用于人乳头状瘤病毒的疫苗及其使用方法与流程

用于人乳头状瘤病毒的疫苗及其使用方法
1.本技术是申请日为2011年10月12日、分案提交日为2017年10月23日、申请号为201710995844.8、发明名称为“用于人乳头状瘤病毒的疫苗及其使用方法”的分案申请的再次分案申请，其中，申请号为201710995844.8的分案申请是申请日为2011年10月12日、申请号为201180074173.2、发明名称为“用于人乳头状瘤病毒的疫苗及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及改进的人乳头状瘤病毒(hpv)疫苗、用于诱导免疫应答的改进的方法、以及用于针对hpv来预防性和/或治疗性免疫个体的改进的方法。


背景技术：

3.乳头状瘤病毒是小dna病毒，其包含至多7个早期基因和2个晚期基因。通常，乳头状瘤病毒早期基因表示为e1-e7，并且乳头状瘤病毒晚期基因表示为l1和l2。若干个物种的动物可被乳头状瘤病毒家族的成员感染。
4.人乳头状瘤病毒(hpv)感染是常见的，并且可发生性传播。基于dna序列的同源性，hpv已经分成56种或更多种类型。16和18型hpv(其引起上皮异常增生和其它病变)通常和下列情况有关：癌症风险增加，特别是子宫颈、阴道、阴门以及肛管的原位和侵入性癌瘤。在全世界将近88％的子宫颈癌是hpv亚型16、18、45、31、33、52以及58所造成的结果。此外，各种研究已揭示hpv6和hpv11存在于大多数发生的复发性呼吸道乳头状瘤病中。尽管已知了hpv6和hpv11与生殖器疣的相关性并且在小百分比的子宫颈癌病例中发现了它们，但已经在2.6％至5.2％的所有情况的低级子宫颈病变中发现了hpv6和hpv11。此外，hpv6和hpv11现已发现与大约20％的现被视为子宫颈癌先兆的低级鳞状上皮内病变，包括2级和3级子宫颈上皮内瘤形成和轻度子宫颈发育不良有关。更多的研究已揭示了两种血清型与各种形式的耳鼻喉科疾病，包括生殖器疣、复发性呼吸道乳头状瘤病、肺癌、扁桃体癌、喉癌、以及头颈部本来良性肿瘤的其它恶性转化和发育不良的相关性。此研究的发现结果揭示了使用共有序列dna疫苗来对抗hpv6和hpv11的光明前景。
5.dna疫苗相对于更加传统的疫苗接种法具有许多概念上的优点，如活减毒病毒和重组蛋白基疫苗。dna疫苗安全、稳定、容易生产并且在临床试验的人中具有良好耐受性，这表明质粒整合的迹象微乎其微[martin,t.等,plasmid dna malaria vaccine:the potential for genomic integration after intramuscular injection.hum gene ther,1999.10(5):第759-68页；nichols,w.w.等,potential dna vaccine integration into host cell genome.ann n y acad sci,1995.772:第30-9页]。另外，dna疫苗非常适于反复施用，因为疫苗的效果实际上不受到对于载体预先存在的抗体滴度的影响[chattergoon,m.、j.boyer以及d.b.weiner,genetic immunization:a new era in vaccines and immune therapeutics.faseb j,1997.11(10):第753-63页]。然而，在移至较大动物时，临床采用dna疫苗的一个主要障碍是平台免疫原性的降低[liu,m.a.和
j.b.ulmer,human clinical trials of plasmid dna vaccines.adv genet,2005.55:第25-40页]。dna疫苗免疫原工程化中的近期技术进展如密码子优化、rna优化和添加免疫球蛋白前导序列已经提高了dna疫苗的表达和免疫原性[andre,s.等,increased immune response elicited by dnavaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage.j virol,1998.72(2):第1497-503页；deml,l.等,multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of dna candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1gag protein.j virol,2001.75(22):第10991-1001页；laddy,d.j.等,immunogenicity of novel consensus-based dnavaccines against avian influenza.vaccine,2007.25(16):第2984-9页；frelin,l.等,codon optimization and mrna amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis c virus nonstructural 3/4agene.gene ther,2004.11(6):第522-33页]，以及质粒递送系统方面的近期开发的技术如电穿孔[hirao,l.a.等,intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques.vaccine,2008.26(3):第440-8页；luckay,a.等,effect of plasmid dna vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques.j virol,2007.81(10):第5257-69页；ahlen,g.等,in vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis c virus nonstructural 3/4adna by increased local dna uptake,protein expression,inflammation,and infiltration of cd3 t cells.j immunol,2007.179(7):第4741-53页]。另外，研究表明相比于单独的天然抗原，共有免疫原的使用能够增加细胞免疫应答的宽度[yan.,j.等,enhanced cellular immune responses elicited by an engineered hiv-1subtype b consensus-based envelope dna vaccine.mol ther,2007.15(2):第411-21页；rolland,m.等,reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1proteins.j virol,2007.81(16):第8507-14]。
