一株马冠状病毒ECoV464693及其应用的制作方法

一株马冠状病毒ecov464693及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株马冠状病毒ecov464693及其应用，属于马冠状病毒疫苗试剂领域。


背景技术：

2.冠状病毒在系统分类上属套式病毒目（nidovirales）冠状病毒科（coronaviridae）冠状病毒属（coronavirus）。冠状病毒属的病毒是具囊膜（envelope）、基因组为线性单股正链的rna病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒基因组5
′
端具有甲基化的帽状结构，3
′
端具有poly(a)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知rna病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。 冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60～200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。
3.动物冠状病毒包括哺乳动物冠状病毒和禽冠状病毒。哺乳动物冠状病毒主要为α、β属冠状病毒，可感染蝙蝠、猪、犬、猫、鼠、牛、马等多种动物。禽冠状病毒主要来源于γ、δ属冠状病毒，可感染如鸡、麻雀、鸭、鹅、鸽子等多种禽鸟类。马冠状病毒引发马属动物幼驹和成年动物以发烧和腹泻为主要症状的疾病，严重时可导致幼驹死亡，死亡率高达60%；国内外尚无安全有效马冠状病毒疫苗。


技术实现要素：

4.针对国内外尚无安全有效马冠状病毒疫苗的问题，本发明提供了一种免疫原性强的ecov464693株；还提供了所述ecov464693株的应用。
5.本发明的技术方案如下：一种马冠状病毒ecov464693株，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.上述马冠状病毒ecov464693株在制备灭活疫苗和弱毒疫苗中的应用。
7.优选地，所述的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）取病毒株接种于vero细胞，扩繁病毒，收集病毒液，经甲醛灭活后，得灭活病毒液；灭活疫苗中病毒含量≥10
6 tcid
50
/ml；（2）将步骤（1）灭活病毒液与氢氧化铝佐剂混合配置成灭活铝胶疫苗；或者，以灭活病毒液为水相，以206佐剂为油相，制备成油乳剂灭活疫苗；灭活疫苗中病毒含量≥10
6 tcid
50
/ml。
8.优选地，所述的弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤为：取病毒株接种于vero细胞，培养，从20代起进行蚀斑纯化，蚀斑纯化连续进行3次；以克隆毒22代为弱毒病毒液，将弱毒病毒液与冻干保护剂混合后，即为马冠状病毒弱毒活疫苗；弱毒疫苗中病毒含量≥10
5 tcid
50
/ml。
9.本发明的有益效果
马冠状病毒ecov464693株对马属动物有较强的致病性，同时具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活油乳剂疫苗安全可靠，免疫后能够产生较强免疫力，接种马属动物群体发病率和死亡率明显减少，能够有效的预防马冠状病毒的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。
附图说明
10.图1为实施例1得到的病毒的电镜图。
具体实施方式
11.实施例1马冠状病毒ecov464693株的制备细胞培养用培养基，即，10%胎牛血清的rpmi 1640；其配制：取500ml液体rpmi 1640培养基，按照10%的体积加入胎牛血清，充分混匀后备用。
12.病毒培养用培养基，即，含有0.25ug/ml tpck胰酶的无血清rpmi 1640；其配制：取500ml液体rpmi 1640培养基，按照0.25ug/ml终浓度的加入tpck胰酶，充分混匀后备用。
13.1.1 ecov的分离纯化及传代方法从山东省聊城地区某马场送检的病料中，收集ecov检测结果为阳性马肠道组织及内容物，剪刀剪碎后，12000r/min，离心2min，取上清，0.22μm滤膜过滤。将过滤后病料上清按照0.5 ml/10cm2的比例接种hct-8细胞，感作1.5h后，加入10ml病毒培养用培养基，置于37℃，5%（体积百分数，下同）co2的培养箱中约72-120h，待细胞出现显著病变后，将含病毒的细胞培养物及上清反复冻融两次，分装后于-80℃保存。
