四氧化三铁纳米粒子介导的日光促进PET高效酶降解的方法与流程

四氧化三铁纳米粒子介导的日光促进pet高效酶降解的方法
技术领域
1.本发明属于pet生物降解领域，具体涉及一种四氧化三铁(fe3o4)纳米粒子介导的日光促进pet高效酶降解的方法。


背景技术：

2.聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，pet)聚酯塑料具备优良的物化性能如耐用性、塑性、轻盈性和不可降解性，因此被广泛应用在一次性饮料瓶、包装袋、衣物和毛毯的制造中。由于其化学性质极其稳定不易被降解，目前有大量的塑料废品存在于垃圾填埋场和海洋中，对生态环境造成严重的破坏。目前有许多研究致力于实现塑料废品的有效降解和循环使用，常用的方法有糖酵解、甲烷解、水解和氨解等几种化学降解方法，但这些方法通常需要较高的温度并且会产生一些其它的环境污染物。相比而言生物降解作为一种环境友好型的方法具有很大的应用前景。
3.目前科学家们发现并改造了许多具有pet降解能力的酶，包括叶分支堆肥角质酶(lcc)、特异腐质霉角质酶(hic)和持久性pet降解酶(durapetase)等。研究表明催化体系温度对酶的活性有极大的影响，目前研究表明对大多数pet降解酶而言，常温下(≤25℃)它们对pet的降解活性极低，而在较高的温度下进行酶催化有利于增强它们降解pet的活性。在较高的温度下进行pet的酶降解，有利于高效的解决塑料污染问题。
4.利用传统的加热方式升高pet酶降解体系的温度会消耗大量的能源，这限制pet降解酶的实际应用能力。目前能源短缺成为人类发展亟需解决的问题，寻找可再生能源谋求持续发展迫在眉睫。有效地收集太阳能是人类面临的一个巨大挑战和世界性的目标，通过太阳能获取热能可以有效的解决能源问题。fe3o4纳米粒子(magnetic nanoparticle，mnp)具有优良的光热能力，无论在近红外(nir)还是日光(solar light)的照射下，都能实现光能向热能的转化。
5.因此本发明拟采用fe3o4作为光热材料，通过将pet降解酶durapetase和fe3o4的物理混合或者共价交联，利用太阳能提高pet降解反应体系的温度，从而提高durapetase对pet的降解能力。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于解决现有技术中常温下pet降解酶活性低，需要外界能量供给的问题，开发了一种利用fe3o4纳米粒子捕获太阳热能，进而升高pet生物降解体系的温度，从而提高酶对pet降解能力的方法。本发明通过fe3o4和pet降解酶的物理混合或者固定化，将fe3o4的日光光热能力引入到pet的酶降解领域，提高了pet降解酶在常温下对pet的降解能力，使其更适合工业化应用。
7.为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
8.本发明开发了一种fe3o4纳米粒子介导的日光促进pet降解酶高效降解pet的方法，包括如下步骤：
9.(1)将pet降解酶和fe3o4纳米粒子物理混合，或者将pet降解酶和fe3o4纳米粒子共价交联；得到pet降解酶体系；
10.(2)将pet薄膜浸没于步骤(1)的pet降解酶体系中，然后将反应体系置于日光照射下进行pet的酶降解。
11.本发明中所述的pet降解酶包括叶分支堆肥角质酶(lcc)、特异腐质霉角质酶(hic)或持久性pet降解酶(durapetase)；优选为durapetase。
12.本发明中所述的fe3o4纳米粒子和pet降解酶进行物理混合的质量比例为2～100:1。
13.本发明中所述的fe3o4纳米粒子的粒径为5-100nm。
14.本发明中所述的fe3o4纳米粒子表面带有羧基或者氨基。
15.本发明中所述的fe3o4纳米粒子和pet降解酶的共价交联通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)反应完成，其步骤如下：
16.1)将fe3o4纳米粒子分散到mes缓冲液中，加入edc和nhs活化其表面羧基，恒温震荡反应，反应结束后分离回收并用去离子水反复清洗；
17.2)将活化后的fe3o4纳米粒子加入到含有pet降解酶的ps缓冲液中，置于恒温空气摇床中震荡反应，反应结束后分离回收获得固定在fe3o4纳米粒子上的pet降解酶。
18.上述步骤1)中所述的edc与磁性fe3o4纳米粒子的质量比例为0.5～2:1，nhs与磁性fe3o4纳米粒子的质量比例为0.5～1.5:1。
19.上述步骤1)中所述的mes缓冲液为：50mm、ph5.5。
20.上述步骤2)中所述的fe3o4纳米粒子和pet降解酶的质量比例为5～25:1，恒温摇床温度为3-10℃，转速为50-150rpm，反应时间为1-5h。
21.上述步骤2)中所述的ps缓冲液为：50mm，ph 7.5。
22.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
23.(1)本发明通过将具备日光光热能力的fe3o4纳米粒子和durapetase物理混合或者共价交联，都能够提高在日光照射条件下durapetase降解pet的反应体系的温度，从而提高了durapetase对pet的降解能力。光照条件下4h内上述两种含有fe3o4纳米粒子的durapetase反应体系pet降解产物分别达到70.4μm(物理混合，实施例2)和，30.9μm(共价交联，实施例5)而不含有fe3o4纳米粒子的durapetase没有任何pet降解产物。