[0006]
仍存在对于改进的疫苗和预防与治疗hpv感染、尤其是引起子宫颈癌和/或肺癌、扁桃体癌以及喉癌的感染的方法的需要。


技术实现要素：

[0007]
发明概述
[0008]
本发明的方面包括核酸分子，所述核酸分子包含编码hpv抗原的选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7；其具有90％同源性的片段；及其组合。在一些方面，所述核酸分子包括包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列的核酸分子：编码seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8的核苷酸序列；编码与seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8具有至少90％同源性的氨基酸片段的核苷酸序列；编码seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8的核苷酸序列的片段；以及编码与seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8具有至少90％同源性的氨基酸片段的核苷酸序列的片段。
[0009]
在一些方面，存在包含本文所述的核酸分子的药物组合物。
[0010]
在其它方面，提供在个体中诱导针对hpv的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包含本文所述的核酸分子的组合物。
[0011]
本发明还包括包含本文所述的核酸分子的重组疫苗。所述重组疫苗包括重组牛痘疫苗、活减毒疫苗以及dna质粒。
[0012]
本发明的一些方面包括包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的蛋白质：seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8；以及与seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8具有至少90％同源性的序列的片段。
[0013]
还提供在个体中诱导针对hpv的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用本文提供的重组疫苗。
[0014]
在一些方面，提供包含以下各项的药物组合物：编码hpv抗原的核苷酸序列seq id no:1和seq id no:3；或其片段；或其具有90％同源性的片段。还存在在个体中诱导针对hpv亚型6或11的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用前述药物组合物。
[0015]
在一些方面，提供包含以下各项的药物组合物：编码hpv抗原的核苷酸序列seq id no:5和seq id no:7；或其片段；或其具有90％同源性的片段。还存在在个体中诱导针对hpv亚型33或58的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用前述药物组合物。
附图说明
[0016]
图1.基于e6和e7比对的相邻接合评估的系统发生树(分别为a和b)。星号指示每个树上的共有序列的位置。
[0017]
图2.p6e6e7和p11e6e7的体内表达。从裂解的转染293-t细胞分离基因产物，穿过sds-page凝胶，并使用放射自显影术进行检测。hpv 6和hpv 11e6/e7蛋白皆各自为大约32kda(a)。人横纹肌肉瘤(rd)细胞也用p6e6e7和p11e6e7转染并且随后在免疫荧光染色之后固定。fitc荧光确定了p6e6e7和p11e6e7的表达(b)。dapi荧光确定了hoescht染色之后的核定位。
[0018]
图3.ifn-γelispot测定示出p6e6e7(a)和p11e6e7(b)在c57bl/6小鼠中诱导稳固的细胞介导的应答。使用在三次两周一次的免疫之后从各对应的组(每组5只小鼠)的小鼠中分离的脾细胞进行测定。每次免疫包括每种构建体20μg。组合组中的小鼠以每种构建体20μg接受p6e6e7和p11e6e7两者，每次免疫共计40μg dna。经由im注射，随后进行电穿孔来施用dna(*指示p《0.0001；指示p＝0.0001)。
[0019]
图4.使用个别肽进行另外的ifn-γelispot测定以表征优势肽。从疫苗接种的小鼠和阴性对照中分离的脾细胞用涵盖整个hpv 6e6/e7融合蛋白(a)或hpv 11e6/e7融合蛋白(b)的重叠肽刺激。
[0020]
图5.由细胞内细胞因子染色表征的抗原特异性t细胞的细胞因子产生。将从接种了p6e6e7(a)和p11e6e7(b)的小鼠中分离的脾细胞用r10生长培养基、pma或共有基因肽刺激4小时，随后进行表面标记和细胞内染色。以上点图示出产生ifn-γ、il-2和tnf-α的总cd4 或cd8 细胞的减去了背景的百分比的差异。因为阴性对照组的平均值是零，所以带有星号的点的p值不能被确定。
具体实施方式
[0021]
如本文所使用的，措词"严格杂交条件"或"严格条件"是指这样的条件:在该条件下核酸分子将杂交另一核酸分子，但不杂交其它序列。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将是不同的。较长序列在较高温度下特异性杂交。通常，对于在限定离子强度和ph下的特定序列，严格条件被选择为低于热熔点(tm)约5℃。tm是这样的温度(在限定的离子强度、ph和核酸浓度下)：在该温度下平衡时，与靶序列互补的探针中的50％与靶序列杂交。由于靶序列通常过量存在，因此在tm下平衡时50％的探针被占据。通常，严格条件是这样的条件：其中在ph 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子，通常约0.01至1.0m钠离子(或其它盐)，并且对于较短探针、引物或寡核苷酸(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，且对于较长探针、引物或寡核苷酸温度为至少约60℃。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。
[0022]
核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用fasta、blast和gapped blast(altschul等,nuc.acids res.,1997,25,3389，其以引用的方式整体并入本文)以及paup*4.0b10软件(d.l.swofford,sinauer associates,massachusetts)来测定。“相似性百分比”使用paup*4.0b10软件(d.l.swofford,sinauer associates,massachusetts)来计算。共有序列的平均相似性是相较于系统发生树中的所有序列来计算。
