甲基化检测方法与流程

1.本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种甲基化检测方法。


背景技术：

2.目前，dna甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、染色质结构修饰、x染色体失活、基因组印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。例如在健康人基因组中，cpg岛中的cpg位点通常是处于非甲基化状态。而当肿瘤发生时，抑癌基因cpg岛以外的cpg序列非甲基化程度增加，而cpg岛中的cpg则呈高度甲基化状态。
3.目前研究dna甲基化水平主要有以下几种方法：
4.甲基化敏感的限制性内切酶(ms-re)法，然而msre法的cg序列识别存在一定的局限性，而且酶不完全消化的时候会引起假阳性问题；
5.甲基化特异性pcr(ms-pcr)法是目前较为常见的检测基因甲基化的方法。但是该方法对引物设计要求非常高，引物设计的质量是扩增成败的关键因素。
6.甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(ms-hrm)法，然而该方法对仪器的要求高，需要带hrm模块的荧光定量pcr仪，并且在进行实时定量pcr的过程中，需要使用饱和的荧光染料。利用ms-hrm技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个cpg位点的甲基化状态。
7.结合重亚硫酸盐测序pcr(bsp)法，该方法不易大批量操作，过程较为繁琐、昂贵。
8.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(massarray)法，但该方法使用的仪器比较昂贵，不利于临床应用。
9.因此目前亟需一种操作简单，重复性高；可应用于多种样本类型，各领域多位点dna甲基化检测法。


技术实现要素：

10.本技术提供了一种甲基化检测的方法。其中所述方法可以使dna甲基化检测更加灵敏、准确，增加通量，和/或更适用于临床应用。
11.一方面，本技术提供一种甲基化检测的方法，其包括以下步骤：a)获得特异性于目的基因的甲基化位点的pcr引物，所述pcr引物包括上游引物以及下游引物，其中所述上游引物的5’端包括氨基修饰；且所述下游引物的5’端带有标记；b)将所述上游引物与载体偶联，获得载体-上游引物偶联物；利用所述载体-上游引物偶联物和所述下游引物对样本进行pcr扩增。
12.在某些实施方式中，所述氨基修饰包括使上游引物的5’端具有氨基修饰功能基团，其中所述氨基修饰功能基团包含至少一个自由的氨基。
13.在某些实施方式中，所述氨基修饰功能基团包含5’amino c6～c18。
14.在某些实施方式中，所述上游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的上游特异性序列。
15.在某些实施方式中，所述氨基修饰功能基团与所述上游特异性序列的5’端直接或间接连接。
16.在某些实施方式中，所述上游引物的浓度为约100-约300nm。
17.在某些实施方式中，所述载体包括固相载体和/或液相载体。
18.在某些实施方式中，所述载体包括磁珠和/或微球。
19.在某些实施方式中，所述载体的表面具有羟基修饰。
20.在某些实施方式中，所述载体-上游引物偶联物中，所述载体与所述上游引物通过所述氨基修饰功能基团连接。
21.在某些实施方式中，所述载体-上游引物偶联物中，所述载体与所述上游引物通过所述氨基修饰功能基团中氨基与所述载体表面的羟基相互作用而连接。
22.在某些实施方式中，所述载体-上游引物偶联物中，所述载体与所述上游引物的5’端连接。
23.在某些实施方式中，所述载体-上游引物偶联物的浓度为约1000-约10000个/反应。
24.在某些实施方式中，所述下游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的下游特异性序列。
25.在某些实施方式中，所述标记能够直接或间接使pcr扩增的扩增产物显色。
26.在某些实施方式中，所述标记包括生物素标记和/或荧光素标记。
27.在某些实施方式中，所述标记与所述下游特异性序列的5’端直接或间接连接。
28.在某些实施方式中，所述下游引物的浓度为约100-约300nm。
29.在某些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：获得非特异性于目的基因的甲基化位点的内参引物，其中所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物；利用所述内参引物进行步骤b)所述的pcr扩增。
30.在某些实施方式中，所述内参引物上游引物的5’端包括氨基修饰。
31.在某些实施方式中，所述内参下游引物的5’端带有标记。
32.在某些实施方式中，所述样本中的dna经重亚硫酸盐处理和/或经酶学法转化。
33.在某些实施方式中，所述样本包括基因组dna、质粒dna、线粒体dna、游离dna、和/或合成dna。
34.在某些实施方式中，所述样本的来源包括细胞、组织、器官和/或样本。
