以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用与流程

以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及新型冠状病毒疫苗技术领域，具体涉及以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒在全球引发了严重的新型冠状病毒肺炎疫情，并于2020年3月被宣布为大流行。根据世界卫生组织(who)数据显示，截止到2021年10月，全球超过200多个国家已经报道了235,673,032例确诊病例，其中包括4,814,651例死亡病例。
3.新型冠状病毒(sars-cov-2)是引起新型冠状病毒肺炎的主要病原体，与另外两种感染人的冠状病毒sars-cov、mers-cov同属冠状病毒科，β冠状病毒属。新型冠状病毒是一种包膜的、正向、单链rna病毒，基因组为29903nts，由核衣壳蛋白(n)、膜蛋白(m)、包膜蛋白(e)以及刺突蛋白(s)组成的外膜包覆着。与sars-cov一样，新型冠状病毒的s蛋白通过受体结合结构域(rbd)与它们共同的受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合，介导病毒进入宿主细胞。在感染过程中，s蛋白被宿主蛋白酶(比如tmprss2)切割成n端的s1亚基和c端的s2亚基，并从融合前状态转变为融合后状态。s蛋白是一种i型融合蛋白，在病毒粒子表面形成三聚体，s蛋白包含两个功能性亚基s1和s2，s1和s2由胞外结构域(ecd)和单个跨膜螺旋组成，分别介导受体结合和膜融合。其中s1负责与宿主细胞受体结合，s2亚基负责病毒膜和细胞膜融合。s1由n端结构域(ntd)和受体结合结构域(rbd)组成，对决定组织嗜性和宿主范围至关重要。s蛋白不但决定病毒的传染性及其在宿主中的传播性，也是诱导保护性免疫反应的主要抗原。因此，目前所有正在开发的疫苗主要都以rbd作为靶点。
4.当新型冠状病毒的基因序列在2020年1月初被公布以后，针对其疫苗的研发就开始了，并以前所未有的速度发展。目前已有200多种疫苗处于不同的研发阶段，疫苗种类主要可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗、mrna疫苗和病毒载体疫苗。介于疫情的严重性，who相继将辉瑞-biontech、阿斯利康、强生疫苗、modenra疫苗和国药灭活疫苗列入紧急使用清单。在中和抗体方面，灭活疫苗处于低端，chadox1和mrna候选疫苗处于中等范围，重组蛋白疫苗候选疫苗处于高端，产生的中和抗体滴度最高。在耐受性方面，灭活疫苗和重组蛋白疫苗表现相对较好，其次是mrna疫苗和腺病毒载体疫苗，在第二次免疫接种后显示出更高的免疫原性。在实用性方面，mrna疫苗存在成本造价高、运输及储存困难等问题。
5.迄今为止，针对新型冠状病毒还没有有效的治疗方法，新型冠状病毒疫苗仍然是防控病毒的有效手段。现阶段新型冠状病毒疫苗临床数据表明其具有安全性和有效性，但仍然不能满足应对新型冠状肺炎疫情的要求。因此，迫切需要研制一种更加安全有效的新型冠状病毒疫苗。
6.a型流感病毒(influenzaavirus，iav)宿主广泛，但是b型流感病毒(ibv)主要在人群中流行，也有海豹感染的报道。与a型流感病毒一样，b型流感病毒也不断地经历抗原漂移，但进化速度低于a型流感病毒，并且不同b型流感病毒株之间有规律的重新组合。到目前
为止，b型流感病毒主要分为victoria和yamagata两个谱系。它们与早期的b/lee/1940流感病毒不同，这两种谱系流感病毒自20世纪80年代以来一直在人类群体中共同传播流行，是每三年一次的主要流行毒株。此外，在过去十年中，b型流感病毒引起了学校和社会的几次急性呼吸道疾病暴发，以及继发性细菌性肺炎感染。b型流感病毒的有效传播和缺乏抗病毒效果加剧了人们对其健康的担忧。
7.截至目前，基于流感病毒载体的鼻喷新型冠状病毒疫苗还未见报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用，以解决现有新型冠状病毒疫苗存在的问题。
9.本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
10.本发明的以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株，通过对b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88的ns1基因片段截短保留110个氨基酸后，将其插入到基因合成的新冠病毒参考株s蛋白上的受体结合域基因片段中，构建重组质粒ns110-rbd；利用反向遗传学技术和重组质粒ns110-rbd拯救出以b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88为骨架、稳定表达新冠病毒参考株s蛋白上的受体结合域基因片段的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd。
11.作为优选的实施方式，所述对b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88的ns1基因片段截短保留110个氨基酸后，所获得的截短片段的序列如seq id no:1所示。
12.作为优选的实施方式，所述基因合成的新冠病毒参考株s蛋白上的受体结合域基因片段的序列如seq id no:2所示。