[0023]
简言之，blast算法(表示基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool))适用于确定序列相似性(altschul等,j.mol.biol.,1990,215,403-410，其以引用的方式整体并入本文)。进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先通过鉴定在查询序列中长度w的短字串，该字串与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或者满足某些正数值阈值分值t，从而来鉴定高分序列配对(hsp)。t被称为邻近字串分值阈值(altschul等，同上)。这些初始邻近字串命中作为用于起始搜索以发现含有它们的hsp的种子。只要累积序列比对分值可以增加，那么字串命中则在两个方向上沿每个序列延伸。字串命中在每个方向上的延伸当遇到下述情况时终止：1)累积序列比对分值从其获得的最大值下降了数量x；2)累积分值为零或零以下，这是由于一个或多个负分值残基比对的累积所致；或者3)到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定所述比对的灵敏度和速度。blast程序使用如下默认值：字长(w)为11，blosum62评分矩阵(参见henikoff等,proc.natl.acad.sci.usa,1992,89,10915-10919，其以引用的方式整体并入本文)比对(b)为50，期望值(e)为10，m＝5，n＝4，以及两条链都比较。blast算法(karlin等,proc.natl.acad.sci.usa,1993,90,5873-5787，其以引用的方式整体并入本文)和gapped blast进行两个序列之间相似性的统计学分析。blast算法提供的一种相似性量度是最小和概率(p(n))，它提供两个核苷酸序列可能偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果一个核酸与另一核酸比较中的最小和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于0.01、并且最优选小于约0.001，则认为该测试核酸与另一核酸相似。
[0024]
如本文所使用的，术语“基因构建体"是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的dna或rna分子。编码序列包括可操作地连接至调控元件(包括能够在核酸分子所施用的个体的细胞内指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。
[0025]
如本文所使用的，术语"可表达的形式"是指含有可操作地连接至编码蛋白质的编
id no:4包含hpv 11e6和e7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。seq id no:4包含位于共有免疫原序列的n-末端处的ige前导序列seq id no:10。ige前导序列是seq id no:10，并且可由seq id no:9编码。
[0036]
在一些实施方案中，疫苗包含seq id no:4或编码seq id no:4的核酸分子。
[0037]
在一些实施方案中，seq id no:3的片段可包含786个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含830个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含856个或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含865个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，seq id no:3的片段如本文所列出的那些片段可进一步包含ige前导序列的编码序列。在一些实施方案中，seq id no:3的片段不包含ige前导序列的编码序列。
[0038]
在一些实施方案中，seq id no:4的片段可包含252个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含266个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含275个或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含278个或更多个氨基酸。
[0039]
seq id no:5包含编码hpv 33e6和e7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。seq id no:5包含连接至seq id no:5的5’末端处的核苷酸序列的ige前导序列seq id no:9。seq id no:6包含hpv 33e6和e7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。seq id no:6包含位于共有免疫原序列的n-末端处的ige前导序列seq id no:10。ige前导序列是seq id no:10，并且可由seq id no:9编码。
[0040]
在一些实施方案中，疫苗包含seq id no:6或编码seq id no:6的核酸分子。
[0041]
在一些实施方案中，seq id no:5的片段可包含746个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含787个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含812个或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含820个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，seq id no:5的片段如本文所列出的那些片段可进一步包含ige前导序列的编码序列。在一些实施方案中，seq id no:5的片段不包含ige前导序列的编码序列。
[0042]
在一些实施方案中，seq id no:6的片段可包含235个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含248个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含256个或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含259个或更多个氨基酸。