35.在某些实施方式中，所述细胞、组织、器官和/或样本来源于微生物、植物、动物和/或人。
36.在某些实施方式中，所述样本来源于血液样本、血浆样本、ffpe样本、组织样本、粪便样本和/或尿液样本。
37.在某些实施方式中，所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。
38.在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
39.在某些实施方式中，步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物连接有所述载体。
40.在某些实施方式中，步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物带有能够直接或间接使所述扩增产物显色的标记。
41.在某些实施方式中，步骤b)所述的pcr扩增的次数为1次。
42.在某些实施方式中，步骤b)所述的pcr扩增包括选自下组反应步骤：1)预变性95℃2-5min，热循环95℃15-20s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min；2)预变性95℃5-10min，热循环95℃15-30s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min；以及，3)预变性95℃5-15min，热循环95℃15-30s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。
43.在某些实施方式中，所述方法还包括以下的步骤：c)使步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物产生荧光信号并检测，根据所述荧光信号获得所述样本的甲基化修饰情况。
44.在某些实施方式中，所述检测包括使用液相芯片系统检测。
45.在某些实施方式中，所述扩增产物中，所述生物素能够与链霉亲和素标记的荧光染料相结合而产生荧光信号。
46.在某些实施方式中，所述扩增产物中，所述荧光标记能够产生荧光信号。
47.另一方面，本技术提供一种能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点上游引物，其5’端包括氨基修饰。
48.在某些实施方式中，所述上游引物的5’端具有氨基修饰功能基团，其中所述氨基修饰功能基团包含至少一个自由的氨基。
49.在某些实施方式中，所述氨基修饰功能基团包含5’amino c6～c18。
50.在某些实施方式中，所述上游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的上游特异性序列。
51.在某些实施方式中，所述上游特异性序列包含seq id no.1,3-4中任一项所示的核苷酸序列。
52.在某些实施方式中，所述的上游引物中所述氨基修饰功能基团与所述上游特异性序列的5’端直接或间接连接。
53.另一方面，本技术提供一种能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的pcr引物对，其包含根据本技术所述上游引物和下游引物。
54.在某些实施方式中，所述下游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的下游特异性序列。
55.在某些实施方式中，所述下游特异性序列包含seq id no.2,6-7中任一项所示的核苷酸序列。
56.在某些实施方式中，所述下游引物的5’端带有标记。
57.在某些实施方式中，所述标记能够直接或间接使pcr扩增的扩增产物显色。
58.在某些实施方式中，所述标记包括生物素和/或荧光标记。
59.在某些实施方式中，所述标记与所述下游特异性序列的5’端直接或间接连接。
60.另一方面，本技术提供一种甲基化检测试剂盒，其包含本技术所述的上游引物，和/或，本技术所述的pcr引物对。
61.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例
性的，而非为限制性的。
附图说明
62.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
63.图1显示的是本技术所述上游引物与磁珠偶联的流程示意图。
64.图2是本技术所述方法的流程示意图。
65.图3是本技术所述方法的流程示意图。
具体实施方式
66.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。
67.术语定义
68.在本技术中，术语“甲基化”通常是指dna上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mc)的过程。dna甲基化类型可分为:维持甲基化(maintenance dna methylation)和重新甲基化(de novo methylation)。维持甲基化是指在甲基转移酶的作用下，dna的半保留复制过程中，会在子链的相应的位置进行甲基化修饰的过程。重新甲基化是指在甲基转移酶的作用下，原来没有甲基化的dna双链上，进行甲基化的过程，之后由维持甲基化酶来维持稳定的dna甲基化状态。所述甲基化还可以包括形成n6-甲基嘌呤(n6-ma)及7-甲基鸟嘌呤(7-mg)。各种肿瘤中都普遍存在甲基化的异常改变，且异常的dna甲基化状态是肿瘤的重要特征之一。
