检测C11orf16表达水平的试剂的应用和试剂盒的制作方法

检测c11orf16表达水平的试剂的应用和试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及检测c11orf16表达水平的试剂在制备用于肝细胞肝癌辅助诊疗和/或肝细胞肝癌患者预后判断的制剂中的应用，以及一种用于肝细胞肝癌辅助诊疗和/或肝细胞肝癌患者预后判断的试剂盒及应用。


背景技术：

2.肝细胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma，lihc)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，全球死亡率不断上升。许多危险因素(包括病毒感染、纤维化、酒精使用和代谢失调)诱导基因或表型改变，并促使肿瘤进展。病因的复杂性增加了肝细胞肝癌分子机制研究的难度。肝细胞肝癌早期的治疗方法如肝移植、肿瘤切除或消融。由于肝细胞肝癌预后不佳，患者的5年生存率特别低，因此肿瘤的早发现和更个性化的治疗是肝细胞肝癌治疗的新目标。生物标志物的识别、分子机制的探索是关键的一步。因此，有必要探索更深入的细胞机制，这可能为肝细胞肝癌的治疗提供潜在的诊断目标。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种新的肝细胞肝癌标志物(c11orf16)，由此进一步提供检测c11orf16表达水平的试剂在制备用于肝细胞肝癌辅助诊疗和/或肝细胞肝癌患者预后判断的制剂中的应用，以及一种用于肝细胞肝癌辅助诊疗和/或肝细胞肝癌患者预后判断的试剂盒及其应用。
4.为了实现上述目的，本发明的第一方面提供检测c11orf16表达水平的试剂在制备用于肝细胞肝癌辅助诊疗和/或肝细胞肝癌患者预后判断的制剂中的应用。
5.进一步地，所述检测c11orf16表达水平包括检测c11orf16的mrna表达水平和/或检测c11orf16的蛋白表达水平。
6.更具体地，所述检测c11orf16表达水平的方法包括：通过rt-qpcr方法检测肝细胞肝癌和癌旁组织中c11orf16 mrna的表达量；通过分子探针技术检测肝细胞肝癌和癌旁组织中c11orf16 mrna表达量；通过免疫组化或western-blot检测肝细胞肝癌和癌旁组织中c11orf16蛋白表达量。
7.更具体地，所述检测c11orf16表达水平的试剂为靶向c11orf16基因dna序列或mrna序列的寡核酸探针、pcr引物，或者为靶向c11orf16的抗体。
8.根据本发明，优选地，所述检测c11orf16表达水平的试剂为具有seq id no：1和seq id no：2所示核苷酸序列的实时荧光定量pcr特异性引物。
[0009]5’‑
ccttgggaagccaggaacaa-3’，seq id no：1
[0010]5’‑
gctttcgagaccagctcctt-3’，seq id no：2
[0011]
本发明的第二方面提供一种用于肝细胞肝癌辅助诊疗和/或肝细胞肝癌患者预后判断的试剂盒，该试剂盒包括：检测c11orf16表达水平的试剂。
[0012]
进一步地，所述检测c11orf16表达水平的试剂为靶向c11orf16基因dna序列或
mrna序列的寡核酸探针、pcr引物，或者为靶向c11orf16的抗体。
[0013]
具体地，所述检测c11orf16表达水平的试剂为具有seq id no：1和seq id no：2所示核苷酸序列的实时荧光定量pcr特异性引物。
[0014]
根据本发明，所述试剂盒还可以含有其他常规的用于实时荧光定量的试剂，优选地，所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：trizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇、无rna酶水、随机引物、5
×
m-mlv缓冲液、dntps、rna酶抑制剂、m-mlv逆转录酶、具有seq id no：3和seq id no：4所示核苷酸序列的actb实时荧光定量pcr特异性引物。
[0015]5’‑
ggcacccagcacaatgaaga-3’，seq id no：3；
[0016]5’‑
actcctgcttgctgatccac-3’，seq id no：4。
[0017]
c11orf16是一种蛋白编码基因，本发明证实肝细胞肝癌中c11orf16表达显著上升，c11orf16高表达分别与肝细胞癌患者总生存期(os)和疾病相关存活率(dss)下降相关联，说明c11orf16可用于肝细胞肝癌辅助诊疗和/或肝细胞肝癌患者预后判断，并基于此设计了c11orf16检测试剂盒。
[0018]
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
[0019]
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
[0020]
图1示出了肝细胞肝癌中靶基因c11orf16的表达变化。(a)非配对样本结果显示肝细胞肝癌组织中c11orf16表达显著上调；(b)配对样本结果显示肝细胞肝癌组织中c11orf16表达显著上调。
[0021]
图2示出了肝细胞肝癌中c11orf16表达与患者总生存期(overall survival，os)的相关性。c11orf16高表达与肝细胞肝癌患者os下降相关联。
[0022]
图3示出了肝细胞肝癌中c11orf16表达与患者疾病相关存活率(disease-specific survival，dss)的相关性。c11orf16高表达与肝细胞肝癌患者dss下降相关联。
[0023]
图4示出了肝细胞肝癌中c11orf16的表达变化。
具体实施方式
[0024]
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0025]
实施例1
[0026]
本实施例用于说明肝细胞肝癌中靶基因c11orf16的表达显著下调。
[0027]
肝细胞肝癌中c11orf16表达差异分析：
[0028]
1、数据下载与整理：
[0029]