[0043]
seq id no:7包含编码hpv 58e6和e7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。seq id no:7包含连接至seq id no:7的5’末端处的核苷酸序列的ige前导序列seq id no:9。seq id no:8包含hpv 58e6和e7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。seq id no:8包含位于共有免疫原序列的n-末端处的ige前导序列seq id no:10。ige前导序列是seq id no:10，并且可由seq id no:9编码。
[0044]
在一些实施方案中，疫苗包含seq id no:8或编码seq id no:8的核酸分子。
[0045]
在一些实施方案中，seq id no:7的片段可包含752个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含794个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含819个或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含827个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，seq id no:7的片段如本文所列出的那些片段可进一步包含ige前导序列的编码序列。在一些实施方案中，seq id no:7的片段不包含ige前导序列的编码序列。
[0046]
在一些实施方案中，seq id no:8的片段可包含235个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含249个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含257个或更多个氨基
酸；并且在一些实施方案中，可包含260个或更多个氨基酸。
[0047]
根据一些实施方案，在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法包括向所述个体施用选自由以下各项组成的组的共有免疫原的氨基酸序列：hpv 6e6和e7、hpv 11e6和e7、hpv 33e6和e7、hpv 58e6和e7、其功能片段、及其可表达的编码序列。一些实施方案包括分离的核酸分子，其编码选自由以下各项组成的组的共有免疫原的氨基酸序列：hpv 6e6和e7、hpv 11e6和e7、hpv 33e6和e7、hpv 58e6和e7、及其片段。一些实施方案包括重组疫苗，其编码选自由以下各项组成的组的共有免疫原的氨基酸序列：hpv 6e6和e7、hpv 11e6和e7、hpv 33e6和e7、hpv 58e6和e7、及其片段。一些实施方案包括亚单位疫苗，其包含选自由以下各项组成的组的共有免疫原的氨基酸序列：hpv 6e6和e7、hpv 11e6和e7、hpv 33e6和e7、hpv 58e6和e7、及其片段。一些实施方案包括活减毒疫苗和/或灭活疫苗，其包含选自由以下各项组成的组的共有免疫原的氨基酸序列：hpv 6e6和e7、hpv 11e6和e7、hpv 33e6和e7、以及hpv 58e6和e7。
[0048]
一方面，本文的疫苗是引发针对主要发现与多种形式的头颈部癌和其它形式的耳鼻喉科疾病有关的hpv亚型的免疫应答的那些疫苗，尤其所述疫苗包含hpv 6e6和e7以及hpv 11e6和e7，并且优选包含两者。
[0049]
另一方面，本文的疫苗是引发针对主要发现与美国之外的患者并且更具体来说亚洲的患者的多种形式的子宫颈癌有关的hpv亚型的免疫应答的那些疫苗，尤其所述疫苗包含hpv 33e6和e7以及hpv 58e6和e7，并且优选包含两者。
[0050]
改进的疫苗包含蛋白质和编码具有使它们作为可用于诱导抗-hpv免疫应答的免疫原特别有效的表位的蛋白质的基因构建体。因此，可提供疫苗以诱导治疗或预防性免疫应答。在一些实施方案中，递送免疫原的方式是dna疫苗、重组疫苗、蛋白质亚单位疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或灭活疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含选自由以下各项组成的组的组合：一种或多种dna疫苗、一种或多种重组疫苗、一种或多种蛋白质亚单位疫苗、一种或多种包含免疫原的组合物、一种或多种减毒疫苗以及一种或多种灭活疫苗。
[0051]
本发明的方面提供在核酸分子如质粒(作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分，作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分)上递送蛋白质的编码序列的方法。
[0052]
根据本发明的一些方面，提供预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。
[0053]
dna疫苗描述于美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055、5,676,594以及本文中引用的优先权申请中，其均以引用的方式并入本文。除了这些申请中所述的递送方案之外，递送dna的替代性方法还描述于美国专利号4,945,050和5,036,006中，其都以引用的方式并入本文。
[0054]
本发明涉及改进的减毒活疫苗、改进的灭活疫苗、和改进的使用重组载体以递送编码抗原的外源基因的疫苗、以及亚单位疫苗和糖蛋白疫苗。减毒活疫苗、使用重组载体以递送外源抗原的那些疫苗、亚单位疫苗以及糖蛋白疫苗的实例描述于美国专利号：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,3 64；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319以及6,589,529中，其均以引用的方式并入本文。
csf、g-csf、il-4、il-18的突变形式、cd40、cd40l、血管生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、半胱天冬酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、无活性nik、sap k、sap-1、jnk、干扰素应答基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rank ligand、ox40、ox40 ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2及其功能片段。