69.在本技术中，术语“上游引物”通常是指作正义链(sense primer)。dna分子是双链，其中5
’‑3’
的链称作正链，3
’‑5’
方向的链称作负链。所述上游引物合成的链可以和所述正链的序列相同。所述上游引物合成的链可以和所述负链的序列互补。
70.在本技术中，术语“下游引物”通常是指反义链(antisense primer)，所述下游引物合成的链可以和所述负链的序列相同。所述下游引物合成的链可以和所述正链的序列互补。
71.在本技术中，术语“上游特异性序列”通常是指所述上游引物中可以特异性扩增目的基因的甲基化位点的核苷酸序列。例如，所述上游特异性序列可以与目的基因的甲基化位点附近(即该甲基化位点的上游5’以及下游3’处的核苷酸)的dna序列的5
’‑3’
的链的序列相同。例如，所述上游特异性序列可以与目的基因的5
’‑3’
链中，该甲基化位点的上游5’至少2个碱基以及下游3’至少2个碱基的核苷酸的序列相同。
72.在本技术中，术语“下游特异性序列”通常是指所述下游引物中可以特异性扩增目的基因的甲基化位点的核苷酸序列。例如，所述下游特异性序列可以与目的基因的甲基化位点附近(即该甲基化位点的上游5’以及下游3’处的核苷酸)的dna序列的3
’‑5’
的链的序列相同。例如，所述上游特异性序列可以与目的基因的3
’‑5’
链中，该甲基化位点的上游5’至少2个碱基以及下游3’至少2个碱基的核苷酸的序列相同。
73.在本技术中，术语“氨基修饰”通常是指使其包含氨基(例如游离的氨基)官能团的
修饰方式。例如，所述氨基修饰包括使其产生n端的氨基(例如n端游离的氨基)的修饰方式。
74.在本技术中，术语“标记”通常是指能够使pcr扩增产物被检测的记号。
75.在本技术中，术语“液相芯片系统”通常是指多功能悬浮点阵仪。所述液相芯片系统可以为multi-analyte suspension array、masa、flexible multi-analyte profiling或xmap。所述液相芯片系统可以进行蛋白质、核酸等生物大分子的检测。所述液相芯片系统的原理为悬浮在液相体系中的至少一种探针可以在结合目标分子后，在激光激活下产生不同的信号。所述液相芯片系统可以仅需少量样本进行检测，并且可以同时进行定性、定量检测。
76.在本技术中，术语“pcr引物对”通常是指一对能够有效扩增模板dna的核苷酸序列。例如，所述pcr引物对可以包括所述上游引物和所述下游引物。
77.发明详述
78.甲基化检测方法
79.一方面，本技术提供一种甲基化检测的方法，其包括以下步骤：a)获得特异性于目的基因的甲基化位点的pcr引物，所述pcr引物包括上游引物以及下游引物，其中所述上游引物的5’端包括氨基修饰；且所述下游引物的5’端带有标记；b)将所述上游引物与载体偶联，获得载体-上游引物偶联物；利用所述载体-上游引物偶联物和所述下游引物对样本进行pcr扩增。
80.本技术所述的甲基化检测方法，将目的基因的甲基化位点的特异性扩增、扩增产物与载体的杂交这些步骤通过一轮pcr实现，从而简化了甲基化检测的繁琐步骤，例如减少了检测过程中涉及的样本开盖次数。
81.具体而言，在本技术中，所述上游引物可以通过其5’端包括氨基修饰与载体(例如磁珠和/或微球)进行偶联，从而获得载体-上游引物偶联物；所述下游引物则5’端可以带有标记(例如生物素标记或荧光标记)。可以使用所述上游引物和所述下游引物对样本(例如是已经经过重亚硫酸盐处理的样本)进行pcr 1轮扩增。则获得的扩增产物中，可以既包含偶联的载体(例如磁珠和/或微球)，又包含生物素标记或荧光标记。对于既包含偶联的载体(例如磁珠和/或微球)，又包含荧光标记的扩增产物，则可以直接检测其荧光信号，并通过荧光信号获得甲基化检测结果；对于既包含偶联的载体(例如磁珠和/或微球)，又包含生物素标记的扩增产物，则可以利用链霉亲和素(sape)产生荧光信号，并通过荧光信号获得甲基化检测结果。
82.上游引物
83.在本技术中，所述氨基修饰可以包括使上游引物的5’端具有氨基修饰功能基团，其中所述氨基修饰功能基团包含至少一个自由的氨基。
84.在本技术中，所述氨基修饰功能基团可以包含5’amino c6～c18。例如，所述氨基酸修饰功能基团可以包含5’氨基c6修饰和/或5’氨基c12修饰。例如，所述氨基修饰功能基团可以包含amino modifier c12。所述amino modifier c12可以具有如下的结构：
[0085][0086]
在本技术中，所述上游引物可以包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点
的上游特异性序列。例如，所述上游特异性序列可以与包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的dna序列的5
’‑3’
的链的至少部分序列相同。
[0087]