13.作为优选的实施方式，所述重组质粒ns110-rbd的序列如seq id no:3所示。
14.本发明的以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株的构建方法，主要包括以下步骤：
15.步骤一、重组质粒ns110-rbd的构建；
16.步骤二、重组流感病毒的拯救及毒种制备。
17.作为优选的实施方式，步骤一的具体操作过程如下：
18.(1)基因合成和引物设计
19.根据genbank上公布的新型冠状病毒spike rbd原始参考基因组序列设计上下游引物，将新型冠状病毒spike rbd原始参考基因组序列和引物进行基因合成，获得rbd目的基因片段，引物信息如下：
20.in fusion-rbd-f(5
’‑3’
)：tttagagtccaaccaacagaat；
21.in fusion-rbd-r(5
’‑3’
)：gaaattgacacatttgtttttaac；
22.in fusion-vector-f(5
’‑3’
)：agcagaagcagaggatttgttt；
23.in fusion-vector-r(5
’‑3’
)：agtagtaacaagaggatttttattttaaattcacaa；
24.(2)目的基因片段的扩增
25.以合成后的rbd目的基因片段为模板，用引物in fusion-rbd-f/in fusion-rbd-r进行pcr扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，进行目的基因片段的凝胶回收纯化；
26.(3)线性化载体ns110的扩增
27.以b型流感病毒b/yamagata/16/88反向遗传操作平台中的pbd-ns110质粒为模板，用引物in fusion-vector-f/in fusion-vector-r进行pcr扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，进行载体片段的凝胶回收纯化；
28.(4)构建重组质粒ns110-rbd
29.取扩增纯化后的目的基因片段和线性化的载体片段与去离子水混合，共同孵育后，取重组产物转化至jm109感受态细胞；通过菌落pcr筛选，对含有目的基因片段的单克隆菌落进行扩增、纯化、测序鉴定；
30.所得目的基因片段的扩增产物序列如seq id no:2所示；所构建的重组质粒ns110-rbd的序列如seq id no:3所示。
31.作为优选的实施方式，步骤二的具体操作过程如下：
32.(1)重组流感病毒株的拯救
33.取b型流感病毒b/yamagata/16/88反向遗传操作平台中的7个阳性质粒pbd-pb2、pbd-pb1、pbd-pa、pbd-ha、pbd-na、pbd-np、pbd-m和构建好的重组质粒ns110-rbd，在含有opti-mem的离心管中同lipofectamine 3000脂质体转染试剂一起混匀，静置后将混合液滴加入含opti-mem的6孔板中，培养后换含有anti-anti和tpck胰酶的opti-mem培养液继续培养，收集细胞上清液；
34.(2)转染细胞上清液接种鸡胚
35.将收集到的转染细胞上清液采用鸡胚尿囊腔接种法，接种于7日龄的spf鸡胚，经恒温孵育鸡胚、测定血凝效价后，将拯救出的重组流感病毒株命名为ribv-ns110-rbd；
36.(3)重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd毒种的制备
37.将重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd采用鸡胚尿囊腔接种法，接种于7日龄的spf鸡胚，经恒温孵育鸡胚、测定血凝效价后，收取血凝效价高且清亮不含血的鸡胚尿囊液于离心管中作为毒种，离心取上清液分装，-80℃超低温冰箱保存。
38.本发明的以b型流感病毒为载体的人用鼻喷新型冠状病毒疫苗候选株在制备人用鼻喷新型冠状病毒疫苗中的应用。
39.本发明的有益效果是：
40.本发明通过对b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88的ns1基因片段的ns1进行修饰，对b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88的ns1基因片段截短保留110个氨基酸后，将其插入到基因合成的新冠病毒参考株s蛋白上的受体结合域(rbd)基因片段中，构建重组质粒ns110-rbd；利用反向遗传学技术和重组质粒ns110-rbd拯救出以b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88为骨架、稳定表达新冠病毒(sars-cov-2)参考株s蛋白上的受体结合域(rbd)基因片段的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd。
41.本发明通过将重组质粒ns110-rbd与其余7个骨架株重组质粒共转染mdck细胞和293t细胞，拯救表达新型冠状病毒rbd区重组流感病毒，对拯救出的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd进行形态学、分子生物学鉴定及病毒滴度和western blot的检测。结果显示，成功拯救出重组流感病毒拯救株并命名为ribv-ns110-rbd；pcr鉴定结果显示rbd目的基因条带正确，基因序列结果表明拯救病毒株的序列正确，在透射电镜下观察到拯救病毒株的病毒粒子具有流感病毒粒子的典型特征；经测定，重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd在mdck细胞上的病毒滴度为10
