一株筑波链霉菌诱变菌株及其在联产他克莫司与双烯他克莫司中的应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，尤其是一种高产他克莫司与双烯他克莫司的筑波链霉菌诱变菌株、方法及应用。


背景技术：

2.他克莫司(tacrolimus，fk506)，1984年首次由日本藤泽公司从日本筑波山土壤中分离的筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis no.9993)的发酵液中提取得到的一种新型的23元大环内酯类免疫抑制剂。他克莫司在预防各种器官移植所出现的排斥反应时，功效较相同剂量的环孢菌素强10～100倍，而毒副作用更少，且具有低死亡率、高移植存活率、移植成功率高、用量少、依赖性小等优点。他克莫司在中国上市的短时间内，市场份额迅速上升，已经成为肝脏及肾脏移植后排斥反应的临床一线药物。同时，其对类风湿性关节炎、狼疮性肾炎等自身免疫系统疾病也表现出较好的治疗效果。此外，他克莫司还广泛应用于各类皮肤病的治疗如特应性皮炎、慢性光化性皮炎、白癜风、红斑狼疮和银屑病等20多种常见皮肤病治疗之中，广阔的应用前景使研究他克莫司提产具有巨大的医学意义和经济价值。
3.目前，由于他克莫司的化学合成效率低、成本高，其原料生产仍然来源于微生物发酵。申请号为200810001069.0的中国专利公布了一种链霉菌、用其产生他克莫司的方法及其应用，将筛选得到的菌种经过ntg(亚硝基胍)诱变选育得到生产菌株，其公开的经摇瓶发酵7d后他克莫司产量最高为300μg/ml。申请号为201710309551.x的中国专利公布了一种提高他克莫司产量的发酵方法，在常规发酵过程中加入吸附树脂以及流加补充糊精，摇瓶发酵170h后，他克莫司产量最高可达1248mg/l。申请号为202010894220.9的中国专利公布了通过高通量诱变筛选高产他克莫司的筑波链霉菌的方法及菌株，最终筛选获得摇瓶发酵他克莫司产量达150mg/l的突变株。
4.在实际的生产过程中，他克莫司的合成与产品纯化通常会伴随着副产物的残留。双烯他克莫司(tacrolimus diene，fk506d)是发酵他克莫司中的一个主要副产物，它可以用于他克莫司生产及医药产品制备中杂质的定性及定量分析，从而建立他克莫司的质量标准，为他克莫司的质量研究、对照品研究、杂质安全性等提供重要的指导意义。规范地研究双烯他克莫司，并将药品中的双烯他克莫司控制在相对安全、合理的限度范围，直接关系到他克莫司类药品临床使用的安全性。而目前尚无微生物发酵高效生产双烯他克莫司的专利报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种高产他克莫司的筑波链霉菌诱变菌株、方法及应用，且该菌株可以高效联产双烯他克莫司，为他克莫司以及副产物分析提供良好的生产平台。
6.本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
7.一株高产他克莫司与双烯他克莫司的筑波链霉菌诱变菌株，所述菌株的名称为sl2021，分类名称为：筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)，保藏编号为：cgmcc no.23925，保藏日期：2021年11月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.进一步地，所述菌株是以筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis nrrl 18488)菌株为出发菌株、利用紫外诱变育种基础上，筛选得到的他克莫司与双烯他克莫司的高产菌种。
9.进一步地，所述菌株具有以下形态学和培养特征：
10.(1)形态特性