在本技术中，所述氨基修饰功能基团可以与所述上游特异性序列的5’端直接或间接连接。例如，所述氨基酸修饰功能基团可以直接与所述上游特异性序列的5’端连接，或者，可以通过一个或个核苷酸(例如，这些核苷酸作为连接序列)而连接。
[0088]
在本技术中，所述上游引物的浓度可以为约100-约300nm。例如，可以为约100-约280nm、约100-约260nm、约100-约240nm、约100-约220nm、约100-约200nm、约100-约180nm、约100-约160nm、约100-约140nm、约120-约300nm、约160-约300nm或约200-约300nm。
[0089]
磁珠及偶联物
[0090]
在本技术中，所述载体可以包括固相载体和/或液相载体。
[0091]
在本技术中，所述固相载体可以包括芯片。
[0092]
在本技术中，所述液相载体可以包括磁珠和/或微球。所述磁珠和/或微球可以具有硅基材质。所述磁珠和/或微球可以具有羧基或氨基修饰。所述磁珠和/或微球可以选自德国miltenyi，美国dynabeads，德国magserion beads，法国ademtech的产品。所述磁珠和/或微球的粒径可以为约1-5μm。
[0093]
在本技术中，所述载体的表面可以具有羟基修饰。
[0094]
在本技术中，所述载体-上游引物偶联物中，所述载体与所述上游引物可以通过所述氨基修饰功能基团连接。例如，所述载体-上游引物偶联物中，所述载体与所述上游引物可以通过所述氨基修饰功能基团中氨基与所述载体的表面的羟基相互作用而连接。
[0095]
在本技术中，所述载体-上游引物偶联物中，所述载体可以与所述上游引物的5’端连接。
[0096]
在本技术中，所述载体-上游引物偶联物的浓度可以为约1000-约10000个/反应。例如，所述载体-上游引物偶联物的浓度可以为约2500个-约10000个/反应。
[0097]
下游引物
[0098]
在本技术中，所述下游引物可以包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的下游特异性序列。例如，所述下游特异性序列可以与包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的dna序列的3
’‑5’
的链的至少部分序列相同。
[0099]
在本技术中，所述标记可以直接或间接使pcr扩增产物显色。
[0100]
在本技术中，所述标记可以包括生物素标记和/或荧光素标记。例如，所述荧光素标记可以包括cy3，hex，bodipy-tmrx和/或tamra。例如，所述荧光素标记可以为bodipy-tmrx。
[0101]
在本技术中，所述标记可以与所述下游特异性序列的5’端直接或间接连接。
[0102]
在本技术中，所述下游引物的浓度可以为约100-约300nm。例如，可以为约100-约280nm、约100-约260nm、约100-约240nm、约100-约220nm、约100-约200nm、约100-约180nm、约100-约160nm、约100-约140nm、约120-约300nm、约160-约300nm或约200-约300nm。
[0103]
样本
[0104]
在本技术中，所述样本中的dna可以经重亚硫酸盐处理或酶学法转化。所述方法可以将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，这些尿嘧啶会在随后的pcr扩增中变成胸腺嘧啶。而甲基化胞嘧啶在这个过程中保持不变。所述重亚硫酸盐处理或酶学法转化可以使用
试剂盒实现。
[0105]
在本技术中，所述样本可以包括基因组dna、质粒dna、线粒体dna、游离dna、和/或合成dna。
[0106]
在本技术中，所述样本的来源可以包括细胞、组织、器官和/或样本。例如，所述细胞、组织、器官和/或样本可以来源于微生物、植物、动物和/或人。例如，所述样本可以来源于血液样本、血浆样本、ffpe样本、组织样本、粪便样本和/或尿液样本。例如，所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本可以来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。例如，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。本技术的方法可以适用于不同的的适应症患者和/或不同的从患者处获得的样本来源。
[0107]
方法
[0108]
在本技术中，所述的检测方法还可以包括以下步骤：对样本dna进行重亚硫酸盐处理。
[0109]
在本技术中，经过步骤b)，可以获得包含所述载体和荧光标记的甲基化特异性产物；例如，可以获得带有磁珠和/或微球-荧光标记的甲基化特异性产物。例如，可以获得带有磁珠和/或微球-生物素标记的甲基化特异性产物。
[0110]
在本技术中，步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物可以连接有所述载体。
[0111]
在本技术中，步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物可以带有能够直接或间接使所述扩增产物显色的标记。
[0112]
