绵羊血液基因组DNA的提取方法及其应用、绵羊资源群体的遗传多样性评价方法与流程

绵羊血液基因组dna的提取方法及其应用、绵羊资源群体的遗传多样性评价方法
1.本技术是申请日为2018年04月23日、申请号为201810366963.1、发明名称为《绵羊资源群体的遗传多样性评价方法》的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及遗传多样性评价方法领域，尤其是绵羊血液基因组dna的提取方法及其应用、绵羊资源群体的遗传多样性评价方法。


背景技术：

3.生物多样性(biodiversity)是指地球上所有生物(动物、植物、微生物等)、它们所包含的基因以及由这些生物与环境相互作用所构成的生态系统的多样化程度，包括物种多样性、遗传多样性和生态系统多样性。遗传多样性可以表现在多个层次上，如分子、细胞、个体等。在生物的长期演化过程中，遗传物质的改变(或突变)是产生遗传多样性的根本原因，即染色体数目和结构的变化及基因位点内部的核苷酸的变化，在表型上表现出各种各样的形态。遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，种内个体间的差异是因生活环境的差异和经历长时间的选择、突变的结果，如果遗传多样性越高，则种群内可提供环境选择的基因就越多，对于环境的适应能力就越强，有利于种群的生存和演化。
4.绵羊(ovis aries)的资源群体是在一定的地域、环境和生态区域内，经过长期的自然选择和人民群众的人工选择而逐步形成的具有一定生物学特性的群体。遗传标记常用于对动植物群体的遗传多样性评价，形态标记是最早使用的一种标记，能够用肉眼识别显示出来的遗传多样性的外观特征，如绵羊的体高、体长、毛色等，早期的绵羊育种曾利用角的有无、被毛颜色等作为选择的依据，但由于形态标记数量少，受环境、生理时期的影响较大，在实际应用中受到很大的限制。细胞学标记是采用染色体的结构和数量特征来显示遗传多态性，如染色体的核型、带型以及数目等，随着分子水平的发展和深入，逐渐取代了细胞学标记。蛋白质标记有酶蛋白质和非酶蛋白质两种，常用的有血红蛋白多态性、运铁蛋白多态性等，一般根据标记与表型的相关性，为选择提供依据。与形态学标记和细胞学标记相比，蛋白质标记数量更丰富，受环境影响较小，能更好地反映遗传多态性，但其最大的不足是数量比较有限，不能满足进一步的精确研究的需要，同时，也被反映基因组水平的dna分子标记所取代。
5.dna分子标记问世以来，已发展了rflp、rapd、aflp、ssr和snp等10多种标记。ssr标记是一种具有高度多态性、丰富性、中性和共显性等特性的理想标记，常用于动植物资源群体的遗传多样性的评价。一些研究者将微卫星标记用于绵羊群体的遗传多样性分析与评价，他们较多地应用分布于绵羊1条染色体，几条染色体或10多条染色体上的几个或10多个微卫星标记进行群体的遗传多样性分析，表现出我国绵羊绵羊群体具有丰富的遗传多样性。
6.综上所述，现有技术存在的问题是：1)形态学标记、细胞学标记、蛋白质标记等标
记因其数量有限，不能全面反映群体的遗传多样性而被dna分子技术所更替；2)微卫星标记用于群体遗传多样性的分析与评价，一般采用分布于1条染色体或几条染色体上的几个微卫星或10多个微卫星标记来进行分析，较少的研究者采用超过20个微卫星标记，但又不能覆盖到每一条染色体上，未能从全基因组全面地评价群体的遗传多样性。3)snp标记用于群体遗传多样性分析，一般采用单个基因的snp位点来进行群体的遗传多样性分析，不足之处在于一次性分析的位点较少，每一个位点的等位基因仅有2个；另一方面，采用高通量技术扫描全基因组snp位点，用于群体的遗传多样性分析的位点多，但成本贵。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是：为了解决现有的评价方法的覆盖率较低或是成本较高的不足，本发明提供了绵羊血液基因组dna的提取方法及其应用、绵羊资源群体的遗传多样性评价方法，通过选择分布于绵羊26对常染色体和x性染色体上的30个微卫星标记，采用毛细管电泳测序技术进行等位基因分型，全面而系统地分析绵羊资源群体的遗传多样性，进而进行群体的遗传多样性评价，为资源群体的开发与利用提供分子水平的理论依据，提高了评价的全面性，并节约了成本。
8.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
9.一种提取绵羊血液基因组dna的方法，包括以下步骤：
10.1)取绵羊血液200μl，加入到1.5ml的ep管中，加入20μl的蛋白酶k溶液后混匀，再加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃水浴锅中放置10min；
11.2)取出ep管，再加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，将所得溶液转移至吸附柱cb3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，向吸附柱cb3加入500μl的gd，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液；
12.3)向吸附柱cb3加入600μl的漂洗液pw，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，重复一次向吸附柱cb3中加600μl的漂洗液pw、离心及倒掉废液；
13.4)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温数分钟，再转入一个新的ep管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液te，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，ep管中的液体即为提取的dna溶液，进行凝胶电泳检测后置于-20℃环境下保存备用。
14.本发明还提供了上述方法得到的绵羊血液基因组dna在评价绵羊资源群体的遗传多样性中的应用。
15.本发明还提供了一种绵羊资源群体的遗传多样性评价方法，包括以下步骤：
16.采集绵羊的血液样品；
17.利用上述方法提取血液样品的基因组dna；
18.在微卫星标记数据库中筛选30对微卫星标记引物，分布于绵羊26对常染色体和x性染色体，并通过ncbi数据库验证引物序列，微卫星标记采用5-rox、5'6-fam(fitc)、5-tamra和5-hex进行荧光标记；
