新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及应用的制作方法

新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量pcr检测引物探针组、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量pcr检测引物探针组、试剂盒及应用。


背景技术：

2.2017年以来，华东地区多个鹅场暴发了以雏鹅痛风为主要临床特征的疾病，主要感染4～16日龄的雏鹅，导致约2％～20％的死亡率，死亡鹅表现为肾发白肿胀、胸腹膜及心表面、输尿管中存在大量的尿酸盐沉积，给养鹅业造成了很大的损失。经分离鉴定发现，该病是由一种星状病毒感染所导致，该毒株与以往报道的禽星状病毒具有很大的差异，其全基因组同源性为46.5％～62.0％，编码衣壳蛋白的orf2基因氨基酸序列的同源性仅为27.3％～57.0％，与禽星状病毒属的其他代表性毒株的遗传距离较远，是一种新发的星状病毒。
3.2010年4—6月份，中国福建、浙江、江苏、安徽、山东等地的产蛋鸭相继爆发以产蛋下降为特征的一种新病，该病发病急、传播快，发病对象主要集中于各个产蛋阶段的麻鸭和樱桃谷种鸭。鸭发病后，产蛋率从90％—95％下降到10％以下，甚至绝产。其剖检变化主要表现为卵泡出血、破裂和卵黄性腹膜炎，死亡率在1％—5％。研究证明引起该病的病原为黄病毒科黄病毒属的坦布苏病毒(tembusuvirus，tmuv)，该病暂命名为坦布苏病毒病(tembusu virus disease，tmuvd)。有研究表明，鸭坦布苏病毒也会感染鹅，造成鹅产蛋下降，建立新型鹅星状病毒和坦布苏病毒的多重荧光定量pcr检测方法对水禽疫病防控具有重要意义。
4.目前已有研究关于坦布苏病毒荧光定量pcr方法的建立和新型鸭细小病毒sybr greenι荧光定量pcr检测方法的建立，但是新型鹅星状病毒和鸭坦布苏的多重荧光定量pcr方法还未见报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量pcr检测引物探针组、试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
6.一种快速检测新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒的多重引物和探针，包括：鸭坦布苏病毒的上、下游引物分、鸭坦布苏病毒特异性探针和新型鹅星状病毒的上、下游引物、新型鹅星状病毒特异性探针；
7.所述鸭坦布苏病毒的上、下游引物分、鸭坦布苏病毒特异性探针为：
8.上游引物：5
’‑
ttgttgtccttgctgaaggc-3’(seq id no.1)
9.下游引物：5
’‑
cattgggaggaccgaagagt-3’(seq id no.2)
10.鸭坦布苏病毒特异性探针：5
’‑
ctgtcgcggcacgagctcgt-3’(seq id no.3)
11.所述新型鹅星状病毒的上、下游引物、新型鹅星状病毒特异性探针为：
12.上游引物：5
’‑
ctgcacaagttggttggaca-3’(seq id no.4)
13.下游引物：5
’‑
catcataacgcgtccagtcc-3’(seq id no.5)
14.新型鹅星状病毒特异性探针：5
’‑
acctgtcaccaccaccaatgagcc-3’(seq id no.6)该多重引物探针组的特异性好、灵敏度高。
15.在一些实施例中，鸭坦布苏病毒特异性探针在5’端标记6-fam荧光基团，在3’端标记bhq1淬灭基团；新型鹅星状病毒特异性探针在5’端标记cy5荧光基团，在3’端标记bhq1淬灭基团。
16.本发明还提供一种上述检测鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的多重引物探针在制备特异性多重检测鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒试剂中的应用。
17.本发明还提供一种用于检测新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒的试剂盒，包括试剂2
×
aceq qpcr probe master mix、mocl3、50
×
rox reference dye 1和上述的多重引物和探针组。
18.在一些实施例中，所述mocl3的浓度为2.0mmol-3.0mmol。
19.本发明还提供一种用于新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量pcr的检测方法，配置多重pcr反应体系：检测样品cdna 1.0μl、2
×
