蛋白配置成摩尔百分比为丝素蛋白75％，多聚赖氨酸20％，胶原蛋白5％的溶液，将进行塑形的复合微载体转入表面处理的溶液中，4℃，浸润12h从而完成复合微载体的表面处理。
35.e.微载体的生成：将表面处理后的复合微载体置于无菌、自然通风处进行自然晾晒，当载体表面水分蒸发完成，表面呈褶皱状态后，将载体转入饱和的丝素蛋白溶液中浸润保存。
36.作为复合微载体的第二实施例：微载体球的海藻酸钠、古罗糖醛酸和丝素蛋白的摩尔百分比为70％：25％：5％；表面处理层的丝素蛋白、多聚赖氨酸和胶原蛋白的摩尔百分比为70％：20％：10％。其制备方法同第一实施例。
37.作为复合微载体的第三实施例：微载体球的海藻酸钠、古罗糖醛酸和丝素蛋白的摩尔百分比为77％：20％：3％；表面处理层的丝素蛋白、多聚赖氨酸和胶原蛋白的摩尔百分比为80％：13％：7％。其制备方法同第一实施例。
38.作为复合微载体的第四实施例：微载体球的海藻酸钠、古罗糖醛酸和丝素蛋白的摩尔百分比为77％：20％：3％；表面处理层只采用丝素蛋白和多聚赖氨酸，丝素蛋白和多聚赖氨酸的摩尔百分比为80％：20％。其制备方法同第一实施例。
39.需要说明的是，本发明中，表面处理层是让更多的羧基位点、羟基位点及蛋白位点暴露以便充分与细胞结合，形成细胞贴附位点。在充分考虑生物相容性的前提下通过蛋白类、多糖类等物质进行有效搭配，本案例中表面处理层所涉及的蛋白、多糖等物质的目的是为表面提供更多的羧基、羟基、氨基等细胞附着位点，在不改变提供附着点的前提下，除了丝素蛋白以外，其他蛋白、多糖成分也可以用其它具有同等功效的物质替代。