格氏乳杆菌RW2014及在制备降脂药物中的应用的制作方法

格氏乳杆菌rw2014及在制备降脂药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种益生菌及其应用，属于微生物领域。


背景技术：

2.高脂血症是体内脂类代谢紊乱导致血脂水平增高的一种疾病，是指各种原因导致的血浆中胆固醇(tc)、甘油三脂(tg)、极低密度脂蛋白(vldl)、低密度脂蛋白(ldl)升高、和(或)高密度脂蛋白(hdl)降低的一种全身脂代谢异常疾病。高脂血症是心脑血管疾病的主要危害因素之一，容易诱发动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中等多种心脑血管疾病。who资料显示欧洲成年人高脂血症发病率为54％，大约有1.3亿欧洲成年人患有高脂血症。美国有50％的男性和48％的女性患有高脂血症，美国每年都有65万人死于高脂血症引起的急性心肌梗死。我国60岁以下人群和60岁以上人群的高脂血症发病率分别为13.6％和25％，年龄越大病情越严重。城市人群的高脂血症发病率普遍高于农村。我国人口基数大，据此推算，我国高脂血症患者总数超过2亿人。
3.现在临床常用的他汀类一线降血脂药物，能显著降低血胆固醇和低密度脂蛋白，适合于各种类型的高胆固醇血症,但不适用单纯甘油三酯血症。据美国医药媒体最新报道，2015年全球降血脂药物总销售额达290亿美元左右，其中他汀类药物占70～80％份额。但他丁类药物有肝毒性和肌痛症副作用，对有些患者的降脂效果不理想，寻找更加安全、有效的降脂药物一直是医药领域的研究热点。
4.1963年非洲部落由于大量食用乳酸菌发酵制品而使体内血清胆固醇含量较低的发现引起了科学界对益生菌降低胆固醇功效的关注。国内外已经有许多关于乳酸菌降胆固醇作用的文献报道，但具体的乳酸菌筛选指标、调节血脂的体内效果和机理等尚不明确，而且乳酸菌降胆固醇的效果还难以达到令人满意的效果。本发明旨在从新生儿粪便中分离筛选具有良好降胆固醇功能的乳酸菌株，并进一步开发其在制备具有降脂作用的特殊功能食品或药品中进行应用。


技术实现要素：

5.基于上述发明目的，本发明首先提供了一株格氏乳杆菌菌株rw2014，所述菌株的保藏号为cgmcc no.21252，保藏日期为2020年11月26日，保藏分类命名为格氏乳杆菌，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
6.在一个优选的实施方案中，所述菌株的16s rrna的序列如seq id no.1所示。
7.其次，本发明还提供了上述菌株及其菌体成分在制备代谢性疾病治疗或预防药物中的应用。
8.在一个优选的实施方案中，所述代谢性疾病为血脂代谢紊乱。
9.在一个更为优选的实施方案中，所述血脂代谢紊乱为高脂血症。
10.更为优选地，所述高脂血症为高甘油三酯血症或高胆固醇血症。
11.第三，本发明还提供了上述的菌株在制备食品和/或保健品中的应用。
12.在一个优选的实施方案中，所述食品和/或保健品为减肥食品和/或保健品。
13.最后，本发明提供了一种含有上述菌株的组合物。
14.在一个优选的实施方案中，所述组合物还含有制药学上可接受的载体和/或赋形剂，所述组合物被制备为胶囊、冻干粉或者菌液制剂。
15.本发明是从新生儿粪便中分离纯化得到具有益生菌特性的乳酸杆菌，实验证明分离得到的乳酸菌对动物无害，且经动物实验确证具有调节血脂的功效。格氏乳杆菌rw2014菌株能显著降低低密度脂蛋白，总胆固醇，甘油三酯，升高高密度脂蛋白，和辛伐他丁有相似的调节血脂功效。摄入两种乳酸菌的大鼠体征正常，摄入四周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。
附图说明
16.图1.格氏乳杆菌rw2014降低总胆固醇统计图；
17.图2.格氏乳杆菌rw2014降低甘油三酯统计图；
18.图3.格氏乳杆菌rw2014降低低密度脂蛋白统计图；
19.图4.格氏乳杆菌rw2014增高高密度脂蛋白统计图；
20.图5.格氏乳杆菌rw2014降低血清lps含量统计图；
21.图6.格氏乳杆菌rw2014降低血清il
‑
1含量统计图；
22.图7.格氏乳杆菌rw2014降低血清tnf含量统计图；
23.图8.格氏乳杆菌rw2014降低血清il
‑
6含量统计图；
24.图9.格氏乳杆菌rw2014降低血清mcp含量统计图；
25.图10.格氏乳杆菌rw2014增高粪便中丁酸浓度统计图；
26.图11.格氏乳杆菌rw2014增高粪便中戊酸浓度统计图；
