一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂的制作方法

一种用于抑制二化螟钻蛀行为的rna制剂
技术领域
1.本发明提供一种用于抑制二化螟钻蛀行为的rna制剂，具体涉及二化螟表皮蛋白lcp16/17基因、靶向dsrna的合成和应用，属于属于农业生物技术领域。
技术背景
2.二化螟chilo suppressalis属鳞翅目，螟蛾科，蛀食水稻茎秆，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，主要分布于我国长江流域及其以南的稻区。长期以来主要以化学防治为主，但农药的大量使用导致抗药性以及农药残留等问题日益严重。因此，迫切需要开发新型高效的防治方法。
3.昆虫表皮是抵御外来物的第一道屏障，防止体内水分散失，保护其免受外界病原物以及有害物质的侵害。表皮的化学成分主要为脂类，蛋白质和几丁质，表皮蛋白存在于上表皮层和原表皮层，上表皮层由脂类和蛋白质交联形成，不含有几丁质，几丁质仅存在于原表皮层，并与表皮蛋白交联形成原表皮层。因此，表皮蛋白是一个潜在的靶标位点。
4.rna干扰技术是一种较为普遍的实验技术，通过递送dsrna，特异沉默目的基因，进行基因的功能研究，也是疾病治疗与农业害虫防治的热门方向。纳米材料可以携带dsrna突破体壁，基因干扰效率高，而且纳米载体对非靶标生物安全。因此，本发明采用rnai技术，通过点滴体表，特异沉默二化螟表皮蛋白lcp16/17，发现二化螟钻蛀行为改变，显著减少了钻蛀行为的发生，对二化螟的防治具有重要作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供了一种用于抑制二化螟钻蛀行为的rna制剂，首先提供了二化螟lcp16/17基因，然后根据二化螟lcp16/17基因设计并合成其对应的靶向dsrna。将dsrna与纳米载体混合，挑选生长状态一致的幼虫，通过点滴法将dsrna递送到体内。结果表明，二化螟表皮蛋白基因lcp16/17在mrna水平的表达显著降低，幼虫的钻蛀行为显著减少，该结果对绿色防控二化螟提供了新的方法与思路。
6.本发明是这样实现的：一种用于抑制二化螟钻蛀行为的rna制剂，其特征是，包括以下步骤：步骤（1）、根据已知昆虫cpr家族蛋白序列保守区（motif），运用生物信息学分析方法在二化螟转录组数据库中搜索，得到lcp16/17基因片段；步骤（2）、根据已知的lcp16/17基因片段，使用primer premier 5.0软件设计上游引物seq id no.3和下游引物seq id no.4；seq id no.3:atgaaatcgatcgtattaat；seq id no.4:ttattggacctttgggatgg；步骤（3）、提取二化螟三龄幼虫的总rna并反转录成cdna模板；步骤（4）、经pcr扩增反应获得二化螟表皮蛋白基因lcp16/17序列，过程为：使用步骤（3）得到的cdna模板，以seq id no.3为上游引物、seq id no.4为下游引
物，通过pcr扩增获得表皮蛋白基因lcp16/17全长片段；通过minibest agarose gel dna extraction kit（takara）将上述pcr产物纯化，将纯化后的产物连接到peasy
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t3 cloning kit（transfer 公司）,转入感受态细胞中，复苏，涂板，挑菌检测后，将菌液送往擎科生物（中国）有限公司测序，得到二化螟表皮蛋白基因lcp16/17序列；该二化螟表皮蛋白基因lcp16/17的核苷酸序列为330bp，其核苷酸序列为seq id no.1，二化螟表皮蛋白基因lcp16/17对应的氨基酸序列为seq id no.2所示序列；步骤（5）、根据已知二化螟表皮蛋白基因lcp16/17的核苷酸序列，通过primer 5.0软件设计含有t7启动子的上游引物seq id no.6和下游引物seq id no.7；seq id no.6:taatacgactcactatagggcagcgagttcgaccaacaac；seq id no.7:taatacgactcactataggggcgtggtatccggtctcatc；步骤（6）、以步骤（3）获得的cdna模板，用上述合成的含有t7启动子序列的上游引物seq id no.6和下游引物seq id no.7进行pcr扩增；得到一段长度为216bp基因片段；经试剂盒纯化后按照transcriptaid t7 high yield transcription kit（thermo fisher scientific）试剂盒说明体外转录合成得到二化螟表皮蛋白基因lcp16/17的靶向dsrna；得到二化螟表皮蛋白基因lcp16/17的靶向dsrna，该靶向dsrna的核苷酸序列为seq id no.5所示序列；步骤（7）、将高效树突化聚合纳米载体与dsrna混合，得到用于抑制二化螟钻蛀行为的rna制剂；rna制剂中，dsrna与纳米载体的电荷比为1:1