在本技术中，步骤b)所述的pcr扩增的次数可以为1次。
[0113]
在本技术中，步骤b)所述的pcr扩增可以包括选自下组反应步骤：1)预变性95℃2-5min，热循环95℃15-20s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min；2)预变性95℃5-10min，热循环95℃15-30s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min；以及，3)预变性95℃5-15min，热循环95℃15-30s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。
[0114]
例如，所述pcr扩增可以包括以下的反应步骤：预变性95℃2-5min，热循环95℃15-20s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。例如，所述pcr扩增可以包括以下的反应步骤：预变性95℃5-15min，热循环95℃15-30s，52-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。
[0115]
在本技术中，所述方法还可以包括以下步骤：获得非特异性于目的基因的甲基化位点的内参引物，其中所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物；利用所述内参引物进行步骤b)所述的pcr扩增。
[0116]
在本技术中，所述内参引物上游引物的5’端可以包括氨基修饰。在本技术中，所述内参下游引物的5’端可以带有标记。
[0117]
在本技术中，所述内参引物可以作为对照引物，由于其无法实现特异性扩增目的基因的甲基化位点，但可以扩增其他参照基因(例如β-actin基因)，因此可以用于检测pcr扩增体系的准确性。
[0118]
在本技术中，所述方法还可以包括以下的步骤：c)使步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物产生荧光信号并检测，根据所述荧光信号获得所述样本的甲基化修饰情况。
[0119]
在本技术中，所述检测可以包括使用液相芯片系统检测。
[0120]
在本技术中，所述扩增产物中，所述生物素可以与链霉亲和素标记的荧光染料相结合而产生荧光信号。
[0121]
在本技术中，所述扩增产物中，所述荧光标记可以产生荧光信号。
[0122]
在本技术中，可以使用生物素-链酶亲和素(或亲和素)系统来使得所述扩增产物产生荧光信号。例如，所述磁珠和/或微球可以包被链酶亲和素，该磁珠和/或微球可
[0123]
素的所述扩增产物结合而产生荧光信号。在某些情况下，也可以使用其他不同的亲和结合伙伴来替代所述生物素-链酶亲和素(或亲和素)系统，例如，可以使用抗原/半抗原和抗体，或者酶和对应的底物。
[0124]
在本技术中，步骤c)可以包括对所述包含所述载体和荧光标记的甲基化特异性产物(例如带有磁珠和/或微球-荧光标记的甲基化特异性产物)产生的荧光信号进行检测，并进行数据分析。
[0125]
在本技术中，步骤c)可以包括使对所述包含所述载体和荧光标记的甲基化特异性产物(例如带有磁珠和/或微球-生物素标记的甲基化特异性产物)产生的荧光信号进行检测，并进行数据分析。例如，可以使用链霉亲和素标记的荧光染料(sape)对所述带有磁珠和/或微球-生物素标记的甲基化特异性产物进行荧光标记。在本技术中，所述荧光标记的反应条件可以为在约25-约37℃条件下反应约10-约30min。
[0126]
在本技术中，所述检测可以通过液相芯片系统检测。
[0127]
本技术所述的方法可以具有以下优点中的一种或多种：
[0128]
1、操作简单，节省了大量检测时间，可快速，高通量(例如1次可以检测100个以上的样本)的进行检测。
[0129]
2、pcr扩增后即可上机检测，降低了pcr产物开盖污染的风险。
[0130]
3、检测准确度高，特异性强，所需dna样本量少，适用于微量dna样本的检测。
[0131]
4、可进行多重检测。
[0132]
5、可应用于各领域多位点dna甲基化检测，例如，癌症筛查、疾病诊断、科学研究等。
[0133]
6、可用于多种样本类型(例如，人类血液样本、血浆样本、ffpe样本、组织样本、粪便样本、尿液样本以及植物微生物)。
[0134]
另一方面，本技术提供一种能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点上游引物，其5’端包括氨基修饰。
[0135]
在本技术中，所述上游引物的5’端具有氨基修饰功能基团，其中所述氨基修饰功能基团包含至少一个自由的氨基。
[0136]
在本技术中，所述氨基修饰功能基团包含5’amino c6～c18。
[0137]
在本技术中，所述上游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的上游特异性序列。
[0138]
在本技术中，所述上游特异性序列包含seq id no.1,3-4中任一项所示的核苷酸序列。
[0139]
在本技术中，所述的上游引物中所述氨基修饰功能基团与所述上游特异性序列的5’端直接或间接连接。