[0063]
可添加另外的元件，如果出于任何原因希望消除接受基因构建体的细胞，则所述元件充当用于细胞破坏的靶。可表达形式的疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因可包含在基因构建体中。药物更昔洛韦可施用至个体并且所述药物将引起任何产生tk的细胞的选择性杀死，由此提供选择性破坏具有基因构建体的细胞的方式。
[0064]
为了最大化蛋白质制备，可选择调控序列，所述调控序列非常适用于构建体所施用的细胞中的基因表达。而且，可选择在细胞中最高效地转录的密码子。本领域技术人员可制备在细胞中具有功能的dna构建体。
[0065]
在一些实施方案中，可提供基因构建体，其中本文所述的蛋白质的编码序列连接至ige信号肽。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质连接至ige信号肽。
[0066]
在使用蛋白质的一些实施方案中，例如使用熟知的技术，本领域技术人员可使用熟知的技术来制备和分离本发明的蛋白质。在使用蛋白质的一些实施方案中，例如，本领域技术人员可使用熟知的技术来将编码本发明的蛋白质的dna分子插入在熟知表达系统中使用的市售表达载体中。例如，市售质粒pse420(invitrogen,san diego,calif.)可用于在大肠杆菌中制造蛋白质。市售质粒pyes2(invitrogen,san diego,calif.)可例如用于在酵母的酿酒酵母菌株中的制备。市售maxbac
tm
完整杆状病毒表达系统(invitrogen,san diego,calif.)可例如用于在昆虫细胞中的制备。市售质粒pcdna i或pcdna3(invitrogen,san diego,calif.)可例如用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞中的制备。本领域技术人员可使用这些商业表达载体和系统或其它载体和系统来通过常规技术和可容易获得的起始材料制备蛋白质。(例如参见sambrook等,molecular cloning a laboratory manual,第二版cold spring harbor press(1989)，其以引用的方式并入本文)。因此，所需蛋白质可在原核和真核系统中制备，从而产生一系列加工形式的蛋白质。
[0067]
本领域技术人员可使用其它市售表达载体和系统或使用熟知方法和可容易获得的起始材料来制备载体。含有需要的控制序列(如启动子和聚腺苷酸化信号、并且优选增强子)的表达系统对于多种宿主来说是容易获得的和本领域已知的。例如参见sambrook等,molecular cloning a laboratory manual,第二版cold spring harbor press(1989)。基因构建体包括可操作地连接至启动子的蛋白质编码序列，所述启动子在构建体所转染的细胞系中具有功能。组成型启动子的实例包括来自巨细胞病毒或sv40的启动子。可诱导启动子的实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白启动子。本领域技术人员可由可容易获得的起始材料容易地制备适用于使用编码本发明的蛋白质的dna转染细胞的基因构建体。使用包含编码蛋白质的dna的表达载体来转化相容性宿主，然后培养所述宿主并保持在其中发生外源dna表达的条件下。
[0068]
制备的蛋白质通过使细胞裂解来从培养物中回收或者从对于本领域技术人员来
说适当和已知的培养基中回收。本领域技术人员可使用熟知技术分离使用这类表达系统制备的蛋白质。使用如上所述特异性结合特定的蛋白质的抗体从天然来源纯化蛋白质的方法可同样应用于通过重组dna方法制备的蛋白质的纯化。
[0069]
除了通过重组技术来制备蛋白质，还可以使用自动肽合成器来制备分离的基本上纯的蛋白质。这类技术是本领域技术人员熟知的，并且适用于具有dna-编码的蛋白质制备中未提供的取代的衍生物。
[0070]
核酸分子可使用若干种熟知的技术中的任一种来递送，所述技术包括dna注射(也称为dna疫苗接种)、重组载体，如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。
[0071]
施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、透皮、通过吸入或栓剂施用、或对粘膜组织施用，如通过灌洗阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织施用。优选的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建体可通过这样的方式来施用，所述方式包括但不限于电穿孔方法和装置、传统注射器、无针注射装置或"微弹轰击基因枪法"。
[0072]
优选用于促进dna疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括下列专利中描述者：美国专利号7,245,963(draghia-akli等)、美国专利公布2005/0052630(由smith等递交)，其全部内容以引用的方式并入本文。还优选的是，于共同待决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的用于促进dna疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法，所述美国专利申请提交于2007年10月17日，并且在35usc 119(e)下要求下列申请的优先权：2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982，其均以引用的方式整体并入本文。
[0073]
以下是使用电穿孔技术的实施方案的实例，并且在上述专利参考文献中更详细地讨论：电穿孔装置可被配置为递送产生类似于用户输入的预设电流的恒定电流的能量脉冲至哺乳动物的期望组织。电穿孔装置包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可包括且并有电穿孔装置的多种元件中的一种或多种，包括：控制器、电流波形产生器、阻抗试验器、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆部件、电源和电源开关。电穿孔部件可充当电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与所述电穿孔部件通信的单独元件(或部件)。在一些实施方案中，电穿孔部件可充当电穿孔装置的多于一个元件，其可与电穿孔装置的独立于所述电穿孔部件的其它元件通信。使用电穿孔技术递送改进的hpv疫苗不受到现存作为一个机电或机械装置的部分的电穿孔装置的元件的限制，因为所述元件可充当与彼此通信的一个装置或单独元件。电穿孔部件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件包括在空间布置中具有多个电极的电极阵列，其中电极组件从电穿孔部件接收能量脉冲，并且通过电极将所述能量脉冲递送至期望组织。多个电极中的至少一个在能量脉冲的过程中是中性的，并且测量期望组织中的电阻和将电阻通知电穿孔部件。反馈机制可接收所测量到的电阻，并且可调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒定电流。
