一种工业制备高纯麦角硫因的方法与流程

1.本发明属于生化制品、食品及医药相关领域，涉及一种工业制备高纯麦角硫因的方法。


背景技术：

2.麦角硫因(l
‑
ergothioneine，egt)是一种稀有天然手性氨基酸类强抗氧化剂，至今唯一被发现的天然2
‑
硫代咪唑氨基酸(2
‑
thio
‑
imidazole)，生理ph环境下主要以硫酮的形式存在，硫羰基的稳定性高于巯基，因此egt不会自发氧化，并具有良好的ph稳定性和热稳定性。麦角硫因具有清除自由基、解毒、维持dna生长、抗辐射、抗衰老等功能，是一种独特的细胞生理保护剂；其次转运体ett的存在使egt成为唯一可以在细胞间运输的抗氧化剂，可以起到保护神经系统、抑制发育性缺陷、保护肝脏等作用。鉴于egt的生理活性，使其在食品、化妆品、医药等领域具有广泛的应用前景。
3.egt的制备方法有三种：化学合成法、天然生物提取法和生物合成法。egt是手性氨基酸，要用化学法合成左旋的egt十分困难，几种合成方法都因局部或全部外消旋而没有达到预期的效果。oxis公司首先研制出了商业化化学合成egt的方法，但合成egt的原料昂贵，合成的成本高。从天然生物中提取egt，存在原料中的egt含量低，杂质多，提取成本高及风俗禁忌等问题，就目前所知，在动物组织猪血中的egt含量较高，也仅达到60mg/l。大型真菌子实体中egt的含量较高，但受原料的成本限制，提取得到的egt价格居高不下。与化学合成法和提取法相比，利用大型食用真菌发酵合成egt不仅生产成本低，原料来源广，且不存在风俗禁忌问题，更重要的是能够保证egt产品的安全性，是目前egt合成技术的主流方向。
4.大型真菌深层发酵合成的麦角硫因绝大部分积累于菌丝体内，必须具备从菌丝体中分离纯化制备麦角硫因的技术，菌丝体处理液具有色值深、菌丝体释放产物复杂、egt质量占比低的特点，一种稳定可持续的工业制备高纯麦角硫因的工艺技术极为迫切。姜文侠等建立的菌丝体中提取麦角硫因方法为菌丝体热水浸提、浸提液超滤、超滤液干燥或浓缩后乙腈溶液溶解超声、hilic柱纯化、收集含egt峰组分，浓缩干燥得到的麦角硫因纯度96
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99％，回收率28
‑
47％(cn104774182a8)。上述纯化方法中采用乙腈溶液为流动相，具有毒性的乙腈在化妆品、食品、医药等领域受到严格限制，其次hilic柱直接纯化浸提超滤浓缩液，大量的色素及杂质会造成hilic填料的污染，严重影响hilic柱的使用寿命，浸提超滤浓缩液的直接进行hilic柱纯化降低了hilic柱的单批次处理量，综合处理批次增多，有机溶剂使用量增加，成本骤增；最后hilic纯化后的干燥样品颜色不一，质量不稳定；综上该方法得到的最终样品限制了麦角硫因产品在主要领域的应用。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，提供了一种工业制备高纯麦角硫因的方法，从菌丝体中大量制备高纯麦角硫因，确保麦角硫因产品质量，尤其适用于麦角硫因的规模化生产，从而满足该产品在食品、化妆品、保健、医药等领域需求。
6.为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种工业制备高纯麦角硫因的方法，包括：
8.1)菌丝体热水处理后固液分离，收集得到含有麦角硫因的料液；
9.2)将含有麦角硫因的料液进行真空浓缩，调节ph 8
‑
10，过滤得到麦角硫因浓缩液；
10.3)将麦角硫因浓缩液分别采用陶瓷膜微滤澄清和中空纤维膜超滤，得到麦角硫因超滤液；
11.4)将麦角硫因超滤液进行阴离子交换树脂脱色、水洗，收集得到麦角硫因脱色液；
12.5)将麦角硫因脱色液进行阳离子交换树脂吸附、水洗、解吸，收集解吸液并浓缩，得到麦角硫因解吸浓缩液；
13.6)将麦角硫因解吸浓缩液进行色谱层析纯化，收集目标峰并浓缩至干，水溶后得到麦角硫因层析样液；
14.7)将麦角硫因层析样液过离子交换树脂脱盐脱色，收集得到麦角硫因脱盐浓缩液；