5.5
tcid
50
/ml，在鸡胚上的病毒滴度为10
6.5
eid
50
/ml，血凝
效价最高可达到25；western blot实验检测到新型冠状病毒rbd蛋白的表达，大小为35kda。本发明通过试验证实，成功拯救出表达新型冠状病毒rbd蛋白的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd。
42.本发明所拯救出的表达新型冠状病毒rbd区的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd，在原有的流感病毒减毒株基础上，能稳定编码表达外源蛋白rbd，其作为疫苗候选株与现有的复制缺陷型腺病毒载体疫苗相比，可在鸡胚或者mdck细胞上传代生产，具有造价便宜，易于生产等优点；与腺病毒相比，b型流感病毒在人群中流行不广泛，更不易引起抗载体免疫反应；在接种方式上，可采用喷鼻的接种方式；人类下呼吸道被认为主要受到igg的保护，igg是血清中的主要抗体类型，它被输送到肺部；上呼吸道被认为主要受分泌型iga(siga)的保护；呼吸道病毒自然感染既能诱导以igg为主的全身性免疫应答，又能诱导以siga为主的上呼吸道粘膜免疫应答；肌肉或皮内接种在许多情况下会导致血清igg的强烈诱导，但不会诱导粘膜siga的产生；虽然也可以在上呼吸道粘膜表面发现一些igg，但缺乏siga往往使人容易受到上呼吸道感染。鼻腔接种可以有效地诱导粘膜抗体反应，从而潜在地在上呼吸道提供免疫；与传统的肌注接种方式比较更方便、安全；不但可以引起机体的体液免疫和细胞免疫，还可以引起机体的黏膜免疫，使该疫苗候选株与灭活疫苗在相同使用剂量下免疫效果更佳。
43.本发明所拯救出的表达新型冠状病毒rbd区的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd与surapong koonpaew等研发的疫苗株相比，具有不与自然界中流行的a型流感病毒重配的优点，可以应用现有成熟的流感疫苗技术快速生产，为以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗的研发提供了新思路。
附图说明
44.图1为rbd目的基因片段和ns110载体片段的pcr结果。其中，a为rbd目的基因片段的pcr结果；b为ns110载体片段的pcr结果。
45.图2为重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的血凝实验结果。
46.图3为重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的8个基因片段pcr结果。
47.图4为重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的ns基因测序结果。
48.图5为重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的电镜照片(100k
×
)。
49.图6为重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的western blot结果。
50.图7为安全性评价实验结果。其中，a为接种后小鼠随时间的体重变化率，b为接种后小鼠随时间的生存率，c为接种后小鼠随时间的组织嗜性，d为接种后小鼠随时间的肺脏复制动力学。
51.图8为免疫实验流程图。
52.图9为采用间接elisa方法检测特异性抗体igg效价的结果。
53.图10为ifn-γ和il-4elisapot检测结果。其中，a为免疫组小鼠的inf-γ检测结果，b为免疫组小鼠的il-4检测结果。
54.图11为小鼠的攻毒保护实验流程图。
55.图12为小鼠的攻毒保护实验结果。
具体实施方式
56.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
57.一、材料与方法
58.1材料
59.1.1细胞和鸡胚
60.mdck细胞和293t细胞由军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所病毒学实验室保存；7-9日龄spf鸡胚购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
61.1.2主要试剂
62.phusion hf dnapolymerase购自美国new england biolabs公司；reverse transcriptase xl(amv)、nucleo spin gel and pcr clean-up、5
×
in-fusion hd enzyme premix和e.coli jm109 competent cells购自中国宝生物工程大连有限公司；qiaamp viral rnamini kit及qiaprep spin miniprep kit购自德国qiagen公司；lipofectamine 3000transfection kit购自美国thermo fisher scientific公司；0.25％trypsin-edta、0.05％trypsin-edta、fetal bovine serum(fbs)、dmem培养基、opti-mem和antibiotic-antimycotic购自美国thermo fisher scientific公司；1