11.菌株革兰氏染色为阳性，在rp、isp2、isp3、isp4四种固体培养基上观察该菌的培养特征，在rp固体培养基上生长良好，培养10-14天后筑波链霉菌sl2021的营养菌丝体从白色变成黑灰色，培养基背面为浅红褐色，菌落为圆形，不透明，干燥，边缘不规则，中间凸起，与培养基连接紧密，不易刮下；在isp2、isp3上生长不足，且在isp3上能够观察到可溶色素的产生，呈浅红褐色；在isp4上能够正常生长，菌株的营养菌丝体颜色从白色到灰白色。
12.(2)筑波链霉菌sl2021菌株的培养特征如下：
13.培养基气生菌丝基内菌丝可溶性色素rp黑灰色黑灰色浅红褐色isp2灰白色无色无isp3灰白色无色红褐色isp4灰白色无色无
14.如上所述的高产他克莫司和双烯他克莫司的筑波链霉菌诱变菌株在微生物发酵制备他克莫司和双烯他克莫司方面中的应用。
15.利用如上所述的筑波链霉菌诱变菌株发酵制备他克莫司和双烯他克莫司的方法，所述方法包括通过发酵培养筑波链霉菌诱变菌株，得到含有他克莫司和双烯他克莫司的发酵液。
16.进一步地，所述筑波链霉菌诱变菌株的发酵培养包括菌种的固体平板培养、摇瓶的种子培养以及发酵培养。
17.进一步地，所述菌种的固体平板培养时使用的培养基包含有熟黄豆粉、可溶性淀粉和琼脂。
18.进一步地，所述摇瓶的种子培养时使用的种子培养基包含有黄豆粉、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖。
19.进一步地，所述发酵培养时使用的发酵培养基包含有黄豆粉、葡萄糖、大豆油、可溶性淀粉。
20.进一步地，具体步骤如下：
21.(1)固体培养：将筑波链霉菌诱变菌株接种于rp固体培养基中，于28℃培养箱中培养10-14天；
22.(2)液体培养：待孢子成熟后，将菌丝体接种于种子培养基中，在28℃，220rpm摇床条件下培养48h，将培养48h的链霉菌种子液接种至发酵培养基中，接种量10％，在28℃摇床上发酵培养168h后，即得含有他克莫司和双烯他克莫司的发酵液；
no.23925，保藏日期：2021年11月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
42.较优地，所述菌株是以筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis nrrl 18488)菌株为出发菌株、利用紫外诱变育种基础上，筛选得到的他克莫司与双烯他克莫司的高产菌种。
43.较优地，所述菌株具有以下形态学和培养特征：
44.(1)形态特性
45.菌株革兰氏染色为阳性，在rp、isp2、isp3、isp4四种固体培养基上观察该菌的培养特征，在rp固体培养基上生长良好，培养10-14天后筑波链霉菌sl2021的营养菌丝体从白色变成黑灰色，培养基背面为浅红褐色，菌落为圆形，不透明，干燥，边缘不规则，中间凸起，与培养基连接紧密，不易刮下；在isp2、isp3上生长不足，且在isp3上能够观察到可溶色素的产生，呈浅红褐色；在isp4上能够正常生长，菌株的营养菌丝体颜色从白色到灰白色。
46.(2)筑波链霉菌sl2021菌株的培养特征如下：
47.培养基气生菌丝基内菌丝可溶性色素rp黑灰色黑灰色浅红褐色isp2灰白色无色无isp3灰白色无色红褐色isp4灰白色无色无
48.如上所述的高产他克莫司和双烯他克莫司的筑波链霉菌诱变菌株在微生物发酵制备他克莫司和双烯他克莫司方面中的应用。
49.利用如上所述的筑波链霉菌诱变菌株发酵制备他克莫司和双烯他克莫司的方法，所述方法包括通过发酵培养筑波链霉菌诱变菌株，得到含有他克莫司和双烯他克莫司的发酵液。
50.较优地，所述筑波链霉菌诱变菌株的发酵培养包括菌种的固体平板培养、摇瓶的种子培养以及发酵培养。
51.较优地，所述菌种的固体平板培养时使用的培养基包含有熟黄豆粉、可溶性淀粉和琼脂。
52.较优地，所述摇瓶的种子培养时使用的种子培养基包含有黄豆粉、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖。
53.较优地，所述发酵培养时使用的发酵培养基包含有黄豆粉、葡萄糖、大豆油、可溶性淀粉。
54.较优地，具体步骤如下：