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1:200之间。
7.高效树突化聚合纳米载体是按照jessica a. kretzmann, cameron w. evans, marck norret, pilar blancafort, k. swaminathan iyer于2018年发表在methods in molecular biology（分子生物学方法）1767卷上的文章“non
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viral methodology for efficient co
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transfection.（高效共转染的非病毒方法学）”所述方法合成高效树突化聚合纳米载体。
8.步骤（3）中，提取二化螟三龄幼虫的总rna并反转录成cdna模板的制备过程如下：选取生长健康、大小一致的三龄二化螟幼虫，放入液氮冷冻；依照takara trizol试剂盒提取总rna，并使用m
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mlv反转录酶将所提取的总rna反转录成第一链cdna，从而获得pcr反应所需cdna模板。
9.步骤（4）中，得到的二化螟表皮蛋白基因lcp16/17序列，该氨基酸序列是对seq id no.1进行生物信息学分析后预测得到；生物信息学分析表明二化螟表皮蛋白基因lcp16/17编码110个氨基酸，预测等电点为5.24，蛋白分子量为27.0kda。
10.步骤（4）中，pcr体系为：2
×
fast taq酶 12.5 μl， forward primer 1μl，reverse primer 1 μl，cdna 1μl，ddh2o 9.5μl，总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸10min，pcr产物置于
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20℃冰箱保存。
11.步骤（6）中，pcr扩增的体系为：2
×
fast taq酶 25μl， forward primer 2 μl ，reverse primer 2μl ，cdna 1μl， ddh2o 20μl，总体积为50μl；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min；
采用minibest agarose gel dna extraction kit（takara）将上述pcr产物纯化，按照transcriptaid t7 high yield transcription kit（thermo fisher scientific）试剂盒说明体外转录合成dsrna（dscslcp16/17），并用nanophotometer微量分光光度计检测dsrna浓度，保存于超低温冰箱备用。
12.一种用于抑制二化螟钻蛀行为的rna制剂在防控二化螟的应用，其特征是，将dslcp16/17与纳米载体混合，通过点滴体表递送到二化螟体内，采用不靶向二化螟任何基因的dsegfp和空白对照组作为dslcp16/17的阴性对照；选取45头生长健康、大小一致的一龄幼虫进行实验；每个处理组2.5μg dslcp16/17，将dslcp16/17与纳米载体按比例混合，室温孵育15min，将混合液滴到幼虫背部，处理15min，每48h处理一次，连续处理三次，设置三个生物重复，每个生物重复15头虫；同时选取90头虫设立dsrna对照组和空白对照组，dsegfp与纳米载体的用量与处理组相同，同样设置三个生物重复，每个生物重复15头虫；将处理后的二化螟置于28℃恒温培养箱中饲养，培养箱中，光照：黑暗时间=16h：8h，温度28
±
1℃，相对湿度70
±
5%，处理和对照组每天饲喂新鲜的人工饲料；每天观察二化螟幼虫生长发育状况，统计二化螟幼虫钻蛀饲料的情况；干扰后24h提取处理组和对照组的二化螟虫体总rna，其中，对照组包括dsegfp对照组和空白对照组，takara反转录试剂盒合成cdna，采用real