27.图12.格氏乳杆菌rw2014增高粪便中异丁酸浓度统计图；
28.图13.格氏乳杆菌rw2014增高粪便中已酸浓度统计图；
29.图14.格氏乳杆菌rw2014干预的粪便胆汁酸靶向检测热图；
30.图15.格氏乳杆菌rw2014对粪便中总结合胆汁酸含量的影响统计图；
31.图16.格氏乳杆菌rw2014对粪便中总游离胆汁酸含量的影响统计图；
32.图17.格氏乳杆菌rw2014增高粪便中游离/结合胆汁酸的比值统计图；
33.图18.格氏乳杆菌rw2014对粪便中总初级胆汁酸的影响统计图；
34.图19.格氏乳杆菌rw2014干预增加粪便中总次级胆汁酸含量统计图；
35.图20.格氏乳杆菌rw2014干预对粪便中次级/初级胆汁酸比值的影响统计图；
具体实施方式
36.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
37.实施例1.乳酸菌的分离、筛选和鉴定
38.1.格氏乳杆菌rw2014菌株的分离
39.1)从保菌管中取出标本100μl，加入到预装900μl无菌pbs的ep管中，依次对样本进行梯度稀释，粪便标本浓度稀释至10
‑6倍；
40.2)取不同稀释度的样品100μl涂布于mrs培养基上，放入培养箱中；
41.3)在37℃，0.5％co2环境中培养48h；
42.4)取出培养皿，用无菌接种环挑取不同形态特征的菌落，转接至新的mrs固体培养基中进行纯化，37℃厌氧培养48h，连续转接3次，将纯化菌株在ph＝3.5的液体mrs中培养，筛选耐酸生长优良的菌株可用于实验或冷冻保藏。
43.2.菌种保藏
44.本实验室用含25％甘油的mrs培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：
45.1)将容量为2ml的保菌管经121℃，15min高压灭菌处理后以备使用；
46.2)乳酸杆菌在mrs固体培养基上连续转接3次后，向培养皿上加入1.5ml的无菌保菌液；
47.3)用l棒对培养皿进行刮涂，使菌落充分融入保菌液中
48.4)将菌液转移到保菌管中，混匀后
‑
80℃保藏。
49.3.菌落外观和菌体形态观察
50.乳酸杆菌属兼性厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，菌落呈乳白色、表面光滑；在有氧条件下，乳酸杆菌亦可生长，大部分菌种菌落表面较粗糙，菌落颜色多为乳白色。镜下观察乳杆菌细胞形态为多形性，多呈细长杆状、较粗杆状、球杆状等，排列呈栅栏状、链状等。
51.4.细菌总dna的提取
52.将单个菌落接种于bhi培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组dna提取试剂盒(tiangen)说明书操作，提取dna。
53.5.细菌通用引物16srrnapcr扩增
54.细菌16srrna鉴定：提取细菌基因组dna，扩增乳酸杆菌通用引物16srdnapcr产物测序，序列在ncbi上进行blast比对，进行初步鉴定。
55.本实验所用的细菌16srrnapcr扩增的引物以及pcr反应的条件如下，实验全部用50μl的pcr体系。通过对待测乳酸杆菌通用引物16srrnapcr产物测序结果在ncbi上进行blast比对，鉴定。挑选具有代表性的样本pcr产物测序。测序结果根据blast的比对完成对乳酸杆菌的初步鉴定。结果显示格氏乳杆菌rw2014(cgmccno.21252)为格氏乳杆菌(seqidno:1)。
56.通用引物16srrnapcr扩增条件
57.引物序列：
58.27f，5'
‑
agagtttgatcmtggctcag
‑
3'
59.1492r5'
‑
tacggytaccttgttacgactt
‑
3'
60.反应体系(50μl)
[0061][0062]
扩增条件
[0063][0064]
6.菌株的耐酸、耐胆盐筛选方法
[0065]
1)待活化三代的实验菌株生长饱和后，以1
×
106或1
×
107cfu/ml的接种量接种于ph＝2.0的mrs培养基中，放入培养箱；
[0066]
2)在37℃环境中培养2h后，进行10倍梯度稀释，以适宜浓度滴种于mrs固体平板培养基中，放入培养箱；
[0067]
3)经37℃培养48h后，对平皿上的菌落进行计数，计算出细菌的存活数；
[0068]
4)选择耐酸效果较好的菌株接种到含有0.3％牛胆汁盐的mrs培养基中；
[0069]
5)在37℃环境中培养4h后，进行10倍梯度稀释，以适宜浓度滴种于mrs固体平板培养基中，放入培养箱；
[0070]