×
pbs缓冲液及氨苄青霉素购自中国北京索莱宝科技有限公司；tpck胰蛋白酶购自德国默克生物科技有限公司；bca蛋白浓度测定试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；pvdf膜购自美国bio-rad公司。
63.1.3主要设备
64.基因扩增仪购自中国杭州朗基科学仪器有限公司；电泳仪购自美国bio-rad公司；琼脂糖凝胶电泳槽购自中国北京君意东方电泳设备有限公司；电热恒温水槽购自中国上海一恒科技有限公司；凝胶成像仪购自中国上海天能科技有限公司；生物安全柜购自中国北京东联哈尔仪器制造有限公司；高速离心机、37℃恒温培养箱与33℃恒温培养箱购自美国thermo fisher scientific公司；摇床(细菌用)购自中国上海润度生物科技有限公司；普通光学显微镜购自日本奥林巴斯株式会社；-80℃超低温冰箱购自sanyo公司。
65.2方法
66.2.1基因合成和引物设计
67.查找genbank上公布的新型冠状病毒spike rbd原始参考基因组序列，分别通过primer premier 5软件设计上下游引物，通过takara官网设计无缝克隆引物，最后将新型冠状病毒spike rbd原始参考基因组序列和无缝克隆引物送往生工生物工程有限公司进行基因合成，所设计的引物信息见表1。
68.表1无缝克隆引物设计合成序列
69.引物名称引物序列(5
’‑3’
)infusion-rbd-ftttagagtccaaccaacagaatinfusion-rbd-rgaaattgacacatttgtttttaacinfusion-vector-fagcagaagcagaggatttgtttinfusion-vector-ragtagtaacaagaggatttttattttaaattcacaa
70.2.2重组质粒ns110-rbd的构建
71.2.2.1目的基因片段的扩增
72.将上述合成后的rbd目的基因片段，用去离子水稀释至10mm，以此为模板，用设计合成后的引物in fusion-rbd-f/in fusion-rbd-r进行pcr。phusion dna聚合酶的pcr反应体系见表2，phusion dna聚合酶的pcr反应参数见表3所示。
73.表2phusion dna聚合酶的pcr反应体系
74.成分体积模板dna1μl10μm正向引物2μl10μm反向引物2μl5
×
phusionhf缓冲液10μlphusiondna聚合酶0.5μl10mmdntps2μlddh2o补齐至50μl
75.表3phusion dna聚合酶的pcr反应参数
76.温度时间98℃30s98℃10s55℃30s72℃1min72℃10min4℃-77.扩增目的基因片段；产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，进行目的基因片段的凝胶回收纯化。
78.2.2.2线性化载体ns110的扩增
79.取保存的b型流感病毒b/yamagata/16/88反向遗传操作平台(参见《b型流感病毒b/yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及balb/c小鼠感染模型的建立，孙伟洋；于志君；李雪；陈强；高晓龙；国娇；张坤；李元果；王铁成；杨松涛；黄耕；赵永坤；高玉伟；夏咸柱，中国实验动物学报，第23卷第1期，2015-02-28》)中的pbd-ns110质粒，用去离子水稀释至10mm，以此为模板，用设计合成后的引物in fusion-vector-f/in fusion-vector-r进行pcr扩增载体片段，对b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88的ns1基因片段截短保留110个氨基酸后，所获得的截短片段的序列如seq id no:1所示。产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，进行载体片段的凝胶回收纯化。phusion dna聚合酶的pcr反应体系见表4，phusion dna聚合酶的pcr反应参数见表5所示。
80.表4phusion dna聚合酶的pcr反应体系
81.成分体积模板dna1μl10μm正向引物2μl
10μm反向引物2μl5
×
phusionhf缓冲液10μlphusiondna聚合酶0.5μl10mmdntps2μlddh2o补齐至50μl
82.表5phusion dna聚合酶的pcr反应参数
83.温度时间98℃30s98℃10s55℃3min30s72℃1min72℃10min4℃-84.取扩增纯化后的目的基因片段和线性化的载体片段各100ng，与5
×
in-fusion hd enzyme premix和去离子水混合成10μl体系。在50℃水浴锅中共同孵育15min后，取2.5μl重组产物转化至jm109感受态细胞。通过菌落pcr筛选，对含有目的基因片段的单克隆菌落进行扩增、纯化，最后送至生工生物工程有限公司进行测序鉴定。
85.2.2.3重组质粒ns110-rbd的构建结果
86.通过对b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88的ns1基因片段截短保留110个氨基酸后，将其插入到基因合成的新冠病毒参考株s蛋白上的受体结合域基因片段(序列如seq id no:2所示)中，构建重组质粒ns110-rbd。所构建的重组质粒ns110-rbd的序列如seq id no:3所示。