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timepcr方法分别检测目的基因cslcp16/17和管家基因ef1
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a的相对表达量，计算其沉默效率；与对照组相比，纳米载体经皮递送dslcp16/17显著抑制了lcp16/17基因的表达量；表明该dsrna片段可显著沉默靶基因cslcp16/17的表达水平，dsrna片段有效，可用于后续研究；观察点滴处理后的二化螟生长情况，统计钻蛀情况，与对照组相比，点滴rnai处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低46.3%；与对照组基因egfp dsrna相比，点滴rnai处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低29%。因此，rna干扰序列及基于纳米载体的点滴rnai方法可应用于二化螟的绿色防控。
13.步骤（7）中，dsrna与纳米载体的电荷比比例为1:64；使用时，采取点滴二化螟体表的方法，将干扰lcp16/17基因的rna制剂递送至二化螟体内，点滴处理二化螟一龄幼虫，连续处理4次，每48h处理一次，观察二化螟幼虫生长发育状况，统计二化螟幼虫钻蛀饲料的情况。
14.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：由以上技术方案可知，本发明首先从二化螟中克隆二化螟表皮蛋白基因lcp16/17，并对二化螟表皮蛋白基因lcp16/17设计引物，合成了用于干扰二化螟表皮蛋白基因lcp16/17的dsrna，并创建了使用纳米载体递送dsrna的体系，通过点滴体表将dsrna递送到虫体内对二化螟表皮蛋白基因lcp16/17进行干扰。结果表明：dsrna注射二化螟后，发现二化螟钻蛀行为改变，显著减少了钻蛀行为的发生，对二化螟的防治具有重要作用。本发明为害虫的分子调控提供了新的方法，也为深入理解昆虫生长发育机制、创制新的生物农药制剂提供理论基础。
附图说明
15.图1为显示点滴lcp16/17基因的dsrna后，二化螟lcp16/17基因的沉默效率；其中，
dslcp16/17表示点滴lcp16/17基因dsrna的处理组；dsegfp表示点滴egfp基因dsrna的对照组；ck表示空白对照组；图2为显示点滴lcp16/17基因的dsrna对二化螟钻蛀行为的改变；其中，dslcp16/17表示点滴lcp16/17基因dsrna的处理组；dsegfp表示点滴egfp基因dsrna的对照组；ck表示空白对照组。
具体实施方式
16.下面结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行具体、详细的说明，但并不用以限制本发明。
17.实施例1二化螟表皮蛋白基因lcp16/17（cslcp16/17）cdna全长序列获得及其氨基酸序列分析；1、二化螟表皮蛋白基因lcp16/17cdna片段获得；根据已知昆虫cpr家族蛋白序列保守区（motif），运用生物信息学分析方法在二化螟转录组数据库中搜索，得到lcp16/17基因片段。
18.2、二化螟表皮蛋白基因lcp16/17cdna全长序列获得；1）pcr扩增所需引物设计；根据已知的lcp16/17基因片段，使用primer 5.0软件设计上游引物seq id no.3和下游引物seq id no.4，引物由擎科生物（中国）有限公司合成。
19.2）pcr扩增所需模板制备；选取生长健康、大小一致的三龄二化螟幼虫，放入液氮冷冻。依照takara trizol试剂盒提取总rna，并使用m
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mlv反转录酶将所提取的总rna反转录成第一链cdna，从而获得pcr反应所需模板。
20.3）pcr扩增反应采用前面步骤获得的模板和引物，通过pcr扩增获得表皮蛋白基因lcp16/17全长片段。
21.pcr体系为：2
×
fast taq酶 12.5 μl， forward primer 1μl ，reverse primer 1 μl ，cdna 1 μl， ddh2o 9.5 μl，总体积为25 μl。
22.反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸10min，pcr产物置于
‑
20℃冰箱保存。
23.通过minibest agarose gel dna extraction kit（takara）将上述pcr产物纯化，将纯化后的产物连接到peasy
