一种紫菜致病菌及其应用的制作方法

1.本发明属于海藻病害防治技术领域，具体涉及一种紫菜致病菌及其应用。


背景技术：

2.紫菜是一种深受人们喜爱的食物，也是东亚沿海地区重要的经济海藻。紫菜的生活史包括两种世代，分别为二倍体的丝状体世代和单倍体的叶状体世代，后者即人们日常食用的紫菜形态。因此，紫菜的生产过程包括室内贝壳丝状体育苗阶段和海区叶状体栽培阶段。而在紫菜贝壳丝状体育苗过程中，由于培养水体污染、养殖环境突变或人为处理不当等因素，容易暴发黄斑病、白斑病、鲨皮病等多种疾病。
3.最近几年，除上述疾病外，紫菜贝壳丝状体出现了一种新型疾病。该病与现有报道的紫菜疾病的病状和病征等方面均存在较大差异，而与珊瑚的漂白病有着很大的相似性。在丝状体白化病的发病初期，紫菜贝壳上出现白色小斑点和晕圈，病斑周围无光泽。随着病情的发展，白点逐渐发展成较大的白色斑块或条纹。当贝壳大面积漂白后，贝壳表面不产生白斑病那种白色雾状结构，其病变部位粗糙无光泽，珍珠质(珍珠层)受损，丝状体无法再次生长。鉴于此，将该病命名为白化病。在目前的生产实践中，白化病的发病程度会比黄斑病轻，蔓延速度也比黄斑病慢，但也会导致减产，造成重大经济损失。因此，有必要探究紫菜丝状体白化病的病因并开发其防治办法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种紫菜致病菌及其应用，即一种紫菜丝状体白化病致病菌，从而弥补现有技术的不足。
5.本发明所提供的紫菜丝状体白化病致病菌为phaeobacter sp.jn-w-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国北京，保藏日期为2020年11月13日，保藏编号为cgmcc no.21175。
6.本发明菌株的最佳培养条件为25℃，盐度20
‰
，ph 7.0。
7.本发明所提供的菌株可应用于抗白化病的紫菜品系的筛选；
8.本发明的菌株phaeobacter sp.jn-w-1感染丝状体的方式为接触型感染；可用于构建紫菜丝状体白化病的致病模型，从而用于筛选预防和治疗紫菜丝状体白化病的药品或方法。
9.本发明筛选获得的菌株phaeobacter sp.jn-w-1为紫菜丝状体白化病的致病菌，可以用于紫菜丝状体白化病的治疗方法的研发，筛选抗白化病的紫菜品系，从而减少紫菜育苗生产损失。
附图说明
10.图1：白化病贝壳及体式显微镜观察细节图，a为照相机拍摄的患病贝壳，b和c为体式显微镜拍摄的贝壳表面病斑部位；
11.图2：使用jn-w-1菌株感染自由丝状体光学显微镜观察图，蓝色为被伊文思蓝染色的死细胞，红色为存活细胞；
12.图3：jn-w-1菌株菌落特征(a)及透射电镜观察图(b)；
13.图4：phaeobacter sp.jn-w-1感染丝状体的透射电镜观察图；
14.图5：其中a为分离式培养器示意图；b不同处理下自由丝状体的最大光量子效率fv/fm值；c不同处理下丝状体细胞的存活情况，蓝色为被伊文思蓝染色的死细胞，红色为存活细胞。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
16.实施例1：白化病贝壳病症观察及附生菌分离纯化
17.2019年9月自江苏连云港某紫菜育苗场取患白化病的紫菜贝壳丝状体，使用体式显微镜对其白化部位进行观察。患病贝壳白化面积最高可占贝壳表面积的1/3。病灶位置无丝状体生长，贝壳表面粗糙、无光泽，珍珠层破损(图1)。
18.使用煮沸后冷却的无菌海水冲洗贝壳表面3-5次后，使用灭菌刮刀刮取贝壳病斑部位。收集刮取的贝壳粉末加至1ml灭菌海水中，剧烈振荡后使用灭菌海水分别稀释10-2
、10-3
倍。取稀释液分别涂布至tsa培养基(1％nacl)、2216e海水培养基、tcbs培养基中，28℃培养。待菌落长出后，挑取平板中的菌落，于对应的固体培养基中进行划线分离，28℃培养。取单菌落于对应的液体培养基中，28℃扩大培养后以菌液：40％甘油＝1：1的比例进行保种，-80℃保存。