利用ucsc xena网站(https://xenabrowser.net/datapages/)下载tcga肝细胞肝癌表达谱数据和临床数据资料，c11orf16表达谱数据经log2转化后进行组间比较。
[0030]
2、肝细胞肝癌中c11orf16的表达差异分析
[0031]
利用r软件包分析肝细胞肝癌患者配对与非配对样本间c11orf16mrna水平差异，ggplot2包用于可视化，如图1所示。
[0032]
图1示出了肝细胞肝癌中靶基因c11orf16的表达变化。(a)非配对样本结果显示肝细胞肝癌组织中c11orf16表达显著上调；(b)配对样本结果显示肝细胞肝癌组织中c11orf16表达显著上调。***p《0.001。
[0033]
实施例2
[0034]
本实施例用于说明肝细胞肝癌中c11orf16高表达与患者总生存期下降相关。
[0035]
肝细胞肝癌中c11orf16表达与患者总生存期相关性分析：
[0036]
使用r软件包maxstat计算c11orf16的最佳截断值，将患者分成c11orf16高低表达两组，进一步使用r软件包survival的survfit函数分析两组的预后差异，利用logrank test方法评估了不同组样本之间的预后差异显著性，如图2所示。
[0037]
图2示出了肝细胞肝癌中c11orf16表达与患者总生存期(overall survival，os)的相关性。c11orf16高表达与肝细胞肝癌患者os下降相关联。
[0038]
实施例3
[0039]
本实施例用于验证肝细胞肝癌中c11orf16高表达与患者疾病相关存活率下降相关。
[0040]
肝细胞肝癌中c11orf16表达与患者疾病相关存活率相关性分析：
[0041]
使用r软件包maxstat计算c11orf16的最佳截断值，基于此将患者分成c11orf16表达高低两组，使用r软件包survival的survfit函数分析两组的预后差异，利用logrank test方法评估了不同组样本之间的预后差异显著性。如图3所示。
[0042]
图3示出了肝细胞肝癌中c11orf16表达与患者疾病相关存活率(disease-specific survival，dss)的相关性。可见，c11orf16高表达与肝细胞肝癌患者dss下降相关联。
[0043]
实施例4
[0044]
本实施例用于说明制备检测c11orf16表达量的试剂盒。
[0045]
1、引物设计
[0046]
根据人源c11orf16基因(gene id:56673)转录本cds区序列，设计pcr引物，引物序列如表1所示。
[0047]
2、试剂盒组分
[0048]
(1)trizol 50.0ml；
[0049]
(2)异丙醇50.0ml；
[0050]
(3)氯仿50.0ml；
[0051]
(4)无水乙醇50.0ml；
[0052]
(5)无rna酶水5.0ml；
[0053]
(6)1.0μm随机引物(random primers)50.0μl；
[0054]
(7)5
×
m-mlv缓冲液2.0ml；
[0055]
(8)10.0mm三磷酸碱基脱氧核苷酸(dntps)100.0μl；
[0056]
(9)40u/μl rna酶抑制剂50.0μl；
[0057]
(10)200u/μl m-mlv逆转录酶50.0μl；
[0058]
(11)abi 2
×
pcr mix 2.0ml；
[0059]
(12)10.0μm c11orf16实时荧光定量pcr特异性引物30.0μl，引物序列见表1；
[0060]
(13)10.0μm actb实时荧光定量pcr特异性引物30.0μl，引物序列见表1。
[0061]
表1荧光定量rt-pcr引物序列
[0062][0063]
3、rt-pcr鉴定肝细胞肝癌中c11orf16的表达变化
[0064]
(1)组织中总rna提取：本实验在冰浴中进行。取30～50mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml离心管中，加入1ml trizol充分匀浆，室温静置5min；每管加入200μl氯仿，剧烈混匀30sec，静置15min，4℃12000rpm离心15min；轻轻吸取上层液体400μl至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃12000rpm离心10min；弃上清，加入1ml 75％酒精洗涤沉淀物，4℃12000rpm离心10min；尽可能弃掉上清，室温下晾干10min，每管加入10μl无rna酶水，溶解(65℃促溶10-15min)。测定od
260
，计算rna浓度。
[0065]
rna(mg/ml)＝40
×
od
260
×
稀释倍数(n)/1000
[0066]
(2)反转录：每25μl反转录体系包括100pmol随机引物，2μg总rna，m-mlv反转录酶1μl，rnase抑制剂0.625μl，dntps(10mm)1.25μl，5
×
m-mlv缓冲液5μl，无rna酶水补齐至25μl。反应条件为：37℃1h，95℃5min。
[0067]
(3)定量pcr：每20μl反应体系包含2
×
pcr mix 10μl，上、下游引物各0.4μl，cdna1μl，ddh2o 8.2μl。反应条件为：94℃2min，94℃15s，60℃40s，40个循环。
[0068]
(4)2-δδct
法计算nsmce2相对表达量：actb作为内参基因，将qpcr测得的靶基因c
t
值与同组织来源的内参基因actb的c
t
值相减得到δc
t
，再将δc
t
与对照组δc
t
相减得到δδc
t
(取癌旁样本δc
t
的平均值为δc
t
对照)，利用excell表格中power函数计算每组nsmce2相对表达量。利用软件graphpad prism 6.0绘图，t检验分析9例肝细胞肝癌样本(lihc)和9例癌旁样本(正常)的表达差异，p《0.05为差异具有统计学意义。结果如图4所示。
[0069]
图4示出了肝细胞肝癌中c11orf16的表达变化。可见，肝细胞肝癌中c11orf16表达显著下降。
[0070]
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。