15.8)将麦角硫因脱盐浓缩液粗结晶和重结晶，烘干，得到高纯麦角硫因晶体粉末。
16.优选地，步骤1)包括：糙皮侧耳cgmcc no.23071的菌丝体发酵液经固液离心分离，离心分离过程中水洗菌丝体，离心后收集菌丝体，菌丝体中加入8
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10倍质量的水，升温至70
‑
90℃，处理20
‑
30min，固液离心分离，分别收集菌丝体和含有麦角硫因的料液。
17.优选地，步骤2)中，按照浓缩倍数5
‑
10倍进行真空浓缩，采用氢氧化钠或氨水调节浓缩液ph至8
‑
10，调节ph后静置10
‑
30min。
18.优选地，步骤3)中，所述陶瓷膜的孔径为0.1μm
‑
0.5μm，优选0.1μm；所述中空纤维膜的截留分子量1kda
‑
6kda，优选3
‑
4kda。
19.优选地，步骤4)中，所述的阴离子交换树脂为苯乙烯系强碱性树脂，优选hz214树脂及d296树脂；水洗体积2
‑
3bv。
20.优选地，步骤5)中，所述的阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂，优选hz001，水洗体积2
‑
3bv；采用氯化铵与氨水缓冲液进行解吸，解吸ph在8
‑
9之间，优选ph8.5
‑
8.8，解吸液液浓度0.2
‑
1mol/l，优选0.5
‑
0.8mol/l；采用真空浓缩收集到的解吸液，温度60
‑
80℃，真空度0.08
‑
0.096mpa，得到的麦角硫因解吸浓缩液中麦角硫因浓度为10g/l
‑
100g/l，优选浓度为40
‑
70g/l。
21.优选地，步骤6)中，采用hilic柱进行色谱层析纯化，hilic柱的填料为直径20
‑
35μm球形颗粒，孔径100埃，填料高度不小于30cm，色谱层析纯化柱包括但不限于层析柱、手动dsc柱、动态轴向dac柱；色谱层析纯化的流动相组成为乙醇
‑
水，流动相比例选择90:10
‑
95:5，乙醇试剂不限于分析纯、色谱纯，优选分析纯乙醇试剂；色谱层析纯化的上样浓度10g/l
‑
90g/l，优选40g/l
‑
60g/l，上样量每100g填料0.15
‑
0.6g麦角硫因。
22.优选地，步骤7)中，脱盐采用三支串联柱组成的脱盐柱，分别为弱碱性大孔离子交换树脂、弱酸性大孔离子交换树脂、弱碱性大孔离子交换树脂，优选弱碱性大孔离子交换树脂为d315、d301树脂，优选弱酸性大孔离子交换树脂为d152、d155树脂。
23.优选地，步骤7)还包括：将收集得到麦角硫因脱盐浓缩液干燥得到麦角硫因粗品，干燥方法可以是但不限于喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。
24.优选地，步骤8)中，采用冷却结晶或溶析结晶方式进行粗结晶和重结晶，所述冷却结晶可以为自然冷却结晶或梯度降温冷却结晶，自然冷却结晶是将麦角硫因脱盐浓缩液放置于0
‑
10℃进行自然冷却结晶，3
‑
5h搅拌一次，静置时间15
‑
48h，晶体洗涤为90％
‑
100％乙醇水溶液，优选结晶温度条件为3
‑
5℃，优选麦角硫因浓度100
‑
160g/l，优选结晶时间24
‑
36小时；梯度降温冷却结晶中麦角硫因脱盐浓缩液的初始浓度为100
‑
160g/l，30
‑
50℃恒温0.5
‑
2h，降温梯度0.1
‑
0.5k/min，降温至1
‑
5℃，养晶时间2
‑
15h，晶体洗涤为90％
‑
100％乙醇水溶液；所述溶析结晶中，麦角硫因脱盐浓缩液的浓度为80
‑
150g/l，流加的有机溶剂为无水乙醇或95乙醇，乙醇流加量为2
‑
6倍体积麦角硫因脱盐浓缩液，养晶时间2
‑
20h，晶体洗涤为90％
‑
100％乙醇水溶液。
25.更优选地，步骤8)中，烘干温度为60
‑
90℃，烘干时间4
‑
12h。
26.本发明的有益效果在于：
27.(1)各步骤工艺实施稳定，容易控制，操作简单，整体回收率高，可大批量工业制备。
28.(2)含有麦角硫因的料液浓缩液调节ph后，有大量沉淀析出，此沉淀的去除方法简单，且增加了后续膜工艺的处理量、减少了膜面积的使用、延长了膜的使用寿命。