14.将已培养的病毒按照1ml/75cm2的比例接种hct-8细胞，感作1.5h后，加入15ml病毒培养用培养基，置于37℃，5%co2的培养箱中约72-120h，待细胞出现显著病变后收取病毒，即为本发明的马冠状病毒ecov464693株。
15.1.2 ecov464693株序列测定1.2.1引物设计：根据ecov毒株（nc99）的序列，将该病毒基因组分为21个片段进行扩增，引物序列如下：引物名称 序列ecov-1f ggaccgtgttattcaagatgc，如seq id no.2所示；ecov-1r cacatcgctgcctccaaag，如seq id no.3所示；ecov-2f catttactgtttgttcagatggctt，如seq id no.4所示；ecov-2r tgagatgtcgcttgccattc，如seq id no.5所示；ecov-3f tgtacctaaagcaacgcgca，如seq id no.6所示；ecov-3r acggcacatatcgagtggt，如seq id no.7所示；ecov-4f cctgcagattggcgcatagt，如seq id no.8所示；ecov-4r gcgctgcaggattcaacttc，如seq id no.9所示；ecov-5f tgttaggaggtatgaaagagggt，如seq id no.10所示；ecov-5r ctgtaggctgaataggccgt，如seq id no.11所示；ecov-6f gtagtacgatcgtcggtggc，如seq id no.12所示；ecov-6r cgttctgcataagcccctct，如seq id no.13所示；
ecov-7f tgctgatggagtgcagtgtta，如seq id no.14所示；ecov-7r ccaacagatccacaagatccg，如seq id no.15所示；ecov-8f gcctttcatgtgactatgcgt，如seq id no.16所示；ecov-8r tgcgtaatcgtcgcaaactt，如seq id no.17所示；ecov-9f gttgtggcagtattgtagcact，如seq id no.18所示；ecov-9r cgagacgggcatctacactc，如seq id no.19所示；ecov-10f gtgcaaattacgcggcaagt，如seq id no.20所示；ecov-10r tgccggtatacacccaccat，如seq id no.21所示；ecov-11f ccatggtggacattaagcagtt，如seq id no.22所示；ecov-11r atcctggtgcgttacacacat，如seq id no.23所示；ecov-12f gagtgttggagcttgcgttg，如seq id no.24所示；ecov-12r gcgctgaatctacggtttgg，如seq id no.25所示；ecov-13f ggcgttacaacacatgagagtt，如seq id no.26所示；ecov-13r ggctgccctagaaaagggatt，如seq id no.27所示；ecov-14f ggtttgtgtatgttttggaactgc，如seq id no.28所示；ecov-14r gcaaagtaactggcttcccg，如seq id no.29所示；ecov-15f tcagttcatgctttggtgtaacg，如seq id no.30所示；ecov-15r gcttgctccatgcatcatcatc，如seq id no.31所示；ecov-16f ggtgctgaaaaggttgatggt，如seq id no.32所示；ecov-16r acagcaaaagcggtaggtaga，如seq id no.33所示；ecov-17f gtgtatgaccccttacccatt，如seq id no.34所示；ecov-17r tacctacacaggttgcacca，如seq id no.35所示；ecov-18f ctggaacaggcggtatggtt，如seq id no.36所示；ecov-18r gcagatgttgcagccaaagt，如seq id no.37所示；ecov-19f agtaaggttgtctgatgttggct，如seq id no.38所示；ecov-19r tcctctcaggtctccagatgt，如seq id no.39所示；ecov-20f taagacctgcctttgtgggtt，如seq id no.40所示；ecov-20r ctggtcggcccatttaagga，如seq id no.41所示；ecov-21f ggcgataatagtggctttgctg，如seq id no.42所示；ecov-21r tcccttatggcacttgtcgg，如seq id no.43所示。