[0074]
在一些实施方案中，多个电极可以分散型式来递送能量脉冲。在一些实施方案中，多个电极可以分散型式通过控制电极在编程序列下递送能量脉冲，并且编程序列由用户输入至电穿孔部件。在一些实施方案中，编程序列包含依序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的各脉冲通过至少两个有效电极(其中有一个中性电极测量电阻)来递送，并且其中多个脉
冲的后续脉冲通过至少两个有效电极(其中有一个中性电极测量电阻)中的不同的那个来递送。
[0075]
在一些实施方案中，反馈机制通过硬件或软件来执行。优选地，反馈机制通过模拟闭环电路来执行。优选地，该反馈每隔50μs、20μs、10μs或1μs发生，但优选是实时反馈或瞬时的(即，如通过用于测定应答时间的可用技术所测定，其基本上是瞬时的)。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的电阻并将电阻通知反馈机制，并且反馈机制回应于电阻并调整能量脉冲以使恒定电流维持在类似于预设电流的数值下。在一些实施方案中，反馈机制在能量脉冲递送的过程中连续和瞬时地维持恒定电流。
[0076]
在一些实施方案中，核酸分子是结合多核苷酸功能增强子或基因疫苗促进剂的施用而递送至细胞。多核苷酸功能增强子描述于美国序列号5,593,972、5,962,428和1994年1月26日提交的国际申请序列号pct/us94/00899，其均以引用的方式并入本文。基因疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国序列号021,579中，其以引用的方式并入本文。结合核酸分子施用的辅剂可作为与核酸分子的混合物来施用，或者在核酸分子施用的同时、之前或之后单独施用。另外，可用作转染剂和/或复制剂和/或炎症剂并且可与gvf共同施用的其它药剂包括：生长因子、细胞因子和淋巴因子，如a-干扰素、γ-干扰素、gm-csf、血小板源生长因子(pdgf)、tnf、表皮生长因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-6、il-10、il-12和il-15以及成纤维细胞生长因子、表面活性剂如免疫刺激性复合物(iscoms)、弗氏不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰基脂质a(wl))、胞壁肽、醌类似物和囊泡如三十碳六烯和角鲨烯，并且透明质酸也可与基因构建体结合而使用施用。在一些实施方案中，免疫调节蛋白可用作gvf。在一些实施方案中，联合提供核酸分子与plg以增强递送/摄取。
[0077]
根据本发明的药物组合物包含约1纳克至约2000微克dna。在一些优选实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约10纳克至约800微克dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克dna。
[0078]
根据本发明的药物组合物根据所使用的施用方式来进行配制。在药物组合物是可注射的药物组合物的情况下，它们是无菌、无热原质和无颗粒的。优选使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂添加至制剂中。
[0079]
根据本发明的一些实施方案，提供诱导免疫应答的方法。疫苗可以是基于蛋白质的、活减毒疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或dna疫苗。在一些实施方案中，在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法(包括诱导粘膜免疫应答的方法)包括向个体施用下列中的一种或多种：ctack蛋白、teck蛋白、mec蛋白及其功能片段、或其可表达的编码序列，与编码本发明的蛋白质的分离的核酸分子、和/或编码本发明的蛋白质的重组疫苗、和/或包含本发明的蛋白质的亚单位疫苗、和/或活减毒疫苗和/或灭活疫苗的组合。ctack蛋白、teck蛋白、mec蛋白及其功能片段中的一种或多种可在下列物质施用之前、同时或之后施用：编码免疫原的分离的核酸分子、和/或编码免疫原的重组疫苗、和/或包含免疫原的亚单位疫苗、
440)。合成编码6或11型hpv共有e6/e7融合蛋白(6e6e7或11e6e7)的融合基因并进行序列验证。合成的6e6e7或11e6e7用bamhi和xhoi消化，克隆至表达载体pvax(invitrogen)中受巨细胞病毒即刻早期启动子控制，并且将这些构建体称为p6e6e7或p11e6e7。
[0090]
293-t细胞在6孔板中培养，并且使用fugene6转染试剂(roche applied science,indianapolis,in)用pvax、p6e6e7或p11e6e7转染。转染之后两天，使用改良的ripa细胞裂解缓冲液使细胞裂解并且收集细胞裂解物。使用抗-ha单克隆抗体进行蛋白质印迹分析(sigma-aldrich,st.louis,mo)并且使用ecltm蛋白质印迹分析系统(amersham,piscataway,nj)使用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-小鼠igg(sigma-aldrich,st louis,mo)进行观测。
[0091]
使用人横纹肌肉瘤细胞(rd细胞)进行间接免疫荧光测定以验证p6e6e7和p11e6e7的表达。在室玻片中培养的rd细胞使用turbofectin 8.0(origene,rockville,md)用pvax、p6e6e7或p11e6e7转染。然后，细胞用pfa固定并用0.1％triton-x的pbs溶液进行渗透。用一级抗体和二级抗体对细胞进行1-2小时的孵育，另外在孵育之间用补充有甘氨酸和bsa的pbs洗涤。所使用的一级抗体和二级抗体分别是单克隆小鼠抗-ha(sigma-aldrich,st.louis,mo)和fitc-偶联的抗小鼠igg(abcam,cambridge,ma)。还进行hoechst染色以鉴定细胞核并定位rd细胞。在完成全部孵育之后，将细胞置于装有fluoromount-g(southern biotech,birmingham,al)的载玻片上。样品用共聚焦显微镜(cdb microscopy core,university of pennsylvania cell and developmental biology,philadelphia,pa)观察并成像。