29.(3)脱色工艺使得前期超滤料液色值显著降低，并去除大量杂质，对后续离子交换树脂及色谱层析填料降低了死吸附污染，起到了明显的保护作用，增加了这两种填料使用寿命，提高了整体工艺稳定性。
30.(4)离子交换工艺的加入使得绝大多数糖和较大分子量杂质得到去除，氨基酸类小分子物质保留，糖和较大分子量杂质的去除显著增加了麦角硫因浓缩液中麦角硫因的浓度，实验测得离子交换收集浓缩液麦角硫因浓度可达100g/l，不经过离子交换工艺的麦角硫因脱色液或超滤液麦角硫因最高浓缩浓度仅为8g/l。最终导致色谱层析纯化单次处理量显著增加，达到工业化水平，每100g填料可处理0.3
‑
0.6g左右，单次处理量的增加显著降低了色谱层析纯化成本。
31.(5)色谱层析工艺中流动相采用乙醇，工艺稳定，回收率高，与乙腈等其他溶剂相比，成本低、无毒性，可广泛用于化妆品、食品、保健品、药品等领域。
32.(6)脱盐工艺使得麦角硫因层析样液盐分及色素显著去除，显著增加了结晶工艺产品的稳定性，使得最终高纯产品质量纯度高，批次间稳定，最终得到的麦角硫因晶体符合化妆品原料及欧盟食品标准。
具体实施方式
33.本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。相反，本发明不仅要包括这些实施方式，而且还要涵盖其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化。
34.本技术中使用的菌株采用实验室自己筛选获得的糙皮侧耳(pleurotus ostreatus)，名称是fm 2021003。
35.菌株fm 2021003已于2021年07月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为cgmcc no.23071。
36.斜面培养基：pda培养基(becton，dickinson and company)。
37.一级种子罐液体种子培养基：玉米粉40g/l、豆粕粉25g/l、α
‑
淀粉酶54u/l、kh2po
4 5g/l、mgso4·
7h2o 3.5g/l，其余为水，于121℃灭菌20min，50l种子罐装液量20l。
38.二级种子罐液体发酵培养基：甘油40g/l、酪蛋白胨35g/l、kh2po
4 5g/l、mgso4·
7h2o 3.5g/l，其余为水，121℃灭菌20min，500l二级种子罐装液量300l。
39.发酵罐液体发酵培养基：甘油50g/l、酪蛋白胨35g/l、kh2po
4 5g/l、mgso4·
7h2o 3.5g/l，其余为水，121℃灭菌20min，3吨发酵罐装液量2100l。
40.糙皮侧耳(pleurotus ostreatus)cgmcc no.23071菌丝体发酵液采用以下方法制备：挑取斜面培养基菌种的菌苔接入一级种子罐，25℃150rpm培养4天，得到一级种子液。将一级种子液转移至二级种子罐中，25℃150rpm培养3天，将二级种子液转移至3吨发酵罐，25℃150rpm培养12天，得菌丝体发酵液。
41.麦角硫因采用以下检测方法：
42.高效液相色谱法(hplc)，色谱柱为安捷伦zorbax
‑
sb
‑
aq色谱柱，流动相成分的体积比为甲醇∶纯水＝1∶99、使用乙酸、氨水调节ph＝5；检测波长257nm，柱温30℃，进样体积5μl，流速0.7ml/min。
43.实施例1
44.3吨罐菌丝体发酵液，工业离心机分离(分离因素800g)，菌丝体水悬后管路转移至料液罐中，补水至2000l搅拌，90℃处理30min，再次工业离心机分离(分离因素800g)，得到1800l含有麦角硫因的料液；含有麦角硫因的料液双效浓缩至200l，氨水调节浓缩液ph至9，静置30min后管道过滤去除沉淀物，得到麦角硫因浓缩液；麦角硫因浓缩液先后通过0.1μm陶瓷膜和4kd中空纤维膜过滤，得到麦角硫因超滤液180l。