[0140]
另一方面，本技术提供一种能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的pcr引
物对，其包含根据本技术所述上游引物和下游引物。
[0141]
在本技术中，所述下游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的下游特异性序列。
[0142]
在本技术中，所述下游特异性序列包含seq id no.2,6-7中任一项所示的核苷酸序列。
[0143]
在本技术中，所述下游引物的5’端带有标记。
[0144]
在本技术中，所述标记能够直接或间接使pcr扩增的扩增产物显色。
[0145]
在本技术中，所述标记包括生物素和/或荧光标记。
[0146]
在本技术中，所述标记与所述下游特异性序列的5’端直接或间接连接。
[0147]
另一方面，本技术提供一种甲基化检测试剂盒，其包含本技术所述的上游引物，和/或，本技术所述的pcr引物对。
[0148]
本技术还提供了以下的实施方式：
[0149]
1.一种甲基化检测的方法，其包括以下步骤：
[0150]
a)获得特异性于目的基因的甲基化位点的pcr引物，所述pcr引物包括上游引物以及下游引物，其中所述上游引物的5’端包括氨基修饰；且所述下游引物的5’端带有标记；
[0151]
b)将所述上游引物与载体偶联，获得载体-上游引物偶联物；利用所述载体-上游引物偶联物和所述下游引物对样本进行pcr扩增。
[0152]
2.根据实施方式1所述的方法，其中所述氨基修饰包括使上游引物的5’端具有氨基修饰功能基团，其中所述氨基修饰功能基团包含至少一个自由的氨基。
[0153]
3.根据实施方式2所述的方法，其中所述氨基修饰功能基团包含5’amino c6～c18。
[0154]
4.根据实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述上游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的上游特异性序列。
[0155]
5.根据实施方式4所述的方法，其中所述氨基修饰功能基团与所述上游特异性序列的5’端直接或间接连接。
[0156]
6.根据实施方式1-5中任一项所述的方法，其中所述上游引物的浓度为约100-约300nm。
[0157]
7.根据实施方式1-6中任一项所述的方法，其中所述载体包括固相载体和/或液相载体。
[0158]
8.根据实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述载体包括磁珠和/或微球。
[0159]
9.根据实施方式1-8中任一项所述的方法，其中所述载体的表面具有羟基修饰。
[0160]
10.根据实施方式2-9中任一项所述的方法，其中所述载体-上游引物偶联物中，所述载体与所述上游引物通过所述氨基修饰功能基团连接。
[0161]
11.根据实施方式2-10中任一项所述的方法，其中所述载体-上游引物偶联物中，所述载体与所述上游引物通过所述氨基修饰功能基团中氨基与所述载体表面的羟基相互作用而连接。
[0162]
12.根据实施方式1-11中任一项所述的方法，其中所述载体-上游引物偶联物中，所述载体与所述上游引物的5’端连接。
[0163]
13.根据实施方式1-12中任一项所述的方法，其中所述载体-上游引物偶联物的浓
度为约1000-约10000个/反应。
[0164]
14.根据实施方式1-13中任一项所述的方法，其中所述下游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的下游特异性序列。
[0165]
15.根据实施方式1-14中任一项所述的方法，其中所述标记能够直接或间接使pcr扩增的扩增产物显色。
[0166]
16.根据实施方式1-15中任一项所述的方法，其中所述标记包括生物素标记和/或荧光素标记。
[0167]
17.根据实施方式1-16中任一项所述的方法，其中所述标记与所述下游特异性序列的5’端直接或间接连接。
[0168]
18.根据实施方式1-17中任一项所述的方法，其中所述下游引物的浓度为约100-约300nm。
[0169]
19.根据实施方式1-18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：获得非特异性于目的基因的甲基化位点的内参引物，其中所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物；利用所述内参引物进行步骤b)所述的pcr扩增。
[0170]
20.根据实施方式19所述的方法，其中所述内参引物上游引物的5’端包括氨基修饰。
[0171]
21.根据实施方式19-20中任一项所述的方法，其中所述内参下游引物的5’端带有标记。
[0172]
22.根据实施方式1-21中任一项所述的方法，其中所述样本中的dna经重亚硫酸盐处理和/或经酶学法转化。
[0173]
23.根据实施方式1-22中任一项所述的方法，其中所述样本包括基因组dna、质粒dna、线粒体dna、游离dna、和/或合成dna。
[0174]