24.(2)本发明利用具备日光光热能力的fe3o4纳米粒子有效的提高了日光条件下pet降解体系的反应温度，使得pet降解体系温度由25℃上升至46℃，从而避免了外界能源的消耗。
附图说明
25.图1pet降解酶durapetase的凝胶电泳检测(sds-page)结果。
26.图2合成的fe3o4纳米粒子的透射电镜图。
27.图3光照条件下fe3o4纳米粒子介导的durapetase的pet降解。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，
显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明所提供的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明公开保护的范围。
29.实施例1：
30.pet降解酶durapetase的表达纯化以及fe3o4纳米粒子的制备：
31.pet降解酶durapetase的表达纯化，其具方案可参照文献(acs catalysis,2021,11,1340-1350)，纯化后的durapetase利用sds-page鉴定纯度并定性分析，结果如图1所示。在28kda处存在清晰的蛋白条带，该条带分子量同durapetase的理论分子量一致，并且利用软件分析可知纯化的目的蛋白的纯度高达99.9％，适合用于后续研究。
32.另外采用溶剂热的方式合成fe3o4纳米粒子，制备方案可参照文献(nanoscale,2013,5,2133-2141)，合成的fe3o4纳米粒子其形貌如图2的透射电镜图所示，表明合成的fe3o4纳米粒子分散性良好，粒径在5-20nm之间。
33.实施例2-4，以实施例1合成的fe3o4纳米粒子和durapetase配置物理混合反应体系。
34.实施例2：
35.配置浓度为2mg/ml的fe3o4纳米粒子溶液，同时配置浓度为90.4μg/ml的durapetase溶液，将两者进行物理混合，得到durapetase浓度为45.2μg/ml，fe3o4纳米粒子浓度为1mg/ml的反应体系。
36.日光照射下上述反应体系中pet的酶降解：
37.将pet剪成直径为6mm的圆片进行塑料降解实验。在室温条件下(25℃)，取pet薄膜浸没到1ml上述降解反应体系中，在光照(1kw/m2)条件下进行降解反应。同时设置对照组，以1ml酶量相同的游离durapetase(45.2μg/ml)在光照条件下进行4h的pet的降解。反应4h之后取样品进行灭活处理，然后离心取上清进行hplc检测，确定产物单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(mhet)和对苯二甲酸(tpa)的总量。
38.结果如图3所示，在光照条件下，含有fe3o4纳米粒子的物理混合反应体系温度能够从25℃上升到46℃，4h之后产物量达到70.4μm。而游离酶反应体系温度仅仅从25℃上升到29.5℃，并且4h内没有任何产物的生成。这证明将fe3o4纳米粒子同durapetase物理混合有助于增强在日光下条件下pet的酶降解。
39.实施例3：
40.配置浓度为2mg/ml的fe3o4纳米粒子溶液，同时配置浓度为1mg/ml的durapetase溶液，将两者进行物理混合，得到durapetase浓度为500μg/ml，fe3o4纳米粒子浓度为1mg/ml的反应体系。
41.日光照射下上述反应体系中pet的酶降解：
42.将pet剪成直径为6mm的圆片进行塑料降解实验。在室温条件下(25℃)，取pet薄膜浸没到1ml上述降解反应体系中，在光照(1kw/m2)条件下进行降解反应。同时设置对照组，以1ml酶量相同的游离durapetase(500μg/ml)在光照条件下进行4h的pet的降解。反应4h之后取样品进行灭活处理，然后离心取上清进行hplc检测，确定产物单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(mhet)和对苯二甲酸(tpa)的总量。
43.实施例4：
44.配置浓度为2mg/ml的fe3o4纳米粒子溶液，同时配置浓度为20μg/ml的durapetase溶液，将两者进行物理混合，得到durapetase浓度为10μg/ml，fe3o4纳米粒子浓度为1mg/ml的反应体系。
45.日光照射下上述反应体系中pet的酶降解：
46.将pet剪成直径为6mm的圆片进行塑料降解实验。在室温条件下(25℃)，取pet薄膜浸没到1ml上述降解反应体系中，在光照(1kw/m2)条件下进行降解反应。同时设置对照组，以1ml酶量相同的游离durapetase(10μg/ml)在光照条件下进行4h的pet的降解。反应4h之后取样品进行灭活处理，然后离心取上清进行hplc检测，确定产物单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(mhet)和对苯二甲酸(tpa)的总量。
47.实施例5-7，以实施例1合成的fe3o4纳米粒子和durapetase配置共价交联反应体系。
48.实施例5：