45.将上述得到麦角硫因超滤液通过hz214脱色柱处理，流速1bv/h，水洗体积2bv，收集流穿液得到麦角硫因脱色液300l；麦角硫因脱色液进样至hz001离交层析柱，上样量50％，上样流速1bv/h，水洗体积2bv，解吸液液浓度0.5mol/l，ph 8.0，解吸流速0.1bv/h，监测波长280nm，收集解吸液50l，温度75℃，真空度0.085mpa，解吸液真空浓缩至麦角硫因浓度60g/l，得到麦角硫因解吸浓缩液。
46.色谱层析柱hilic填料装柱高度35cm，直径30cm，单次上样量600ml麦角硫因解吸浓缩液，流动相乙醇：水＝90:10，流速2000ml/min，检测波长和收集波长分别280nm和254nm，收集目标峰，浓缩至干去除乙醇，水复溶后过脱盐串联柱d315
‑
d152
‑
d315处理，流速1bv/h，水洗体积2bv，收集流穿液浓缩得到麦角硫因脱盐浓缩液，麦角硫因脱盐浓缩液经喷雾干燥得到麦角硫因粗品，纯度检测为75.02％，回收率达到60.50％。
47.将上述得到的麦角硫因脱盐浓缩液定容至150g/l，4℃冷库静置放置20h，搅拌摇匀，继续静置10h，抽滤沥干，先后用90％乙醇和无水乙醇洗涤，抽滤沥干，85℃10h烘干，粗结晶母液同种方法处理两次，合并得到麦角硫因粗结晶样品，纯度检测99％。
48.麦角硫因粗结晶样品水溶液复溶以后，定容至135g/l，结晶反应釜搅拌速率200rpm，恒温25℃，无水乙醇滴加量3倍体积，滴加时间5h，养晶时间15h，抽滤沥干，先后用90％乙醇和无水乙醇洗涤，抽滤沥干，85℃10h烘干，重结晶母液同种方法处理一次，合并得到麦角硫因重结晶样品，纯度检测100.51％，整体纯化回收率49.56％。
49.实施例2
50.3吨罐菌丝体发酵液，工业离心机分离，菌丝体水悬后管路转移至料液罐中，补水至2000l搅拌，90℃处理30min，再次工业离心机分离，得到1800l含有麦角硫因的料液；含有麦角硫因的料液双效浓缩至200l，氨水调节浓缩液ph至8.5，静置30min后管道过滤去除沉淀物，得到麦角硫因浓缩液；麦角硫因浓缩液先后通过0.1μm陶瓷膜和4kd中空纤维膜过滤，得到麦角硫因超滤液200l。
51.将上述得到麦角硫因超滤液通过hz214脱色柱处理，流速1bv/h，水洗体积2bv，收集流穿液得到麦角硫因脱色液380l；麦角硫因脱色液进样至hz001离交层析柱，上样量75％，上样流速1bv/h，水洗体积2bv，解吸液液浓度0.5mol/l，ph 8.7，解吸流速0.1bv/h，监测波长280nm，收集解吸液58l，温度60℃，真空度0.08mpa，解吸液真空浓缩至麦角硫因浓度60g/l，得到麦角硫因解吸浓缩液。
52.色谱层析柱hilic填料装柱高度35cm，直径30cm，单次上样量500ml麦角硫因解吸浓缩液，流动相乙醇：水＝90:10，流速2000ml/min，检测波长和收集波长分别280nm和254nm，收集目标峰，浓缩至干去除乙醇，水复溶后过脱盐串联柱d315
‑
d152
‑
d315处理，流速1bv/h，水洗2bv，收集流穿液浓缩得到麦角硫因脱盐浓缩液，麦角硫因脱盐浓缩液经喷雾干燥得到麦角硫因粗品，纯度检测为72.59％，回收率达到59.85％。
53.将上述得到的麦角硫因脱盐浓缩液定容至150g/l，30℃恒温1h，降温速率0.5k/min，降温至4℃，养晶时间8h，抽滤沥干，先后用90％乙醇和无水乙醇洗涤，抽滤沥干，85℃8h烘干，粗结晶母液同种方法处理两次，合并得到麦角硫因粗结晶样品，纯度检测98.98％。
54.麦角硫因粗结晶样品水溶液复溶以后，定容至130g/l，结晶反应釜搅拌速率200rpm，恒温25℃2h，无水乙醇滴加量4倍体积，滴加时间5h，养晶时间15h，抽滤沥干，先后用90％乙醇和无水乙醇洗涤，抽滤沥干，85℃10h烘干，重结晶母液同种方法处理一次得到麦角硫因重结晶样品，纯度检测100.21％，整体回收率52.13％。
55.实施例3
56.3吨罐菌丝体发酵液，工业离心机分离，菌丝体水悬后管路转移至料液罐中，补水至2100l搅拌，90℃处理30min，再次工业离心机分离，得到1800l含有麦角硫因的料液；含有麦角硫因的料液双效浓缩至250l，氨水调节浓缩液ph至9.1，静置30min后管道过滤去除沉淀物，得到麦角硫因浓缩液；麦角硫因浓缩液先后通过0.1μm陶瓷膜和4kd中空纤维膜过滤，得到麦角硫因超滤液230l。