16.1.2.2 病毒rna的提取及一步法rt-pcr扩增a)取1.1的病毒培养液0.2 ml，加入0.5 ml裂解液，涡旋震荡10 sec，12000r/min 离心2 min；b)加入0.6 ml洗液，12000r/min 离心1 min，弃滤液；c)重复1次步骤b；d)12000r/min空离2 min；e)加入适量洗脱液，室温静置1min，12000r/min离心1 min；f)使用引物列表中的引物，按照一步法rt-pcr试剂盒说明书进行扩增；扩增产物序列如seq id no.1所示。
17.实施例2马冠状病毒ecov464693株在制备的马冠状病毒灭活疫苗中的应用取马冠状病毒ecov464693株，接种于vero细胞扩繁病毒，收集病毒液，经甲醛灭活后，与氢氧化铝佐剂混合配置成灭活铝胶疫苗。操作步骤如下：2.1毒种选择制苗毒种为ecov464693株，对马有较强的致病性，0.1ml病毒液（104tcid
50
）经口腔攻毒幼驹即可导致能够80%的幼驹发病。ecov464693株的免疫原性良好，最低免疫剂量应≥2.0
×
106tcid
50
。
18.2.2生产用毒种的制备2.2.1一级生产种子繁殖取ecov464693株，按照0.5ml/75cm2的比例接种vero胞，病毒感作1.5h后更换病毒培养用培养基并置于37℃ 5%（体积百分数）co2的环境中培养，待80%细胞出现明显病变后，收取培养液，并将培养液中病毒含量调整至10
6 tcid
50
/ml。经纯粹检验合格后，作为一级生产种子。
19.2.2.2 二级生产种子的繁殖取一级生产种子按照5%的接种量接种于vero细胞，于37℃ 5%co2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液。经纯粹检验合格后，作为二级种子。
20.2.3 制苗病毒液的制备将二级种子按照5%的接种量接种于vero细胞，于37℃ 5%co2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液并进行纯粹检验和病毒滴度测定。纯粹检验和病毒滴度测定均按照《中华人民共和国兽药典》附录进行。每批制苗用病毒液均纯粹，无其他病毒生长，且调整毒价至2
×
10
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50
/ml。
21.2.4 病毒液的灭活用不同浓度的甲醛对病毒液进行灭活：向病毒液中加入甲醛溶液分别至终浓度 （v/v）为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，将其置于37℃灭活，期间每隔4 h～6h振摇一次。灭活6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h和48 h时取样检测，观察是否灭活完全。三组平行试验结果均显示0.3%和0.4%甲醛溶液灭活病毒液24 h时均未检出活病毒，如表1所示。因此，病毒液的灭活方法选用终浓度为0.3%甲醛溶液37℃灭活24 h，期间每隔4 h～6 h振摇一次。灭活病毒液经检验无菌生长为合格，以该灭活病毒液作为制苗用抗原。
22.表1不同浓度甲醛灭活ecov464693株时病毒活性的检测
注：“＋”存在活病毒；“－”无活病毒。
23.2.5 免疫佐剂的筛选2.5.1油苗的制备取病毒液96份（所述份为重量份，下同）加入4份吐温混匀作为水相，取isa206混合，121℃灭菌30 min后作为油相。按水相与油相1:1（体积比）进行乳化制备油乳剂灭活疫苗。成品疫苗中含病毒量10
6 tcid
50
/ml。将疫苗取样进行无菌检验，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行，无细菌、霉菌生长。