55.(1)固体培养：将筑波链霉菌诱变菌株接种于rp固体培养基中，于28℃培养箱中培养10-14天；
56.(2)液体培养：待孢子成熟后，将菌丝体接种于种子培养基中，在28℃，220rpm摇床条件下培养48h，将培养48h的链霉菌种子液接种至发酵培养基中，接种量10％，在28℃摇床上发酵培养168h后，即得含有他克莫司和双烯他克莫司的发酵液；
57.其中，所述rp固体培养基为(g/l)：熟黄豆粉10；可溶性淀粉20；缬氨酸0.5；琼脂18.0；kh2po40.5；nacl 2；caco33；mgso4·
7h2o 0.5，ph调至7.2；
58.所述isp2培养基为(g/l)：葡萄糖4；麦芽浸粉10；酵母浸粉4；琼脂20；ph调至7.2；
59.所述isp3培养基为(g/l)：燕麦粉20；feso4·
7h2o 0.001；mncl2·
4h2o 0.001；znso4·
7h2o 0.001；琼脂18；ph调至7.2；
60.所述isp4培养基为(g/l)：可溶性淀粉10；nacl 1；(nh4)2so42；k2hpo41；caco
3 2；mgso4·
7h2o 1；feso4·
7h2o 0.001；mncl2·
4h2o 0.001；znso4·
7h2o 0.001；琼脂20；ph调至7.2；
61.所述种子培养基为(g/l)：黄豆粉20；可溶性淀粉10；葡萄糖5；酵母粉7；蛋白胨7；nacl 3；kno33；mgso4·
7h2o 0.7；caco31，ph调至7.2；
62.所述发酵培养基为(g/l)：黄豆粉35；葡萄糖30；大豆油15；可溶性淀粉10；酵母粉2.5；蛋白胨3；caco33.5，ph调至7.2。
63.具体地，相关的制备及检测如下：
64.实施例1
65.rp固体培养基的配置(g/l)：熟黄豆粉10；可溶性淀粉20；缬氨酸0.5；琼脂18.0；kh2po40.5；nacl 2；caco33；mgso4·
7h2o 0.5，ph调至7.2。
66.种子培养基的配置(g/l)：黄豆粉20；可溶性淀粉10；葡萄糖5；酵母粉7；蛋白胨7；nacl 3；kno33；mgso4·
7h2o 0.7；caco31，ph调至7.2。
67.发酵培养基的配置(g/l)：黄豆粉35；葡萄糖30；大豆油15；可溶性淀粉10；酵母粉2.5；蛋白胨3；caco33.5，ph调至7.2。
68.上述培养基均需在121℃，0.1mpa条件下灭菌20min。
69.实施例2筑波链霉菌sl2021的获得
70.采用紫外诱变技术选育高产他克莫司的菌株。
71.紫外诱变流程图如图1所示。
72.紫外诱变过程注意事项：
73.1、菌株在固体培养基上培养10-14天，待斜面孢子成熟后，用无菌水将孢子从斜面上洗下来；
74.2、将孢子接入种子培养基中，在35℃，200rpm的摇床中活化培养6-8h；
75.3、将种子液用滤纸过滤，并用无菌生理盐水洗涤两次，用血球计数板估计孢子数目，最后用无菌生理盐水制成107个/ml的孢子悬液；
76.4、在进行诱变处理之后，要对诱变后的孢子悬液进行避光冷藏，以防止光复性的发生；
77.5、整个诱变过程应该在避光条件下进行，其目的是防治光复性的发生；
78.6、挑取不同形态的大型单菌落进行摇瓶初筛，之后选取5～10株发酵产量较高的菌株进行传代培养5代以上，并对于每一代菌株进行发酵，测定他克莫司的发酵产量，确定稳定性最好和发酵产量最高的菌株。
79.实施例3筑波链霉菌sl2021的发酵验证
80.将筑波链霉菌sl2021培养在固体培养基上，28℃，14天左右，长至孢子变为黑灰色。用接种环从固体平板上刮取满满一环的孢子接种于装有40ml种子培养基的250ml锥形瓶中，在28℃、220rpm的条件下培养48h，这时种子液呈粘稠状，瓶底有细沙状的菌丝体挂壁。
81.将培养好的种子液以10％的接种量接种于装有40ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，在28℃、220rpm的条件下培养168h。