57.将上述得到麦角硫因超滤液通过hz214脱色柱处理，流速1bv/h，水洗体积2bv，收集流穿液得到麦角硫因脱色液380l；麦角硫因脱色液进样至hz001离交层析柱，上样量60％，上样流速1bv/h，水洗2bv，解吸液液浓度0.6mol/l，ph 8.2，解吸流速0.1bv/h，监测波长280nm，收集解吸液46l，温度80℃，真空度0.096mpa，解吸液真空浓缩至麦角硫因浓度80g/l，得到麦角硫因解吸浓缩液。
58.色谱层析柱hilic填料装柱高度35cm，直径30cm，单次上样量500ml麦角硫因解吸浓缩液，流动相乙醇：水＝95:5，流速2000ml/min，检测波长和收集波长分别280nm和254nm，收集目标峰，浓缩至干去除乙醇，水复溶后过脱盐串联柱d315
‑
d152
‑
d315处理，流速1bv/h，水洗2bv，收集流穿液浓缩得到麦角硫因脱盐浓缩液，麦角硫因脱盐浓缩液经喷雾干燥得到麦角硫因粗品，纯度检测为70.31％，回收率达到65.35％。
59.将上述得到的麦角硫因脱盐浓缩液定容至150g/l，结晶反应釜搅拌速率200rpm，
恒温25℃，先恒温2h，无水乙醇滴加量3倍体积，滴加时间5h，养晶时间12h，抽滤沥干，先后用90％乙醇和无水乙醇洗涤，抽滤沥干，85℃10h烘干，粗结晶母液重复相同方法两次，合并得到麦角硫因粗结晶样品，纯度检测98.66％。
60.麦角硫因粗结晶样品水溶液复溶以后，定容至120g/l，结晶反应釜搅拌速率200rpm，恒温35℃2h，降温梯度0.1k/min，降温至2℃，养晶时间15h，抽滤沥干，先后用90％乙醇和无水乙醇洗涤，抽滤沥干，85℃8h烘干，重结晶母液同种方法处理一次合并得到麦角硫因重结晶样品，纯度检测100.12％，整体回收率55.61％。
61.实施例4
62.3吨罐菌丝体发酵液，工业离心机分离，菌丝体水悬后管路转移至料液罐中，补水至2000l搅拌，90℃处理30min，再次工业离心机分离，得到1800l含有麦角硫因的料液；含有麦角硫因的料液双效浓缩至200l，氨水调节浓缩液ph至9.0，静置30min后管道过滤去除沉淀物，得到麦角硫因浓缩液；麦角硫因浓缩液先后通过0.1μm陶瓷膜和4kd中空纤维膜过滤，得到麦角硫因超滤液220l。
63.将上述得到麦角硫因超滤液通过hz214脱色柱处理，流速1bv/h，水洗体积2bv，收集流穿液得到麦角硫因脱色液350l；麦角硫因脱色液进样至hz001离交层析柱，上样量65％，上样流速1bv/h，水洗2bv，解吸液液浓度0.5mol/l，ph 8.6，解吸流速0.1bv/h，监测波长280nm，收集解吸液50l，温度65℃，真空度0.09mpa，解吸液真空浓缩至麦角硫因浓度80g/l，得到麦角硫因解吸浓缩液。
64.色谱层析柱hilic填料装柱高度35cm，直径30cm，单次上样量500ml麦角硫因解吸浓缩液，流动相乙醇：水＝95:5，流速2000ml/min，检测波长和收集波长分别280nm和254nm，收集目标峰，浓缩至干去除乙醇，水复溶后过脱盐串联柱d315
‑
d152
‑
d315处理，流速1bv/h，水洗2bv，收集流穿液浓缩得到麦角硫因脱盐浓缩液，麦角硫因脱盐浓缩液经喷雾干燥得到麦角硫因粗品，纯度检测为73.31％，回收率达到66.57％。
65.将上述得到的麦角硫因脱盐浓缩液定容至130g/l，结晶反应釜搅拌速率200rpm，恒温25℃，先恒温2h，无水乙醇滴加量4倍体积，滴加时间5h，养晶时间12h，抽滤沥干，先后用90％乙醇和无水乙醇洗涤，抽滤沥干，85℃12h烘干，粗结晶母液重复相同方法两次，合并得到麦角硫因粗结晶样品，纯度检测98.98％。
66.麦角硫因粗结晶样品水溶液复溶以后，定容至130g/l，结晶反应釜搅拌速率200rpm，恒温30℃2h，降温梯度0.1k/min，降温至2℃，养晶时间15h，抽滤沥干，先后用90％乙醇和无水乙醇洗涤，抽滤沥干，85℃8h烘干，重结晶母液同种方法处理一次合并得到麦角硫因重结晶样品，纯度检测99.89％，整体回收率53.21％。