19.pcr扩增及微卫星标记的等位基因分型；
20.统计分析及资源群体的遗传多样性评价，采用软件分析微卫星标记的杂合度和多态信息含量，按照衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，即pic》0.50的标记为高度
多态信息位点，pic《0.25的标记为低度多态信息位点，0.25＜p＜0.50的标记为中度多态信息位点，绵羊群体30个微卫星标记的遗传多态信息含量为0.3338～0.8660，其中7个标记为中度多态信息位点，23个标记为高度多态信息位点，群体的平均多态信息含量为0.6257，来表明绵羊资源群体具有丰富的遗传多态性。
21.优选的，所述采集步骤为：采用颈静脉采布拖黑绵羊的血3～4ml，注入加有抗凝剂肝素钠的一次性真空采血管中，随后将采血管180
°
颠倒混匀5-6次，置于低温保存箱中运输，带回实验室-20
°
保存备用。
22.优选的，所述pcr扩增及等位基因分型的步骤为：使用试剂盒，25μl反应体系：2
×
taqpcrmastermix 12.5μl，上、下游引物10mmol/l各1μl，dna模板1μl，用超纯水补充至25μl，94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃-63℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸8min，扩增产物8℃保存。
23.优选的，所述软件为cervus3.0软件。
24.本发明的有益效果是：本发明提供了一种绵羊资源群体的遗传多样性评价方法，通过选择分布于绵羊26对常染色体和x性染色体上的30个微卫星标记，采用毛细管电泳测序技术进行等位基因分型，全面而系统地分析绵羊资源群体的遗传多样性，进而进行群体的遗传多样性评价，为资源群体的开发与利用提供分子水平的理论依据，提高了评价的全面性，并节约了成本。
具体实施方式
25.1)血液样品采集
26.以凉山彝族自治州布拖县的布拖黑绵羊为试验材料，采用颈静脉采血3～4ml，注入加有抗凝剂肝素钠的一次性真空采血管中，随后将采血管180
°
颠倒混匀5-6次，置于低温保存箱中运输，带回实验室-20
°
长期保存备用。
27.2)dna提取
28.dna提取采用天根生化科技(北京)有限公司生产的tiannamp genomic dnakit试剂盒，步骤如下：1)取血样200μl，加入到1.5ml的ep管中，加入20μl的蛋白酶k溶液，混匀，再加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃水浴锅中放置10min；2)取出ep管，再加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，将所得溶液转移至吸附柱cb3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，向吸附柱cb3加入500μl的gd，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液；3)向吸附柱cb3加入600μl的漂洗液pw，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，重复一次向吸附柱cb3中加600μl的漂洗液pw、离心及倒掉废液；4)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温数分钟，再转入一个新的ep管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液te，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，ep管中的液体即为提取的dna溶液，进行凝胶电泳检测，并-20℃保存备用。
29.3)微卫星标记引物及合成
30.从联合国粮农组织(fao)和国际动物遗传学会(isag)联合推荐的引物及美国肉畜中心(usda-marc)微卫星标记数据库中筛选30对微卫星标记引物，分布于绵羊26对常染色体和x性染色体，并通过ncbi数据库验证引物序列。微卫星标记采用5-rox、5'6-fam(fitc)、5-tamra和5-hex进行荧光标记，微卫星标记的引物、退火温度及荧光类型信息见表1。引物
合成及荧光标记均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
31.表1 30个绵羊微卫星标记信息
32.33.34.[0035][0036]
4)pcr扩增及等位基因分型
[0037]
pcr扩增使用天根生化科技(北京)有限公司生产的2
×
taq pcr mastermix试剂盒，25μl反应体系：2
×
taqpcr mastermix 12.5μl，上、下游引物(10mmol/l)各1μl，dna模板1μl，用超纯水补充至25μl。pcr扩增反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃-63℃退火30s(因标记而已)，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸8min，扩增产物8℃保存。pcr扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司，进行微卫星标记等位基因的毛细管电泳分型。
[0038]
5)统计分析及资源群体的遗传多样性评价
[0039]
采用cervus3.0软件分析微卫星标记的杂合度和多态信息含量(pic)，结果见表2所示。多态信息含量是群体内遗传变异的量度指标，可用来描述微卫星位点的变异程度，按照botstein等在1980年就提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，即pic》0.50的标记为高度多态信息位点，pic《0.25的标记为低度多态信息位点，0.25＜p＜0.50的标记为中度多态信息位点。布拖黑绵羊群体30个微卫星标记的遗传多态信息含量为0.3338～0.8660，其中，7个标记为中度多态信息位点，23个标记为高度多态信息位点，群体的平均多态信息含量为0.6257，表明布拖黑绵羊资源群体具有丰富的遗传多态性。
[0040]
表2布拖黑绵羊的多态信息含量
[0041]
[0042][0043]
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。