aceq qpcr probe master mix 10μl、浓度为10μm的新型鹅星状病毒上下游引物和浓度为10μm的鸭坦布苏病毒上下游引物各0.4μl、浓度为10μm的新型鹅星状病毒特异性探针和浓度为10μm的鸭坦布苏病毒探针各0.2μl、50
×
rox reference dye 1 0.4μl和ddh2o 6.6μl。
20.在一些实施例中，多重荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火和延伸30s，40次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。
21.与现有技术相比，本发明的优点及积极效果为：
22.为建立鉴别检测坦布苏病毒(dtmuv)、新型鹅星状病毒(goastv)的方法，本技术中分别针对dtmuv e基因与goastv的orf1b基因，设计特异性引物和taqman探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时检测dtmuv、goastv的taqman荧光定量rt-pcr方法。该方法具有特异、敏感、高效的优点。
附图说明
23.图1是实验方案优化设计图；
24.图2是dtmuv标准品单独扩增曲线；
25.图3是goastv标准品单独扩增曲线；
26.图4是混合标中的dtmuv扩增曲线；
27.图5是混合标中的goastv扩增曲线；
28.图6是dtmuv样品单独扩增曲线；
29.图7是goastv样品单独扩增曲线；
30.图8是混合样品中的dtmuv样品扩增曲线；
31.图9是混合样品中的goastv样品扩增曲线；
32.图10针对新型鹅星状病毒(goastv)的orf1a基因设计的引物和探针扩增效果图；
33.图11是表2中goastv(orf2基因)-1的引物和探针扩增效果图；
34.图12是表2中goastv(orf2基因)-2的引物和探针扩增效果图；
35.图13是表2中dtmuv-1和goastv-1的引物和探针扩增效果图；
36.图14是表2中dtmuv-2和goastv-2的引物和探针扩增效果图。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
38.根据本技术包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
39.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
40.本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
41.本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
42.本发明披露了新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重taqman荧光定量pcr检测引物、试剂盒及应用。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
43.实施例
44.本发明中先后针对坦布苏病毒(dtmuv)的e基因、新型鹅星状病毒(goastv)的orf1b基因、orf1a基因、orf2基因设计引物及探针，如下表1和表2所示，共9对引物和探针。表2中各对引物和探针的扩增效果依次见图10-图14所示，没有扩增信号。而仅有针对坦布苏病毒(dtmuv)的e基因、新型鹅星状病毒(goastv)的orf1b基因设计的引物和探针组合(表1)效果较好。下述详细描述表1中引物、探针实验方案和实验效果。
45.表1成功的引物信息
[0046][0047]
表2失败的引物信息
[0048][0049]
荧光定量pcr实验参照试剂盒南京诺唯赞aceq qpcr probe master mix(货号：q112-02)的说明进行，pcr体系及程序如下：
[0050]
表3 qpcr单独检测体系
[0051]
试剂用量2
×
aceq qpcr probe master mix10μlprimer 1(10μm)0.4μlprimer 2(10μm)0.4μltaqman probe1(10μm)0.2μl50
×
rox reference dye 10.4μltemplate dna/cdna1.0μlddh2oup to 20μl
[0052]
表4 qpcr混合检测体系
[0053]
试剂用量2
×
aceq qpcr probe master mix10μlprimer 1(10μm)0.4μlprimer 2(10μm)0.4μltaqman probe1(10μm)0.2μlprimer 3(10μm)0.4μlprimer 4(10μm)0.4μltaqman probe2(10μm)0.2μl50
×
rox reference dye 10.4μltemplate dna/cdna1.0μlddh2oup to 20μl
[0054]
表5 qpcr程序