82.筑波链霉菌sl2021在发酵168h时他克莫司产量为550mg/l。
83.实施例4他克莫司和双烯他克莫司的提取及检测
84.具体提取步骤如下：发酵液样品按1:1.5(v/v)加入无水乙醇，混匀，50℃恒温水浴150min，每半小时震荡1次，3800rpm离心15min，取上清，用0.22μm有机滤膜过滤上清液，待测。
85.采用高效液相色谱法进行检测，检测方法：色谱柱为sb-c18(250mm
×
4.6mm，agilent，america)，紫外检测器，流速1.0ml/min，柱温50℃，检测波长210nm，进样量20μl，流动相为v(乙腈)：v(0.1％甲酸水溶液)＝65:35。
86.流动相的配置方法如下：
87.乙腈：用0.45μm孔径的有机滤膜进行抽滤，然后进行超声脱气30分钟即可。
88.0.1％甲酸水溶液：用量筒量取400ml超纯水，加入400μl甲酸，然后用0.45μm孔径的水膜进行抽滤，再经过超声脱气30分钟即可。
89.他克莫司及双烯他克莫司产量的计算方法：分别用无水乙醇配制不同浓度(0mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、500mg/l)的他克莫司及双烯他克莫司标准溶液，将上述标准溶液用hplc检测各自的峰面积，根据峰面积和标准溶液的浓度分别计算出他克莫司及双烯他克莫司的标准曲线，标准曲线结果如图2、图3所示。使用hplc检测未知浓度的样品可得到一个峰面积，带入标准曲线公式即可计算出样品中他克莫司和双烯他克莫司的浓度。
90.筑波链霉菌sl2021在发酵168h时他克莫司产量达到最大为582mg/l。如图4所示。
91.实施例5esi-ms
92.fk506测试条件：nebulizing gas flo 1.5l/min；cdl temperature：200℃；heat block temperature：200℃；质量范围：100-1000。
93.fk506d测试条件：sprayvoltage：3200v；capillary temperature：300.00℃；sheath gas：40.00arb；aux gas：8.00arb；max spray current:100.00μa；probe heater temp.：280℃。
94.结果分析：样品的esi-ms报告见图5、图6。
95.实施例6筑波链霉菌sl2021的全基因组重测序及其分子标记
96.以筑波链霉菌sl2021为样本菌株，采用illumina技术对其全基因组进行了重测序检测，该样本基因组所有序列读长总长7,950,651bp，测序获得96条长序列片段，7,236个基因，其中，诱变菌株相对于野生菌株atcc 18488(参考序列编号：gcf_003932715.1)。分析了基因组中的单核苷酸多态性(snp)、small indel(错配和小插入缺失)信息。
97.基因组上有523个突变位点，其中单核苷酸多态性位点有134个，多核苷酸多态性位点有8个，插入突变位点有251个，缺失突变位点有120个，复合型突变位点有10个。除去基因上突变及基因间突变，将剩下变异数据进行筛选后，根据突变基因名称、种类及区域进行查询得到各突变基因名称与功能。结果发现，位于rrf(基因编号stsu:b7r87_rs10885)基因非编码区出现的ins突变、位于argh(精氨琥珀酸裂解酶，基因编号stsu:b7r87_04610)基因下游区域的snp突变、位于asnb(基因编号stsu:b7r87_rs31785)基因上游区域的snp突变以
及ndk(基因编号stsu:b7r87_rs09215)基因移码突变现象可以被归为导致目标菌株突变后高产他克莫司的原因。
98.表1样本特殊基因突变汇总
[0099][0100]
pos：参考序列上突变的位置坐标；ref：snp位置的参考碱基；alt：突变位置的变异碱基
[0101]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。