87.如图1中a所示，rbd目的基因片段经pcr扩增、1％琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，得到与预期大小相符的目的条带，在图1a所示的电泳图中可见大小约为670bp(seq id no:2所示)的特异性目的条带。
88.如图1中b所示，ns110载体片段经pcr扩增、1％琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，得到与预期大小相符的目的条带，在图1b所示的电泳图中可见大小约为5600bp的特异性目的条带。
89.2.3重组流感病毒的拯救及毒种制备
90.利用反向遗传学技术和重组质粒ns110-rbd拯救出以b型流感病毒减毒株b/yamagata/16/88为骨架、稳定表达新冠病毒参考株s蛋白上的受体结合域基因片段的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd。具体操作如下：
91.用含10％胎牛血清、1％anti-anti的dmem培养基培养的293t细胞，于转染前用含0.05％edta的胰酶消化后，测定细胞密度，每孔约1
×
106个细胞平铺至6孔细胞培养板中。待形成单层细胞后，按照lipofectamine 3000脂质体转染试剂说明书进行转染。
92.2.3.1重组流感病毒株的拯救
93.取b型流感病毒b/yamagata/16/88反向遗传操作平台中的7个阳性质粒pbd-pb2、pbd-pb1、pbd-pa、pbd-ha、pbd-na、pbd-np、pbd-m和构建好的重组质粒ns110-rbd各600ng。在含有250μl opti-mem的1.5ml离心管中，同lipofectamine 3000脂质体转染试剂一起混
匀，室温下静置20min。将质粒与lipofectamine 3000脂质体转染试剂的混合液滴加入含200ml 250μl opti-mem的6孔板中，33℃、5％co2条件下培养12h。培养12h后换含有1％anti-anti和0.2μg/ml tpck胰酶的opti-mem培养液。然后在33℃、5％co2条件下继续培养72h。72h后收集细胞上清液继续下一步试验。
94.2.3.2转染细胞上清液接种鸡胚
95.将收集到的转染细胞上清液采用鸡胚尿囊腔接种法，接种于7日龄的spf鸡胚。33℃恒温培养箱中孵育鸡胚。72小时后取出进行血凝(ha)试验测定血凝效价。将拯救出的重组流感病毒株命名为ribv-ns110-rbd。如图2所示，测得重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的血凝效价为25。
96.2.3.3重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd毒种的制备
97.试验方法同2.3.2，将保存的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd采用鸡胚尿囊腔接种法，接种于7日龄的spf鸡胚。33℃恒温培养箱中孵育鸡胚。72小时后取出进行血凝(ha)试验测定血凝效价。4℃条件下，收取血凝效价高且清亮不含血的鸡胚尿囊液于50ml离心管中作为毒种，5500rpm4℃离心10min，取上清液分装，-80℃超低温冰箱保存。
98.2.4重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的鉴定
99.2.4.1重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的pcr和测序鉴定
100.取重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd按照qiaamp viral rnamini kit总rna提取试剂盒说明书，提取rna。利用reverse transcriptase xl(amv)反转录成cdna，分别用合成后的b型流感病毒8个基因片段特异性引物(见表6)进行pcr扩增。取pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定和送生工生物工程有限公司测序鉴定。phusion dna聚合酶的pcr反应体系见表7，phusion dna聚合酶的pcr反应参数见表8所示。
101.表6 b型流感病毒8个基因片段特异性引物
102.primer名称碱基序列(5
’‑3’
)pbd-pb2-fccagcagaagcggagcgtttpbd-pb2-rttagtagaaacacgagcatttttcactcpbd-pb1-fccagcagaagcggagcctttpbd-pb1-rttagtagaaacacgagccttttttcapbd-pa-fccagcagaagcggtgcgtttpbd-pa-rttagtagaaacacgtgcatttttgattcpbd-ha-fccagcagaagcagagcattttcpbd-ha-rttagtagtaacaagagcatttttcaataacgpbd-np-fccagcagaagcacagcapbd-np-rttagtagaaacaacagcatttttpbd-na-fccagcagaagcagagcatcpbd-na-rttagtagtaacaagagcatttttgagpbd-m-fccagcagaagcacgcactpbd-m-rttagtagaaacaacgcactttttcpbd-ns110-fccagcagaagcagaggapbd-ns110-rttagtagtaacaagaggatttttat
