一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法与流程

一种肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的制备方法
技术领域
1.本发明属于免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的制备方法。本发明的细胞毒性t淋巴细胞是由经携带免疫负调控基因socs1基因及碳酸酐酶ix基因的raav2修饰的树突状细胞激活的，具有ca9肿瘤抗原特异性，可用于抗肾细胞癌的免疫细胞治疗。


背景技术：

2.成人肾脏中最常见的占位性病变—肾细胞癌（renal cell carcinoma, rcc）约占所有肿瘤2%，且在全世界范围内每年以1.5-5.9%增长。部分患者首诊时已是晚期或发生远端转移，且肾癌具有多重耐药基因对放疗、化疗不敏感，愈后较差，中位生存时间《12个月，5年生存率《10%。目前，手术切除是最好的治疗方法，但棘手的是，微小和转移病灶难以手术切除，术后患者复发率高达20%-40%；此外，部分患者采用il-2，ifn-α等细胞因子治疗有效，但药物的毒性作用十分明显。
3.rcc的发生、发展与患者体内的t淋巴细胞功能缺陷有关。特别是rcc患者到了晚期，患者体液免疫与细胞免疫功能普遍低下，rcc细胞无法被t细胞识别、杀伤。由于荷瘤宿主的树突状细胞（dendritic cell, dc）数量少，无法有效递呈rcc抗原，且rcc细胞分泌vegf、il-10、tgf-β、pge2等细胞因子和粘附分子，使树突状细胞的成熟分化停留在幼稚阶段或向其他内皮细胞转化，mhc-ii类分子及某些共刺激分子的低表达，从而使得 dc严重降低甚至失去其抗原递呈及激活t细胞的能力。
4.目前体外实验证实，分离患者外周血的淋巴细胞对多种外来抗原具有很好的反应能力。因此肿瘤过继性免疫细胞疗法（dc/ctl）有望成为较好的rcc治疗方法，其作用机制是dc体外荷载rcc抗原，并通过mhc/抗原肽-tcr的相互作用激活特异性ctl，回输机体启动抗rcc免疫应答，清除rcc。目前常采用肿瘤细胞裂解物负载dc，但其有不足，非肿瘤相关抗原种类多，易诱发自身免疫病，且多抗原亦导致免疫原性低；另一种刺激诱导物采用肿瘤抗原肽致敏dc，其特异性好，可多次免疫，但也存在不足，抗原肽价格一般较贵、半衰期短，需多次免疫才能获得良好的ctl。
5.对于负载dc的研究日渐深入，研究人员发现通过制备转基因dc并体外诱导ctl，可促进ctl充分发挥抗肿瘤作用。与肿瘤全抗原、抗原裂解物相比，肿瘤转基因制备的dc/ctl特异性更好，抗肿瘤免疫反应更强；与肿瘤抗原肽相比，肿瘤转基因可持续表达，有效降低dc/ctl制备成本。目前raav因具有感染能力强、安全性好、免疫源性低和体内长时间表达外源基因等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。基于dc的肿瘤细胞靶向治疗技术（anti-cancer cellular immunotherapy, actl）是通过基因重组改建为携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的raav转导dc，刺激产生特异性杀伤肿瘤细胞的ctl。研究表明，ctl反应能力方面，带抗原的raav优于蛋白质负荷，其转染dc效率高达90%以上，且具有上调dc的功能。
6.肿瘤转基因制备dc/ctl方法安全且副作用少，对微小和转移病灶的rcc更有传统
dc细胞；（3）iapa-ca9-dc细胞与t细胞混合培养，获得iapa-ca9-dc/ctl细胞，即树突状细胞激活的ca9肿瘤抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞。
12.上述步骤（1）中所述携带目sisocs1及ca9的目的基因序列依次为：u6启动子序列、socs1 sirna序列、socs1 sirna反向序列、cmv启动子序列、ca9蛋白基因序列、ires序列、flagellin鞭毛蛋白基因序列；所述socs1 sirna序列如seq id no.1所示，socs1 sirna反向序列如seq id no.2所示，socs1 sirna序列和socs1 sirna反向序列，两段序列反向互补，基因片段两端分别带有bamh1/hind
ꢀⅲ
酶切位点；ca9蛋白基因序列、ires序列、flagellin鞭毛蛋白基因序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5所示；目的基因与腺病毒载体组装获得raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体。