19.对所分离的单菌落进行纯化培养后，进行回染实验，筛选获得一株菌株具有致病性，命名为jn-w-1。
20.以jn-w-1菌株基因组为模板，使用引物515f：5'-gtgccagcagccgcggtaa-3'；806r：5'-ggactaccagggtatctaa-3'扩增16s rna的v4片段并进行测序。
21.使用rdp release 11比对序列，结果表明菌株jn-w-1属于褐杆菌phaeobacter属，命名为phaeobacter sp.jn-w-1。将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株编号为cgmcc no.21175。
22.菌株jn-w-1在2216e固体培养基上，于30孵育2d，菌落表面光滑，呈白色，圆形(图2a)。使用透射电镜观察细菌形态，该菌呈卵圆形，长约1.0-2.5μm，宽约0.5-0.8μm(图2b)。
23.实施例2：jn-w-1菌株的致病性
24.取jn-w-1菌株保种菌液以1％的接种量接种至2216e液体培养基中，180r/min，28℃过夜培养以活化菌种。取活化菌液以1％的接种量再次培养16h。收集菌液，8000r/min离心5min，弃上清，取灭菌海水重悬菌体，重复3次。
25.取浙江省海洋生物技术重点实验室藻种库纯化培养的紫菜自由丝状体，使用破碎机将丝状体打碎至200-300μm，培养1周，培养条件为20，光照强度30μmol
·
photons
·
m-2
s-1
，光暗周期l:d＝12:12h，培养液为添加了1
‰
宁大三号母液的无菌海水。使用抗生素对丝状体进行无菌处理，处理浓度为氨苄青霉素300μg/ml、卡那霉素100μg/ml、庆大霉素100μg/ml，至暗处培养18h。取出丝状体用无菌海水冲洗3遍后转移至新的培养液中培养，光暗周期为12：12h。12h后再次更换新鲜培养液，培养2d后待用。
26.取适量上述菌悬液加至紫菜丝状体培养液中，使细菌终浓度为107cfu/ml，进行感染实验，培养条件为温度28℃，光照强度30μmol
·
photons
·
m-2
·
s-1
，l:d＝12:12。使用无菌培养液培养的丝状体作为空白对照，设置3组平行。分别于感染0、24、48、72h后取出丝状体，使用0.01％伊文思蓝染液避光染色10min后进行镜检(图3)。感染组在24h时出现死亡现象，48h时丝状体大量死亡，72h时死亡率达到80％以上。
27.从感染组中收集丝状体藻际细菌，重复实施例1中细菌的分离纯化，将获得的菌株与jn-w-1进行16s rdna分子鉴定，从而完成科赫法则验证。两株细菌序列一致，从而确定菌株jn-w-1是紫菜丝状体白化病的致病菌。
28.实施例3：jn-w-1菌株感染方式确定
29.使用透射电镜观察受phaeobacter sp.jn-w-1感染的自由丝状体。在感染前期，菌株在丝状体表面富集黏附，产生胞外分泌物以便更好地聚集(图4a)。在phaeobacter sp.jn-w-1和丝状体接触部位可见细菌胞外分泌物(图4b)。随后，接触部位的丝状体细胞壁呈弥散状，细胞内膜系统崩解，细胞器解体(图4c)。感染后期，丝状体彻底空胞化(图4d)。
30.使用图5a所示装置进一步确定phaeobacter sp.jn-w-1感染方式，装置中以0.22μm的水系滤膜将培养器隔离成两室，该滤膜仅能允许藻类及细菌的分泌物通过，而藻体和菌体不能通过。结果表明，只有接触式感染组(c组)中丝状体的光合效率受到强烈抑制，丝状体在2-5d内出现大量死亡现象(图5b、c)。
31.以上结果表明，phaeobacter sp.jn-w-1的感染方式为接触型感染。
32.本发明所分离纯化的phaeobacter sp.jn-w-1可用于紫菜丝状体白化病病因探究及针对性防控方法的研发。本发明所研发的致病菌分离鉴定及其感染方式的检测方法模型可应用于多种藻类病原菌研究。