6)经37℃培养48h后，对平皿上的菌落进行计数，计算出细菌的存活数；
[0071]
结果：本实验模拟人体肠道环境来考察菌株在ph＝2.0和0.3％胆盐的mrs培养基中的存活情况，来评价菌株对胃肠道的耐受能力。结果显示两株菌的耐酸和耐胆盐能力良好，和鼠李糖lgg菌株的耐酸耐胆盐功能接近。(参见表1)
[0072]
表1备选菌株的耐酸、耐胆盐情况
[0073][0074]
根据生化鉴定，获得了一株生化特征为格氏乳杆菌的菌株rw2014，菌株保藏号为cgmcc no.21252，保藏日期为2020年11月26日，保藏分类命名为格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
[0075]
实施例2.格氏乳杆菌rw2014的降脂功能评价
[0076]
1.研究方法和评价指标
[0077]
将40只约200克体重的雌性sd大鼠分别随机分四组，三组给予高脂饲料(胆固醇1％，猪油10％，0.2胆酸盐，10％蛋黄粉)，其中一组空白组给与正常饲料。高脂饲料喂食一周后益生菌组经口给予109cfu格氏乳杆菌rw2014菌液，高脂模型pbs处理组给予无菌pbs，辛伐他丁组在实验终止前两周给予20mg/kg体重的辛伐他丁。喂食高脂饲料五周后终止实验，采集血清和粪便，利用elisa检测血清各项血脂水平和炎性因子，利用高效液相色谱靶向代谢检测粪便中短链脂肪酸和胆酸代谢物的含量，评价降脂药物和格氏乳杆菌rw2014对大鼠高胆固醇模型的干预效果。
[0078]
2.研究结果
[0079]
研究结果可见pbs高胆固醇模型组的总胆固醇(tc：2.46
±
0.15mmol/l)、甘油三酯(tg：2.93
±
0.10mmol/l)、低密度脂蛋白(ldl：2.99
±
0.20mmol/l)均显著高于空白组(tc：1.4
±
0.15mmol/l；tg：1.74
±
0.16mmol/l；ldl：1.78
±
0.25mmol/l)，高密度脂蛋白(hdl)显著低于空白组(pbs：1.68
±
0.27mmol/l；空白：3.09
±
0.30mmol/l)(p<0.05)，表明高脂饲料成功诱导建立了高胆固醇模型。rw2014干预组的tc(1.64
±
0.17mmol/l)、tg(2.04
±
0.07)、ldl(2.38
±
0.28)均显著低于pbs组(tc：2.46
±
0.15mmol/l；tg：2.93
±
0.10mmol/l；(ldl：2.99
±
0.20mmol/l)，同时hdl(2.53
±
0.28mmol/l)显著高于pbs组(1.68
±
0.27mmol/l)(p<0.05))。rw2014干预可致tc，tg，ldl分别降低33.33％，30.38％，20.4％，hdl增高50.6％。该结果证实了与pbs模型组相比，辛伐他丁组和格氏乳杆菌rw2014几乎等效地显著降低tc(1.73
±
0.14mmol/l)，tg(2.08
±
0.19mmol/l)，ldl(1.97
±
0.18mmol/l)，提高hdl(2.71
±
0.28mmol/l)(见图1
‑
图4)。
[0080]
高脂饲料引起血清内毒素(et:51.87
±
7.38pg/ml)比空白对照组(29.9
±
7.11pg/ml)显著增高，辛伐他丁(40.32
±
1.53pg/ml)和格氏乳杆菌rw2014(27.52
±
5.56pg/ml)干预可显著降低内毒素水平，特别是rw2014干预几乎达到空白对照水平(图5)。高脂饲料也诱导血清中il
‑
1β(27.79
±
4.47pg/ml)比空白对照组(16.41
±
2.81pg/ml)显著增高，辛伐他丁(22.45
±
1.62pg/ml)和格氏乳杆菌rw2014(20.49
±
2.57pg/ml)干预可有效降低il
‑
1β水平(图6)。高脂饲料也诱导血清中tnf(223.87
±
21.19pg/ml)比空白对照组(124.87
±
31.04pg/ml)显著增高，辛伐他丁(124.05
±
13.50pg/ml)和格氏乳杆菌rw2014(131.26
±
18.12pg/ml)干预可有效降低tnf水平，接近空白对照水平(图7)。高脂饲料诱导血清中il
‑
6(150.35
±
15.41pg/ml)比空白对照组(94.85
±
21.66pg/ml)显著增高，辛伐他丁(114.09
±
17.50pg/ml)和格氏乳杆菌rw2014(115.62
±
11.91pg/ml)干预可有效降低il
‑
6水平(图8)。高脂饲料诱导血清中mcp
‑
1(716.41
±
75.66pg/ml)比空白对照组(433.34