13.上述步骤（2）中raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体感染分化诱导成熟的dc细胞，得iapa-ca9-dc细胞；具体包括以下步骤：1）按照全血：生理盐水：淋巴细胞分离液为1:1:1的比例，离心力为650g，离心时间为15min，升速为4、降速为0，离心后提取淋巴细胞分离液上方单个核细胞层，洗涤两遍；2）调整单个核细胞密度到5
×
10
6 cell/ml，按照10
6 cell/cm2的细胞数量加入到培养瓶中，37℃、5%co2浓度培养箱中培养2-4h，轻轻晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸走上层未贴壁细胞离心收集、冻存；3）原培养瓶中加入含2 iu/ml dc细胞培养因子（novoprotein）的lymphocyte serum-free medium kbm 581（kbm581）培养基，于37℃、5%co2浓度培养箱中培养；4）过夜培养后，第2d轻轻晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸走上层未贴壁细胞离心收集、再次冻存；5）dc细胞培养瓶中再次加入含dc细胞培养因子的581培养基，继续培养3d；培养至第5d，将培养基完全换为含2 iu/ml dc细胞成熟因子的kbm581培养基，继续培养48h；收集悬浮细胞，计算细胞总量，按照moi 100进行raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体感染，加raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体感染2h后换液，继续培养48h，获得iapa-ca9-dc细胞。
14.上述步骤（3）中，iapa-ca9-dc细胞与t细胞混合培养的具体步骤为：1）加入刺激因子cd3单抗50 ng/ml，cd
28
单抗50 ng/ml，il-2 1000 u/ml，刺激t细胞增殖；2）t细胞刺激增殖培养48h后，iapa-ca9-dc细胞与t细胞按1:5的比例混合培养，调整细胞密度为1
×
10
6 cell/ml，添加含有il2的kbm581培养基；获得iapa-ca9-dc/ctl细胞。
15.一种包含上述肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的癌症治疗药物。
16.上述肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞在癌症治疗中的应用。
17.上述包含肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的癌症治疗药物在癌症治疗中的应用。
18.有益效果本发明通过带sisocs1及ca9目的基因的raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体感染dc细胞，对dc细胞基因改造获得肾癌抗原ca9蛋白特异性dc细胞，在体外抗原呈递细胞dc iapa-ca9-dc细胞将ca9特异性传递给t细胞，通过扩增获得大量ca9特异性细胞毒性t淋巴细胞iapa-ca9-dc/ctl细胞，以达到治疗癌症的目的。
附图说明
19.图1. raav2-sisocs1-ca9构建示意图。
20.图2.流式细胞仪检测转染dc中ca9的表达。a. 对照组；b. raav2-sisocs1-ca9转染组。
21.图3.流式细胞仪检测ctl的hla.a*2402/ca9四聚体特异性。a. 对照组；b. raav2-sisocs1-ca9转染组图4. iapa-ca9-dc/ctl细胞与t细胞增殖能力对比。
22.图5. iapa-ca9-dc/ctl细胞与t细胞表型变化。a. cd
3
/cd
4
；b. cd
3
/cd
8
；c. cd
3
/cd
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. *p 《 0.05, **p 《 0.01 vs t cells。
具体实施方式
23.为详细说明发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
24.实施例1 肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的制备肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：（1）携带sisocs1及ca9目的基因的raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体的制备：重组病毒载体中目的基因序列依次为：u6启动子-socs1 sirna和socs1 sirna反向序列-cmv启动子-ca9基因-ires序列-flagellin鞭毛蛋白基因序列，raav2-sisocs1-ca9构建示意图如图1。所述socs1 sirna序列如seq id no.1所示，socs1 sirna反向序列如seq id no.2所示，socs1 sirna序列和socs1 sirna反向序列，两段序列反向互补，基因片段两端分别带有bamh1/hind