49.取4mg fe3o4、5mg edc和4mg nhs分散到2ml mes(ph，5.5)缓冲液中，在25℃的空气摇床以150rpm的转速中反应40min中实现fe3o4表面羧基的活化，然后利用磁分离回收活化的fe3o4纳米粒子，将其分散到2ml含有0.1mg/ml durapetase的pb(50mm，ph 7.5)缓冲液中，然后在4℃，120rpm的条件下反应4h，然后通过离心和磁柱将固定化酶分离反应体系，利用bradford测量固定化前后反应液上清液中的蛋白质的浓度，通过物料守恒原理能够得出结论，制备的固定化durapetase的酶载量为45.2μg/mg fe3o4。然后将固定化后的酶配置成fe3o4纳米粒子的浓度为1mg/ml，含酶量为45.2μg/ml的反应体系。
50.日光照射下上述反应体系中pet的酶降解：
51.将pet剪成直径为6mm的圆片进行塑料降解实验。在室温条件下(25℃)，取pet薄膜浸没到1ml上述降解反应体系中，在光照(1kw/m2)条件下进行降解反应。同时设置对照组，以1ml酶量相同的游离durapetase(45.2μg/ml)在光照条件下进行4h的pet的降解。反应4h之后取样品进行灭活处理，然后离心取上清进行hplc检测，确定产物单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(mhet)和对苯二甲酸(tpa)的总量。
52.结果如图3所示，在光照条件下，含有fe3o4纳米粒子的共价交联反应体系温度能够从25℃上升到46℃，4h之后产物量达到30.9μm。而游离酶反应体系温度仅仅从25℃上升到29.5℃，并且4h内没有任何产物的生成。这证明将fe3o4纳米粒子同durapetase共价交联使用有助于增强在日光下条件下pet的酶降解。
53.实施例6：
54.首先取4mg fe3o4、8mg edc和6mg nhs分散到2ml mes(ph，5.5)缓冲液中，在25℃的空气摇床以150rpm的转速中反应40min中实现fe3o4表面羧基的活化，然后利用磁分离回收活化的fe3o4纳米粒子，将其分散到2ml含有0.08mg/ml durapetase的pb(50mm，ph 7.5)缓冲液中，然后在3℃，50rpm的条件下反应5h，然后通过离心和磁柱将固定化酶分离反应体系，利用bradford测量固定化前后反应液上清液中的蛋白质的浓度，通过物料守恒原理能够得出结论，制备的固定化durapetase的酶载量为24.3μg/mg fe3o4。然后将固定化后的酶配置成fe3o4纳米粒子的浓度为1mg/ml，含酶量为24.3μg/ml的反应体系。
55.日光照射下上述反应体系中pet的酶降解：
56.将pet剪成直径为6mm的圆片进行塑料降解实验。在室温条件下(25℃)，取pet薄膜
浸没到1ml上述降解反应体系中，在光照(1kw/m2)条件下进行降解反应。同时设置对照组，以1ml酶量相同的游离durapetase(24.3μg/ml)在光照条件下进行4h的pet的降解。反应4h之后取样品进行灭活处理，然后离心取上清进行hplc检测，确定产物单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(mhet)和对苯二甲酸(tpa)的总量。
57.实施例7：
58.首先取4mg fe3o4、2mg edc和2mg nhs分散到2ml mes(ph，5.5)缓冲液中，在25℃的空气摇床以150rpm的转速中反应40min中实现fe3o4表面羧基的活化，然后利用磁分离回收活化的fe3o4纳米粒子，将其分散到2ml含有0.4mg/ml durapetase的pb(50mm，ph7.5)缓冲液中，然后在10℃，150rpm的条件下反应1h，然后通过离心和磁柱作用将固定化酶分离反应体系，利用bradford测量固定化前后反应液上清液中的蛋白质的浓度，通过物料守恒原理能够得出结论，制备的固定化durapetase的酶载量为23.9μg/mg fe3o4。然后将固定化后的酶配置成fe3o4纳米粒子的浓度为1mg/ml，含酶量为23.9μg/ml的反应体系。
59.日光照射下上述反应体系中pet的酶降解：
60.将pet剪成直径为6mm的圆片进行塑料降解实验。在室温条件下(25℃)，取pet薄膜浸没到1ml上述降解反应体系中，在光照(1kw/m2)条件下进行降解反应。同时设置对照组，以1ml酶量相同的游离durapetase(23.9μg/ml)在光照条件下进行4h的pet的降解。反应4h之后取样品进行灭活处理，然后离心取上清进行hplc检测，确定产物单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(mhet)和对苯二甲酸(tpa)的总量。
61.综上所述，本发明开发了一种新型的提高pet降解酶对pet降解能力的方法。利用fe3o4的在日光条件下的光热能力，能够将pet降解酶的反应体系温度由常温(25℃)增加到46℃，从而有效的提升了pet降解酶在自然条件下的pet降解能力。另外固定化在fe3o4上的durapetase较游离酶具备更好的稳定性和循环使用稳定性，更加利于工业化实际应用。
62.本发明提出fe3o4纳米粒子介导的日光促进废弃pet高效酶降解的方法，已通过现场较佳实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。