±
86.22pg/ml)显著增高，辛伐他丁(590.88
±
42.64pg/ml)和格氏乳杆菌rw2014(555.37
±
88.10pg/ml)干预可有效降低mcp
‑
1水平，接近空白对照水平(图9)。该结果证实了高血脂的慢性炎症状态，辛伐他丁和格氏乳杆菌rw2014干预能有效降低炎性因子含量，表明rw2014菌株具有免疫调节、抑制慢性炎症的功能。
[0081]
pbs高胆固醇模型组粪便中丁酸含量(224.52
±
39.66μg/g)比空白对照组(700.42
±
313.75pg/ml)显著降低，格氏乳杆菌rw2014干预组(536.63 5
±
322.10pg/ml)显著提高了丁酸含量(图10)。pbs高胆固醇模型组粪便中戊酸含量(10.94
±
8.71μg/g)比空白对照组(43.23
±
19.83pg/ml)显著降低，格氏乳杆菌rw2014干预组(31.56
±
17.40pg/ml)显著提高了戊酸含量(图11)。pbs高胆固醇模型组粪便中异丁酸含量(9.82
±
5.80μg/g)比空白对照组(21.82
±
9.81pg/ml)显著降低，格氏乳杆菌rw2014干预组(17.52
±
7.71pg/ml)显著提高了异丁酸含量(图12)。pbs高胆固醇模型组粪便中已酸含量(2.36
±
0.35μg/g)低于空白对照组(3.40
±
0.60pg/ml)，格氏乳杆菌rw2014干预组(3.19
±
0.41pg/ml)显著提高了已酸含量(图13)。该结果表明rw2014菌株能有效降低血脂可能与调节肠道代谢、增高粪便中短链脂肪酸含量有关。
[0082]
胆酸(盐)是胆固醇分解代谢的产物，在人体内主要以结合态形式存在，参与肝肠循环。rw2014携带的胆盐水解酶(bsh)可能将进入小肠内的结合型胆酸盐水解成不容易被
小肠吸收的游离胆汁酸，游离的初级胆汁酸可被肠道细菌分解为次级胆汁酸而随粪便直接排出体外。由于反馈调节作用导致胆固醇在肝脏内被进一步分解生成新的胆汁酸，从而降低体内胆固醇水平。对每组动物的粪便进行靶向胆酸代谢物分析结果见图14热图。pbs高胆固醇模型组粪便中结合型胆酸含量(2.06
×
104±
1.58
×
104ng/ml)比空白对照组(0.45
±
0.19ng/ml)显著升高，rw2014干预(0.66
±
0.12g/ml)可显著降低结合型胆酸含量(图15)。高脂模型组粪便中游离胆酸含量(4.12
×
106±
0.75
×
106ng/ml)比空白组(1.85
×
106±
0.83
×
106ng/ml)显著增高，rw2014干预(6.87
×
106±
2.17
×
106ng/ml)进一步提高了粪便中总的游离胆酸含量(图16)。因此高脂模型组的游离胆酸/结合胆酸的比值(339
±
275)和空白对照(412
±
55)无显著差异，但rw2014干预组(1064
±
335)游离胆酸/结合胆酸的比值显著高于空白组合高胆固醇模型组，表明rw2014干预有效增加了游离胆酸含量和相对结合胆酸的比值(图17)，从而干预了肝肠循环的结合型胆酸再吸收，由于反馈调节作用导致胆固醇在肝脏内被进一步分解生成新的胆汁酸，从而降低体内胆固醇水平。与空白组(0.23
×
106±
0.12
×
106ng/ml)相比,高脂饲料(1.83
×
106±
0.43
×
106ng/ml)可显著增高初级胆酸含量，rw2014干预对初级胆酸影响不大，干预组(1.46
×
106±
0.37
×
106ng/ml)和模型组无显著差异(图18)。高脂饲料对次级胆酸含量的几乎无影响，空白组(1.63
×
106±
0.72
×
106ng/ml)和高胆固醇模型组(2.31
×
106±
0.90
×
106ng/ml)的次级胆酸含量接近，但rw2014干预组次级胆酸含量(5.41
×
106±
1.99
×
106ng/ml)显著高于空白和模型对照组(图19)。因此pbs高脂模型组的次级胆酸/初级胆酸的比值最低(1.40
±
0.80)显著低于空白对照组(7.46
±
1.78)，rw2014干预组的次级胆酸/初级胆酸的比值(3.80
±
1.41)有向空白组恢复的趋势，虽未能达到空白组的比值(图20)。该结果进一步证实了rw2014干预可促进提高游离胆酸和次级胆酸含量。次级胆汁酸可随粪便直接排出体外，由于反馈调节作用导致肝脏内合成更多胆酸需要消耗更多胆固醇，从而减少血清胆固醇含量。摄入rw2014的大鼠表现正常，摄入四周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。