103.表7 phusion dna聚合酶的pcr反应体系
104.成分体积模板dna1μl10μm正向引物2μl10μm反向引物2μl5
×
phusionhf缓冲液10μlphusiondna聚合酶0.5μl10mmdntps2μlddh2o补齐至50μl
105.表8 phusion dna聚合酶的pcr反应参数
[0106][0107][0108]
电泳鉴定结果如图3所示，1％琼脂糖凝胶电泳显示重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的7个基因片段大小与b型流感病毒b/yamagata/16/88相符。
[0109]
ns基因测序结果如图4所示，测序后用dna star对比分析后，重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的7个基因片段序列与b型流感病毒b/yamagata/16/88相符，ns片段与实验设计相符。
[0110]
所获得的7个基因片段序列分别如序列表中的seq id no:4所示、seq id no:5所示、seq id no:6所示、seq id no:7所示、seq id no:8所示、seq id no:9所示、seq id no:10所示。
[0111]
2.4.2重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的半数组织感染量(tcid
50
)的测定
[0112]
取10％胎牛血清、1％anti-anti的dmem培养基培养的mdck细胞，用含0.25％edta的胰酶消化后，测定细胞密度，平铺至96孔细胞培养板中，37℃，含5％co2细胞培养箱中培养约9小时后，单层细胞密度约80％备用。取重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd 10倍倍比稀释8个稀释度。将稀释好的病毒液每孔100μl加入到96孔板中，每个稀释度做3个重复。并且设立空白细胞对照组。放置于33℃、含5％co2细胞培养箱中孵育1.5h后，弃去病毒液。每孔加入200μl含有终浓度2μg/μl的tpck胰酶和1％anti-anti的opti-mem。继续放入33℃、含5％co2细胞培养箱中培养72h。培养72h结束后取细胞上清液测定血凝效价，按reed-muench法计算病毒的tcid
50
。
[0113]
将重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd以不同稀释度接种mdck细胞，孵育72h后取细胞上清液进行血凝试验，得到数据如表9所示。按reed-muench法计算病毒的tcid
50
，重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的半数组织感染量(tcid
50
)为10
5.5
tcid
50
/ml。
[0114]
表9
[0115][0116]
2.4.3重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的鸡胚半数感染量(eid
50
)的测定
[0117]
取重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd 10倍倍比稀释8个稀释度。取稀释好的病毒液，每稀释度100μl接种3枚7日龄spf鸡胚。将接种后的spf鸡胚放置于33℃恒温培养箱中孵育72h，收集鸡胚尿囊液测定血凝效价，按reed-muench法计算病毒的eid
50
。
[0118]
将重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd以不同稀释度接种7日龄spf鸡胚，孵育72h后取鸡胚尿囊液进行血凝试验，得到数据如表10所示。按reed-muench法计算病毒的eid
50
，重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的鸡胚半数感染量(eid
50
)为10
6.5
eid
50
/ml。
[0119]
表10
[0120][0121][0122]
2.4.4重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的电镜观察
[0123]
将收集的鸡胚尿囊液毒种经β-丙内酯灭活后，用磷钨酸负染后，透射电子显微镜下观察病毒的基本形态。结果如图5所示，电镜下所见病毒粒子呈球状，直径大小约120nm，表面有纤突。病毒粒子大小和形态分布符合流感病毒粒子的典型特征。
[0124]
2.4.5重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的western blot鉴定
[0125]
将重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd、未改造的野生型毒株(wt)分别接种7日龄spf鸡胚，每胚100μl，置33℃孵育72h后，分别收取尿囊液，以尿囊液与细胞裂解液1:9的体积比例裂解尿囊液后，进行western blot验证。
[0126]