[0092]
实施例2
[0093]
小鼠和处理组疫苗接种
[0094]
在此实验中使用6至8周龄之间的c57bl/6雌性小鼠。小鼠是从杰克逊实验室(bar harbor,me)获得。小鼠由宾夕法尼亚大学(philadelphia,pa)的university laboratory animal resources在遵守国立卫生研究院和宾夕法尼亚大学实验动物管理和使用委员会(iacuc)的政策下圈养和维持。将用于这些实验的小鼠分成四组用于免疫。小鼠用p6e6e7、p11e6e7或这两种构建体进行免疫并且pvax组用作阴性对照。
[0095]
dna疫苗接种和电穿孔
[0096]
每个小鼠以14天的间隔接受三个剂量的20μg各dna质粒。接受p6e6e7和p11e6e7两者的组中的小鼠接受20μg的两种质粒，每次疫苗接种共计40μg dna。dna构建体经由肌内注射右四头肌来施用，随后通过cellectra
tm
电穿孔仪(inovio pharmaceuticals,blue bell,pa)产生方波脉冲。电穿孔仪被配置用来在0.2amps下以52ms/脉冲、间隔1秒延迟递送两个电脉冲。如先前所述进行电穿孔程序[12、13]。
[0097]
ifn-γelispot测定
[0098]
处理组和对照组的小鼠都在第三次免疫1周后处死。从每个小鼠收集脾脏并将其转移至具有10％fbs和抗生素的rpmi-1640培养基(r10)中。使用均质袋(stomacher)(seward laboratory systems,bohemia,ny)将脾脏粉碎并随后转移通过细胞滤网并悬浮在ack裂解缓冲液中。在去除红细胞之后，分离脾细胞并悬浮于r10培养基中。高蛋白ip 96孔multiscreen
tm
板(millipore,bedford,ma)用单克隆小鼠ifn-γ捕捉抗体(r&d systems,minneapolis,mn)预涂覆并在4℃下孵育过夜。在用1x pbs洗涤三次之后，在环境温度下将
板用1％bsa和5％蔗糖的1
×
pbs溶液阻断2小时。对r10培养基中的分离的脾细胞进行计数并且以每孔2
×
105个细胞一式三份地添加至孔中。涵盖hpv6和hpv11的共有e6/e7序列的两组肽在dmso(genscript usa,piscataway,nj)中复原。所述肽包含15个氨基酸的序列，其中8个残基与每个连续肽重叠。将hpv6和hpv11肽以在dmso中2μg/ml的浓度各自分成两个池—一个池是e6且另一个池是e7。保留用于阳性对照和阴性对照的孔分别接收刀豆素a(concavalin a)(sigma-aldrich,st.louis,mo)和r10培养基代替肽。随后将板放置在5％co2氛围孵育器中。在37℃下孵育24小时之后，用1
×
pbs洗涤孔。将生物素化的抗小鼠ifn-γ检测抗体(r&d systems,minneapolis,mn)添加至每个孔中并且接着在4℃下孵育过夜。随后洗涤板并按照r&d systems提供的显色方案使用抗生蛋白链菌素-ap和bcip/nbt plus(r&d systems,minneapolis,mn)进行处理。将孔风干过夜，并且通过装有和软件的elispot板读取系统(cellular technology ltd.,shaker heights,oh)对孔内的斑点进行扫描并计数。使用算法转换所报告的斑点形成细胞计数以表示每1
×
106个脾细胞的斑点形成单位。
[0099]
考虑到ifn-γelispot测定的灵敏度和说明t细胞活性的能力，使用它们来测定响应于hpv 6或11e6和e7肽刺激的抗原特异性ifn-γ分泌细胞的数目。
[0100]
如图3中的a和图3中的b所示，接种p6e6e7的小鼠的sfu/106脾细胞的平均数是1442.8，而接种p11e6e7的小鼠的sfu/106的平均数是2845，这都显著大于阴性对照组。因此，p6e6e7和p11e6e7都对在小鼠中引发稳固的类型特异性e6和e7特异性免疫应答有效。
[0101]
有趣的是，接种p6e6e7或p11e6e7也诱导交叉反应性细胞免疫应答。在p11e6e7免疫的小鼠中针对hpv 6e6/e7肽的sfu/106个脾细胞的加和频率是552.8sfu/106个脾细胞，而p6e6e7免疫的小鼠中的hpv 11e6/e7特异性免疫应答是888.3sfu/106个脾细胞。hpv 6或11的e6蛋白共享约80％的同一性，而hpv 6或11的e7蛋白共享约84％的同一性。在hpv 6或11e6和e7抗原之间可能存在一些共享的免疫表位。从ifn-γelispot测定中观察到的交叉反应性表明在hpv 6和11e6和e7抗原之间存在共享的免疫表位。
[0102]
也使来自接受p6e6e7和p11e6e7两者的小鼠(组合组)的脾细胞经受以上elispot测定，以便检验当一起接种这两种构建体时是否存在任何免疫干扰(图3中的a和图3中的b)。组合组针对hpv6 e6和e7肽展现出平均1670sfu/106个脾细胞(σ＝55.7，p《0.001)。同一组的脾细胞针对hpv11 e6和e7肽产生2010sfu/106个脾细胞(σ＝247.8，p＝0.002)。数据表明并行接种所述两种构建体可针对hpv6和hpv11引发统计上显著的e6和e7特异性细胞应答，并且这些应答互不干扰。
[0103]
表位作图
[0104]
进行表位作图研究以确定肽池内的优势表位，以便确定e6/e7共有抗原内的免疫优势肽(图4中的a和图4中的b)。所述研究与先前提及的ifn-γelispot测定类似进行。使用个别的肽而非池来刺激脾细胞。
[0105]
用于此单肽分析中的每个肽代表hpv6或hpv11的e6和e7抗原的部分重叠的片段。作图数据表明肽7(taeiysyaykqlkvl)seq id no:11是hpv6 e6和e7免疫原的优势表位(图4中的a)。taeiysyaykqlkvl seq id no:11包含8、9、10-mer氨基酸表位，所述表位经nih bimas提供的hla-结合预测软件验证是h2-kb限制型表位。为了进一步描述hpv11 e6和e7特异性t细胞免疫应答(图4中的b)。还用hpv11 e6和e7的重叠片段进行了肽分析。肽作图显示