[0055][0056]
标准品制备过程：
[0057]
分别用dtmuv和goastv的正反向引物，以dtmuv和goastv基因组dna为模板进行常规pcr扩增并进行电泳和胶回收。然后用美国life qubit 3.0荧光定量仪对pcr产物浓度进行测定，再根据如下公式计算拷贝数。
[0058]
拷贝数计算公式：(6.02
×
10
23
拷贝数/摩尔)
×
(浓度)/(mw g/mol)＝copies/ml
[0059]
即(6.02
×
10
23
)
×
(g/ml)/(dna length
×
660)＝copies/ml
[0060]
或(6.02
×
10
23
)
×
(ng/ul
×
10-9
)/(dna length
×
660)＝copies/ul
[0061]
最后，将标准品依次进行10倍稀释得到101～108不等的8个浓度的标准品。
[0062]
样品制备：
[0063]
随机挑取7个dtmuv和goastv的病料，按照市售试剂盒说明书制备核酸模板。样品不稀释，直接取1.0ul加入反应体系中。阴性对照加1.0ul的无菌水。
[0064]
本实施例中共设计如图1所示的实验，其中，1、2列为dtmuv标准品101～108coyies/μl；3、4列为goastv标准品101～108coyies/μl；5、6列为dtmuv goastv标准品101～108coyies/μl；7、8列为dtmuv样品s1-s7及阴性对照；9、10列为goastv样品s1-s7及阴性对照；11、12列为dtmuv goastv混样s1-s7及阴性对照。
[0065]
扩增曲线如图2-图9所示。其中，图2是dtmuv标准品单独扩增曲线；图3是goastv标准品单独扩增曲线；图4是混合标中的dtmuv扩增曲线；图5是混合标中的goastv扩增曲线；图6是dtmuv样品单独扩增曲线；图7是goastv样品单独扩增曲线；图8是混合样品中的dtmuv样品扩增曲线；图9是混合样品中的goastv样品扩增曲线。实验结果证明，两种病毒混合检测也能取得较好的检测效果。
[0066]
表6 ct值
[0067][0068]
根据基因检测的行业标准，一般认为ct值大于35个循环时，是阴性。ct值小于35个
循环时，是阳性。
[0069]
探针法是核酸检测的金标准，实验中的水解探针(taqman探针)可以确保扩增区域的特异性，不会出现像sybrgreen法的非特异性扩增。此外，针对灵敏度问题，我们根据最小标准品(10copies)的ct值在35左右可以得知，本发明的最低检测限为10copies，达到血液制品病毒检测的水平。此外，我们对单检和混检的扩增效率进行了计算(表7)，结果显示混检的效果与单检的水平相当，说明混合检测不会影响检测的灵敏度和特异性。且dtmuv的检测效果更好一些。
[0070]
表7引物扩增效率
[0071]
geneslopey-interr2effdtmuv单独扩增-3.58841.6010.99490.00％goastv单独扩增-3.53342.5750.99891.88％dtmuv(混合)-3.6440.3190.99788.26％goastv(混合)-3.51540.1210.99392.521
[0072]
表8样品最终拷贝数(copys/ul)
[0073][0074]
重复性检测
[0075]
选取dtmuv标准品102、104coyies/μl和goastv标准品102、104coyies/μl采用上述表1引物探针组、试剂盒及循环参数，进行重复测试，每个浓度重复16次。检测结果如表9所示。
[0076]
表9重复性检测结果
[0077] 102coyies/μl104coyies/μldtmuv阳性率100％，cv:1.18％阳性率100％，cv:2.47％goastv阳性率100％，cv:1.47％阳性率100％，cv:2.52％
[0078]
本发明组合的引物探针组重复性好，cv值在3％以下，具有较强的稳定性。
[0079]
特异性检测
[0080]
将网状内皮组织增殖症病毒、圆环病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、鹅黏病毒的病原体培养物或假病毒稀释至1.0
×
104copies/μl作为特异性检测样本进行检测，检测结果均为阴性，阴阳性质控品正常检出，表明本发明的试剂盒特异性良好。
[0081]
反应体系离子优化：
[0082]
按下表实验设计添加表中的离子做pcr体系优化
[0083][0084]
以不添加任何离子的体系为对照，结果如下：
[0085] 对比例实验1实验2实验3ct值28272725
[0086]
mocl3浓度优化
[0087][0088][0089]
从上述优化体系来看，mocl3浓度在2.0mmol-3.0mmol可以明显改善扩增效率。
[0090]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。