结果如图6所示，裂解后的重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd经western blot检测到大小为35kda的目的条带(sars-cov-2spike rbd)，而接种野生型毒株(wt)以及不接种任何病毒株的阴性对照组，其鸡胚尿囊液(nc)检测不到rbd。
[0127]
二、安全性评价实验
[0128]
1、组织病毒制备
[0129]
(1)用mem培养液将重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd稀释至106eid
50
/ml和105eid
50
/ml两个滴度。
[0130]
(2)设置106eid
50
/ml和105eid
50
/ml两个滴度组和一个对照组(mock组)；其中，各组均设置有11只4-6周龄balb/c小鼠；小鼠麻醉后，采取鼻腔滴定的方式感染小鼠，其中106eid
50
/ml和105eid
50
/ml两个滴度组中的小鼠分别接种上述稀释后的病毒液，对照组(mock组)中的小鼠接种mem培养液，各组接种量均为50μl/只。
[0131]
(3)所有小鼠中任意取5只小鼠标记为1-5，从攻毒后第0天开始连续15天观察所有小鼠，并且每天定时称取标记小鼠的体重。
[0132]
(4)在攻毒后第3天和第6天，各在106eid
50
/ml和105eid
50
/ml滴度组处死3只小鼠(非标记的小鼠)。处死小鼠解剖取出脏器组织，并称重记录重量。各组处死小鼠取鼻甲骨
(nasal turbinate)、脑(brain)、心脏(heart)、肺脏(lung)、肾脏(kidney)、肝脏(liver)、脾脏(spleen)和肠(intestine)。
[0133]
(5)研磨组织脏器，离心组织研磨液，取组织上清液冻存于-80℃超低温冰箱中。
[0134]
2、用鸡胚对组织病毒进行滴定
[0135]
(1)从-80℃超低温冰箱取出冻存组织上清液，用冰水混合物化冻，化冻后迅速放入冰盒保存。
[0136]
(2)在二级生物安全柜中，准备冰盒和1.5ml离心管若干，用微量移液器向1.5ml离心管各加入900μl事前配好的dmem稀释液(含双抗，无血清)，再用微量移液器取出100μl组织上清液加入1.5ml离心管内并轻吹打匀，以此方法依次将组织上清液从100十倍倍比稀释至106。
[0137]
(3)在37℃恒温培养箱中取出7日龄spf鸡胚，并在暗室用照蛋器画出气囊腔，在表面喷洒75％酒精消毒后，放入二级生物安全柜。
[0138]
(4)用打孔器在画出气囊腔处轻轻打孔，进行穿刺，接组织上清液。
[0139]
(5)每个稀释度接3个重复，接种量为100μl/鸡胚。
[0140]
(6)用1ml注射器60
°
从打孔处插入，直接插入尿囊腔，进行接种。
[0141]
(7)用白胶封口，待所有鸡胚接种完成后，表面再次喷洒75％酒精消毒。
[0142]
(8)33℃，恒温培养箱培养3天。
[0143]
(9)培养结束后，将鸡胚放入-20℃，1小时，收集尿囊液做血凝实验。
[0144]
(10)用reed-muench方法计算其eid
50
。
[0145]
结果如图7所示。用106eid
50
和105eid
50
两个滴度组和对照组分别对balb/c小鼠进行鼻腔免疫后，14天内小鼠均未出现死亡，如图7中b所示；在体重方面，小鼠体重整体一直处于上升状态，如图7中a所示。
[0146]
为了进一步评价重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd的安全性，分析了小鼠的组织嗜性，如图7中c所示，只有在免疫第3天106eid
50
滴度组2只小鼠的鼻甲骨中发现病毒滴度分别为3.35log10 eid
50
/g和2.98log10 eid
50
/g；在肺中发现病毒滴度为2.55log10 eid
50
/g，如图7中d所示；其余组织病毒滴度均低于检测下限，即小于10
0.5
eid
50
/g。
[0147]
三、免疫实验
[0148]
如图8所示，免疫实验分为单次免疫实验(prime)和二次免疫实验(boost)。单次和二次免疫实验各包含ribv-ns110-rbd-106eid
50
和mock组，每组9只，3只取血，3只取脾脏，3只取肺泡灌洗液。单次免疫实验在免疫第21天采集样本，两次免疫组在第一次免疫后第21天进行第二次免疫，免疫剂量和免疫方式与单次免疫相同，在免疫第42天采集样品。
[0149]
1、间接elisa方法检测特异性抗体igg
[0150]
(1)将小鼠血清灭活，56℃金属浴30min。
[0151]
(2)将商品化sars-cov-2rbd蛋白(义翘神州、40592-v08h)用包被液浓度稀释到5μg/ml，100μl/孔，于4℃包被过夜；
[0152]
(3)弃去板中液体，使用振荡器，用pbst洗板3次，200μl/孔，每次1min；
[0153]
(4)配制5％的脱脂牛奶作为封闭液，150μl/孔，37℃孵育2h；
[0154]
(5)弃去板中液体，使用振荡器，用pbst洗板3次，200μl/孔，每次1min；
[0155]
(6)每组取3只小鼠的待测血清，将血清样品依次用pbst稀释至64倍，128倍，256
倍，512倍，1024倍，2048倍，4096倍；
[0156]
(7)将稀释好的血清分别加入孔中，并做3个复孔，100μl/孔，37℃孵育2h；
[0157]
(8)弃去板中液体，使用振荡器，用pbst洗板3次，200μl/孔，每次1min；
[0158]