ꢀⅲ
酶切位点；ca9蛋白基因序列、ires序列、flagellin鞭毛蛋白基因序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5所示；目的基因与2型腺相关病毒载体（aav2）组装获得raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体。目的基因与腺相关病毒载体的组装由汉恒生物科技有限公司完成。
25.（2）dc细胞的分离、分化、成熟及感染按照全血、生理盐水、淋巴细胞分离液1:1:1的比例混合，离心力为650g，离心时间为15min，升速为4、降速为0。离心后提取淋巴细胞分离液上方单个核细胞层，洗涤两遍。
26.dc细胞的分化、诱导及iapa-ca9-dc的制备：调整单个核细胞密度到5
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10
6 cell/ml，按照10
6 cell/cm2的细胞数量加入到培养瓶中，37℃、5%co2浓度培养箱中培养2h，轻轻晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸走上层未贴壁细胞离心收集、冻存。原培养瓶中加入含2 iu/ml il-2、50ng /ml rmgm-csf、25ng /ml rmil-4的kbm581培养基，于37℃、5%co2浓度培养箱中培养。过夜培养后，第2d轻轻晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸走上层未贴壁细胞离心收集、再次冻存。dc细胞培养瓶中再次加入含2 iu/ml il-2、50ng /ml rmgm-csf、25ng /ml rmil-4的kbm581培养基，继续培养3d；培养至第5d，将培养基完全换为含1.2 μg /ml lps 的kbm581培养基，继续培养48h。收集悬浮细胞，计算细胞总量，按照moi 100进行raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体感染，加入raav2-sisocs1-ca9重组病毒载体感染2h后，换成新鲜的含2 iu/ml il-2、50ng /ml rmgm-csf、25ng /ml rmil-4的kbm581培养基，继续培养48h，获得iapa-ca9-dc细胞，流式鉴定raav2-sisocs1-ca9重组病毒感染情况。结果见图2，图2结果表明，与未感染raav2-sisocs1-ca9重组病毒的对照组dc细胞相比，raav2-sisocs1-ca9重组病毒感染的dc细胞ca9成功表达。图2结果表明，raav2-sisocs1-ca9重组
病毒载体成功转染dc细胞，iapa-ca9-dc比例高达83.4%（图2b）。
27.（3）肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的制备。
28.加入刺激因子cd3单抗50 ng/ml，cd
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单抗50 ng/ml，il-2 1000 u/ml，刺激t细胞增殖。t细胞刺激培养48h后，收获iapa-ca9-dc细胞与t细胞，按照1:5的比例混合培养，调整细胞密度为1
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6 cell/ml，添加1000 u/ml il2的kbm581培养基，获得iapa-ca9-dc/ctl细胞。根据细胞生长情况进行补液操作，定期取样、跟踪细胞增殖情况、活率、表型。
29.图3结果表明，iapa-ca9-dc细胞刺激获得的t细胞，即iapa-ca9-dc/ctl细胞（图3b）的hla.a*2402/ca9四聚体阳性率与对照组（图3a）有显著差异。
30.图4 iapa-ca9-dc/ctl与t细胞增殖能力对比。结果表明，iapa-ca9-dc/ctl细胞增殖能力明显高于t细胞。
31.图5结果表明，iapa-ca9-dc/ctl细胞与t细胞对靶细胞ca9-293ft的杀伤活性比较，发现iapa-ca9-dc/ctl细胞对靶细胞ca9-293ft的特异性的细胞杀伤毒性与对照组非特异性的ctl相比显著增强。