24.2.5.2 铝胶疫苗的制备取20 g铝胶加入100 ml灭菌蒸馏水中，搅拌至完全溶解，121℃高压灭菌1 h配制成20%的铝胶，按体积比1:2加入灭活病毒液中，混匀后，2～8℃静置2天～3天，抽弃上清约浓缩成全量的三分之二，分装保存。成品疫苗中含病毒量10
6 tcid
50
/ml。将疫苗取样进行无菌检验，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行，无细菌、霉菌生长。
25.2.5.3安全检验分别对5匹怀孕母马于产前5周、产前2周注射油苗、铝胶疫苗和pbs 5ml。注射后连续观察2周，结果免疫后绝大部分马的精神、体温、食欲均正常，但油苗组注射部位到试验结束仍稍有肿胀，疫苗吸收不良，铝胶苗组无肿胀和坏死，无其他不良反应。
26.2.5.4 效力检验待母马生产后，取5日龄的幼驹5匹，分别按照10
4.0 tcid50的剂量进行攻毒，连续观察1周，记录体温变化和临床表现，剖检后观察病理变化。
27.油苗组：1匹幼驹攻毒后厌食，精神沉郁，体温升高（＞40.5℃），于攻毒后第2天出现腹泻症状，剖解后发现小肠变薄，另外4匹体温变化不大，食欲正常，剖检后无典型变化。该组疫苗的保护率为80%。
28.铝胶苗组：5匹幼驹体温、食欲均无异常，剖检后各器官均无异常变化。该组疫苗的保护率为100%。
29.对照组：5匹幼驹体温均升高（＞40.5℃），食欲明显减退，精神沉郁，被毛粗乱，伴有腹泻症状。3匹于试验过程中死亡，剖检后发现小肠壁变薄，呈半透明状。
30.综上所述，油苗和铝胶苗均能为幼驹提供保护，但铝胶苗的保护效果要强于油苗。
31.实施例3 ecov464693株在制备马冠状病毒弱毒疫苗的应用取ecov464693株，在vero细胞系传代培养，从20代（总代次48代）起进行蚀斑纯化，
蚀斑纯化连续进行3次。以克隆毒22代（总代次70代）制备马冠状病毒弱毒疫苗。
32.2.1毒种选择制苗毒种为ecov464693株，经vero细胞传代后，ecov464693毒株 f70代对幼驹致病力丧失，但保留良好的免疫原性。最低免疫剂量应≥2.0
×
10
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50
。
33.2.2生产用毒种的制备2.2.1一级生产种子繁殖取ecov464693株，将其f68代病毒按照0.5ml/ 75cm2的比例接种vero细胞，病毒感作1.5h更换病毒培养用培养基并置于37℃ 5%（体积百分数）co2的环境中培养，待80%细胞出现明显病变后，收取培养液，并将培养液中病毒含量调整至10
6 tcid
50
/ml。经纯粹检验合格后，作为一级生产种子。
34.2.2.2 二级生产种子的繁殖取一级生产种子按照5%的接种量接种于vero细胞，于37℃ 5%co2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液。经纯粹检验合格后，作为二级种子。
35.2.3 制苗病毒液的制备将二级种子按照5%的接种量接种于vero细胞，于37℃ 5%co2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液并进行纯粹检验和病毒滴度测定。纯粹检验和病毒滴度测定均按照《中华人民共和国兽药典》附录进行。每批制苗用弱毒病毒液均纯粹，无杂病毒生长；将弱毒病毒液与与冻干保护剂混合后，且调整毒价至10
5 tcid
50
/ml，分装、冻干，保存于-15~-20℃，即为马冠状病毒弱毒活疫苗。
36.2.5 ecov弱毒疫苗安全、效力的检验2.5.1安全检验分别对5匹怀孕母马于产前5周、产前2周肌肉注射弱毒疫苗和pbs 5ml。注射 后连续观察2周，结果免疫后绝大部分马的精神、体温、食欲均正常，且疫苗注射部位无其他不良反应。取5日龄的ecov抗原抗体双阴性的健康幼驹，经口服和肌肉注射ecov弱毒疫苗5ml。免疫后连续观察2周，幼驹在精神、体温、食欲等方面均正常，无任何腹泻症状。
37.2.5.2 效力检验待母马生产后，取5日龄的幼驹5匹，分别按照10
4 tcid
50
的剂量进行攻毒，连续观察1周，记录体温变化和临床表现，剖检后观察病理变化。
38.弱毒疫苗免疫组：5匹幼驹体温、食欲均无异常，剖检后各器官均无异常变化。该组疫苗的保护率为100%。
39.对照组：5匹幼驹体温均升高（＞40.5℃），食欲明显减退，精神沉郁，被毛粗乱，出现腹泻症状，3头于试验过程中死亡，剖检后发现小肠壁变薄，呈半透明状。
40.综上所述，弱毒疫苗免疫母马后产生的抗体可以经过乳汁传递给幼驹，使幼驹被动获得抵抗ecov感染的能力。