(9)用封闭液1:100000稀释hrp标记的羊抗鼠igg抗体，100μl/孔，37℃孵育1h；
[0159]
(10)弃去板中液体，使用振荡器，用pbst洗板5次，200μl/孔，每次1min；
[0160]
(11)每孔加入100μl的tmb底物，室温避光孵育20min左右，孔内变蓝色后每孔加50μl终止液，溶液变黄，用酶标仪检测波长450mn处的吸光度值。
[0161]
单次免疫后第21天和双次免疫后第21天，各实验组小鼠血清的抗sars-cov-2spike rbd特异性igg抗体效价的结果如图9所示。结果显示，单次免疫组和双次免疫组小鼠均显著高于对照组小鼠igg抗体效价。双次免疫组小鼠igg抗体效价明显高于单次免疫组小鼠，总的来说，重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd免疫小鼠后可引起强烈的体液免疫和黏膜免疫。
[0162]
2、ifn-γ和il-4elisapot检测
[0163]
2.1小鼠脾淋巴细胞的分离
[0164]
(1)在单次免疫后第21天和双次免疫后第21天，取免疫组小鼠和对照组小鼠，每组取3只，用异氟烷麻醉后，将小鼠脱颈处死后放入75％酒精中消毒，备用；
[0165]
(2)在生物安全柜中将小鼠固定，使用无菌医用剪刀和镊子解剖小鼠腹部，扒开内脏，可看到长约3-4cm呈长条状的深红色组织，即为脾脏，小心取出，将分离得到的脾脏组织浸泡在干净的pbs溶液中；
[0166]
(3)将100μm的细胞筛网放置在50ml离心管上，把脾脏放在筛网上，加入8ml rpmi 1640完全培养基浸润，用20ml注射器柄用其按压的方式对脾脏进行研磨，研磨完全后，用7ml rpmi 1640使脾细胞过滤下去，然后再用15ml rpmi 1640清洗细胞筛，将收集到的脾细胞悬液2000rpm离心10min；
[0167]
(3)离心后弃上清，加入10ml红细胞裂解液重悬细胞，室温放置10min使红细胞裂解，2000rpm离心10min，重复此步骤一次；
[0168]
(4)用含10％血清的1640培养基重悬细胞，室温2000rpm离心10min；
[0169]
(5)用含10％血清的1640培养基重悬细胞，稀释10倍进行细胞计数，调整细胞密度为2.5
×
106个/ml备用。
[0170]
2.2ifn-γ和il-4elisapot检测
[0171]
(1)向包被过il-4或ifn-γ的抗体elisapot板中加入200μl/孔的1640完全培养基，孵育30min，弃去；
[0172]
(2)加入脾细胞悬液(2.5
×
106个/ml)，200μl/孔，同时加入刺激物，即终浓度为10μg/ml的商品化sars-cov-2rbd蛋白(义翘神州、40592-v08h)，每组取3只老鼠，1只老鼠3个复孔，设立不加刺激物的对照孔，37℃，5％co2培养48h；
[0173]
(3)弃去孔中细胞悬液，用无菌pbs洗涤5次，200μl/孔，每次2min；用含0.5％fbs的pbs稀释抗体bvd6-24g2-biotin或r4-6a2-biotin至终浓度为1μg/ml，200μl/孔，室温孵育2h；
[0174]
(4)弃去孔中液体，无菌pbs洗涤5次，200μl/孔，每次2min，用含0.5％fbs的pb s溶液按1:1000倍稀释streptavidin-alp或streptavidin-hrp，100μl/孔，室温孵育1h；
[0175]
(5)弃去孔中液体，无菌pbs洗涤5次，200μl/孔，每次2min，将用0.45μm滤器过滤bcip/nbt底物溶液，100μl/孔，避光显色，当看到孔底出现清晰蓝色斑点后，用流水冲洗终止显色；
[0176]
(6)室温避光风干板子，酶联斑点图像自动分析仪进行斑点形成细胞(spot for-ming cells,sfcs)计数。
[0177]
为评价脾淋巴细胞的体外记忆效应，采用elispot的方法，在细胞水平上测定经体外刺激后脾淋巴细胞分泌的inf-γ和il-4，结果如图10所示。脾细胞经商品化sars-cov-2rbd蛋白(义翘神州、40592-v08h)刺激后，免疫组小鼠形成的inf-γ和il-4斑点数与对照组的斑点数相比均有差异性，且此差异性具有统计学意义(*p＜0.05)。inf-γ是th1型细胞因子，参与细胞免疫应答的抗病毒作用，il-4是由th2细胞产生的细胞因子，与体液免疫应答相关。综上，重组流感病毒拯救株ribv-ns110-rbd免疫小鼠后可产生th1和th2型细胞因子，从而增强细胞和体液免疫应答并调节总体免疫应答。
[0178]
四、小鼠的攻毒保护实验
[0179]
如图11所示，取6-8月龄老龄balb/c雌性小鼠，以ribv-ns110-rbd-106eid
50
单次免疫和双次免疫后，在生物安全三级实验室内进行小鼠的免疫保护实验。
[0180]
小鼠的免疫保护实验共分为4组，每组8只。攻毒后连续观察14天并记录小鼠体重。攻毒后第3天各组小鼠取3只进行解剖取肺。取到的肺组织分别用于病毒载量的测定和肺脏病理切片。
[0181]
结果如图12所示。在免疫保护实验中，免疫组小鼠肺脏中的病毒载量与对照组存在显著性差异；连续观察7天后，小鼠体重呈缓慢下降；对照组小鼠在攻毒后第4天全部死亡，致死性模型对照成立。
[0182]
在双次免疫保护实验中，免疫组小鼠均存活，保护率100％。对照组小鼠在攻毒后第4天全部死亡，致死性模型对照成立。
[0183]
本发明公开了一种以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。