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t3 cloning kit（transfer 公司）,转入感受态细胞中，复苏，涂板，挑菌检测后，将菌液送往擎科生物（中国）有限公司测序，得到二化螟表皮蛋白基因lcp16/17核苷酸序列为seq id no.1所示的序列。
24.3、二化螟表皮蛋白基因lcp16/17氨基酸序列分析；利用在线软件expasy分析结果显示，cslcp16/17编码110个氨基酸，预测等电点为5.24，蛋白分子量为27.0kda。测序得到氨基酸序列为seq id no.2所示的序列。
25.实施例2二化螟表皮蛋白基因lcp16/17的靶向dsrna的合成：
1、二化螟表皮蛋白基因lcp16/17靶向dsrna引物的设计；基于二化螟表皮蛋白基因lcp16/17序列，运用primer 5.0软件设计其靶向dsrna引物，在引物5’端加上t7启动子。引物的序列如下：seq id no.6：taatacgactcactatagggcagcgagttcgaccaacaacseq id no.7：taatacgactcactataggggcgtggtatccggtctcatc2、二化螟表皮蛋白基因lcp16/17特异性dsrna合成；以前面步骤获得cdna为模板，用上述合成的含有t7启动子序列的上下游引物进行pcr扩增。得到一段长度为216bp基因片段（seq id no.5）。
26.pcr扩增的体系为：2
×
fast taq酶 25μl， forward primer 2 μl ，reverse primer 2μl ，cdna 1μl， ddh2o 20μl，总体积为50μl。
27.反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。
28.采用minibest agarose gel dna extraction kit（takara）将上述pcr产物纯化，按照transcriptaid t7 high yield transcription kit（thermo fisher scientific）试剂盒说明体外转录合成dsrna（dscslcp16/17），并用nanophotometer微量分光光度计检测dsrna浓度，保存于超低温冰箱备用。
29.实施例3一种dslcp16/17在防控二化螟的应用，为了验证本发明制备的dslcp16/17对lcp16/17基因的干扰效果，将dslcp16/17与纳米载体混合，通过点滴体表递送到二化螟体内。采用不靶向二化螟任何基因的dsegfp和空白对照组作为dslcp16/17的阴性对照。
30.选取45头生长健康、大小一致的一龄幼虫进行实验。每个处理组2.5μg dslcp16/17，将dslcp16/17与纳米载体按比例混合，室温孵育15min，将混合液滴到幼虫背部，处理15min，每48h处理一次，连续处理三次，设置三个生物重复，每个生物重复15头虫；同时选取90头虫设立dsrna对照组和空白对照组，dsegfp与纳米载体的用量与处理组相同，同样设置三个生物重复，每个生物重复15头虫。将处理后的二化螟置于28℃恒温培养箱中饲养（光照：黑暗时间=16h：8h，温度28
±
1℃，相对湿度70
±
5%），处理和对照组每天饲喂新鲜的人工饲料。每天观察二化螟幼虫生长发育状况，统计二化螟幼虫钻蛀饲料的情况。
31.干扰后24h提取处理组和对照组（dsegfp对照组和空白对照组）的二化螟虫体总rna，takara反转录试剂盒合成cdna，采用real
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timepcr方法分别检测目的基因(cslcp16/17)和管家基因(ef1
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a)的相对表达量，计算其沉默效率。
32.如图1所示，与对照组相比，纳米载体经皮递送dslcp16/17显著抑制了lcp16/17基因的表达量。表明该dsrna片段可显著沉默靶基因(cslcp16/17)的表达水平，dsrna片段有效，可用于后续研究。
33.观察点滴处理后的二化螟生长情况，统计钻蛀情况，如图2所示，与对照组相比，点滴rnai处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低46.3%；与对照组基因egfp dsrna相比，点滴rnai处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低29%。因此，本发明提供的rna干扰序列及基于纳米载体的点滴rnai方法可应用于二化螟的绿色防控。