hpv 11e6和e7抗原的优势表位是肽7(taeiyayayknlkvv)seq id no:12和27(hcyeqledssedevd)seq id no:13。与hpv6表位作图测定中的肽7一样，bimas hla-结合预测软件确定taeiyayayknlkvv seq id no:12是h2-kb限制型表位。另一个hla-结合肽数据库，由nih niaid提供的免疫表位数据库和分析资源(immune epitope database and analysis resource)确定hcyeqledssedevd seq id no:13是h2-kb限制型表位。通过此表位作图研究鉴定了三种免疫亚优势肽：第6号(fcknalttaeiysya)seq id no:14、第9号(lfrggypyaacaccl)seq id no:15以及第13号(yagyattveeetkqd)seq id no:16。
[0106]
细胞内细胞因子染色
[0107]
根据ifn-γelispot测定所描绘的高免疫应答，进行细胞内细胞因子染色测定以提供对p6e6e7和p11e6e7所诱导的细胞应答的更全面的概观。自疫苗接种小鼠组和未处理小鼠组分离脾细胞并在37℃下5％co2环境中用涵盖hpv6和hpv11的e6和e7区域的肽刺激4小时。通过将细胞分别放置在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)和r10细胞培养基中在测定中使用阳性和阴性对照。在孵育之后，细胞首先用vivid染料(invitrogen,carlsbad,ca)染色以区分活细胞和死细胞，接着所有的细胞用下列表面标记抗体染色：apc-cy7仓鼠抗小鼠cd3e、percp-cy5.5大鼠抗小鼠cd4和apc大鼠抗小鼠cd8a(bd biosciences,san diego,ca)。细胞随后使用cytofix/cytoperm试剂盒(bd biosciences,san diego,ca)固定。在按照制造商方案固定之后，细胞用下列细胞内标记抗体染色：alexa fluor 700大鼠抗小鼠ifn-γ、pe-cy7大鼠抗小鼠tnf克隆和pe大鼠抗小鼠il-2(bd biosciences,san diego,ca)。染色之后，细胞用含2％多聚甲醛的pbs溶液固定。制备的细胞使用装有bd facsdiva软件的lsr ii流式细胞仪(bd biosciences,san jose,ca)来获取。所获取的数据使用最新版本的flowjo软件(tree star,ashland,or)进行分析。使用下列门序列来分离cd4 和cd8 事件：来自fsc-a对fsc-h的单线态、来自fsc-a对ssc-a的所有脾细胞、来自vivid染料(pacific blue)对ssc-a的活细胞、来自cd3(apc-cy7)对ssc-a的cd3 细胞以及来自cd4(percp-cy5.5：阳性
–
cd4 ，阴性
–
cd8 )对ssc-a的cd4 或cd8 。后两个群体分别针对alexa fluor 700、pe-cy7和pe进行门控以观察il-2、ifn-γ和tnf-α产生的变化。
[0108]
对细胞进行门控以使得细胞内细胞因子染色数据可通过cd4 和cd8 细胞应答进行区分。当用hpv6 e6和e7特异性肽刺激时，接种p6e6e7的小鼠分别展现出0.163％(σ＝0.09)、0.003％(σ＝0.07)和0.188％(σ＝0.20)的产生ifn-γ、tnf-α和il-2的总cd4 细胞的平均值(图5中的a)。同一组的小鼠分别具有3.323％(σ＝1.39)、0.838％(σ＝0.32)和1.172％(σ＝1.81)的产生ifn-γ、tnf-α和il-2的总cd8 细胞的平均值。在用hpv11 e6和e7抗原孵育之后使用接种p11e6e7的小鼠的脾细胞收集相同的细胞内细胞因子数据(图5中的b)。在p11e6e7接种小鼠的所有cd4 细胞当中，平均为0.051％(σ＝0.04)产生ifn-γ、0.068％(σ＝0.09)产生tnf-α，并且0.026％(σ＝0.037)产生il-2。另外，在p11e6e7接种小鼠的所有cd8 细胞当中，产生ifn-γ、tnf-α和il-2的平均值分别为4.52％(σ＝2.53)、2.08％(σ＝1.56)和0.21％(σ＝0.22)。除了少数组之外，处理组与它们相应未处理组相比，产生细胞因子的细胞的百分比具有统计学显著性，置信水平为89％或更高。观察了cd4 细胞与cd8 t细胞的细胞因子产生的量值的比较，可得到结论：由p6e6e7和p11e6e7引发的免疫应答高度趋向于驱动cd8 淋巴细胞，所述免疫应答在所有模型中与它们的细胞清除率相关联。
[0109]
统计分析
[0110]
进行学生t检验以分析此研究中所产生的所有定量数据的统计学显著性。除非另外指出，否则p值被计算来确定不同置信水平下的统计学显著性。
[0111]
此研究已显示出有力的证据证明dna疫苗能够实现在使用其它流行且传统的疫苗平台的实验中发现的免疫原性水平。在其它类似的e6和e7特异性hpv dna疫苗研究中测量的高水平的细胞应答与表明预防性和治疗性抗瘤功效的数据相关联。大多数hpv相关性研究和疾病挑战模型聚焦于子宫颈癌。考虑到hpv6和hpv11不像其它hpv血清型那样与子宫颈癌相关，p6e6e7和p11e6e7的治疗功效不能完全使用常规hpv疾病挑战模型来评估。可预见在可获得适当的疾病挑战模型时确定p6e6e7和p11e6e7的保护和治疗潜力。因此，人们只能够通过观察由elispot测定和细胞内细胞因子染色定量的ifn-γ和细胞因子产生的高水平来推断p6e6e7和p11e6e7的免疫原性功效。然而，发现这类水平的量值明显较高并且显示出两种构建体将引发高水平的细胞免疫应答的前景。由于hpv相关性恶性肿瘤通常继发于多种血清型的并发感染，所以急需进一步研究组合靶向不同病毒血清型的疫苗的可行性。保证研究t细胞动力学和疫苗竞争的未来研究进一步表征两种质粒的并行疫苗接种的效果。
[0112]
细胞内细胞因子染色显示接种p6e6e7和p11e6e7能够引发显著百分比的产生ifn-γ、tnf-α和il-2的t细胞。鉴于ifn-γ当前已知的在免疫系统中的功能，在历史上ifn-γ已被用作细胞免疫应答的指标。这些重要作用中的一些包括调节和刺激先天性和适应性免疫的能力。此外，广泛公认原则上ifn-γ的产生者是t细胞，使得ifn-γ产生成为测量给定疫苗抗原暴露后的细胞免疫原性的可接受的模式。tnf-α是免疫系统的调控中所涉及的另一种细胞因子。tnf-α已知的诱导细胞凋亡和调控肿瘤增殖的能力使其成为在表征疫苗接种后免疫应答时重要的考虑参数。考虑到hpv6和hpv11的潜在肿瘤增殖特性，tnf-α产生可能更受到关注。il-2是另一种信号传导分子，已观察到它在t细胞在免疫系统中的增殖和分化中起到中枢作用。结果是，il-2经常与其它细胞因子一起检查以获得对特定免疫应答的量值和品质的进一步的总体认识。鉴于上文，接种p6e6e7之后产生ifn-γ、tnf-α和il-2的cd4 和cd8 细胞的显著百分比表明疫苗成功诱导有效的免疫应答。除分泌il-2的cd4 细胞之外，相同趋势适用于从接种p11e6e7的小鼠中分离的细胞。此外，值得注意的是，观察到cd8 细胞在疫苗接种小鼠中驱动强烈的免疫应答，这是在评估两种质粒的抗瘤功效中重要的特征。