24.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，其中所述样本的来源包括细胞、组织、器官和/或样本。
[0175]
25.根据实施方式24所述的方法，其中所述细胞、组织、器官和/或样本来源于微生物、植物、动物和/或人。
[0176]
26.根据实施方式1-25中任一项所述的方法，其中所述样本来源于血液样本、血浆样本、ffpe样本、组织样本、粪便样本和/或尿液样本。
[0177]
27.根据实施方式24-26中任一项所述的方法，其中所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。
[0178]
28.根据实施方式27所述的方法，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
[0179]
29.根据实施方式1-28中任一项所述的方法，其中步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物连接有所述载体。
[0180]
30.根据实施方式1-29中任一项所述的方法，其中步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物带有能够直接或间接使所述扩增产物显色的标记。
[0181]
31.根据实施方式1-30中任一项所述的方法，其中步骤b)所述的pcr扩增的次数为1次。
[0182]
32.根据实施方式1-31中任一项所述的方法，其中步骤b)所述的pcr扩增包括选自下组反应步骤：
[0183]
1)预变性95℃2-5min，热循环95℃15-20s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min；
[0184]
2)预变性95℃5-10min，热循环95℃15-30s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min；以及，
[0185]
3)预变性95℃5-15min，热循环95℃15-30s，52℃-60℃20-30s，72℃40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。
[0186]
33.根据实施方式1-32中任一项所述的方法，其还包括以下的步骤：
[0187]
c)使步骤b)所述的pcr扩增的扩增产物产生荧光信号并检测，根据所述荧光信号获得所述样本的甲基化修饰情况。
[0188]
34.根据实施方式33所述的方法，其中所述检测包括使用液相芯片系统检测。
[0189]
35.根据实施方式33-34中任一项所述的方法，其中所述扩增产物中，所述生物素能够与链霉亲和素标记的荧光染料相结合而产生荧光信号。
[0190]
36.根据实施方式33-35中任一项所述的方法，其中所述扩增产物中，所述荧光标记能够产生荧光信号。
[0191]
37.能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点上游引物，其5’端包括氨基修饰。
[0192]
38.根据实施方式37所述的上游引物，其中所述上游引物的5’端具有氨基修饰功能基团，其中所述氨基修饰功能基团包含至少一个自由的氨基。
[0193]
39.根据实施方式38所述的上游引物，其中所述氨基修饰功能基团包含5’amino c6～c18。
[0194]
40.根据实施方式37-39中任一项所述的上游引物，其包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的上游特异性序列。
[0195]
41.根据实施方式40所述的上游引物，其中所述上游特异性序列包含seq id no.1,3-4中任一项所示的核苷酸序列。
[0196]
42.根据实施方式37-41中任一项所述的上游引物，其中所述氨基修饰功能基团与所述上游特异性序列的5’端直接或间接连接。
[0197]
43.能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的pcr引物对，其包含根据实施方式1-36中任一项所述上游引物和下游引物。
[0198]
44.根据实施方式43所述的pcr引物对，其中所述下游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的下游特异性序列。
[0199]
45.根据实施方式44所述的pcr引物对，其中所述下游特异性序列包含seq id no.2,6-7中任一项所示的核苷酸序列。
[0200]
46.根据实施方式43-45中任一项所述的pcr引物对，其中所述下游引物的5’端带有标记。
[0201]
47.根据实施方式46所述的pcr引物对，其中所述标记能够直接或间接使pcr扩增的扩增产物显色。
[0202]
48.根据实施方式46-47中任一项所述的pcr引物对，其中所述标记包括生物素和/或荧光标记。
[0203]
49.根据实施方式46-48中任一项所述的pcr引物对，其中所述标记与所述下游特异性序列的5’端直接或间接连接。
[0204]
50.一种甲基化检测试剂盒，其包含实施方式37-42中任一项所述的上游引物，和/或，实施方式43-49中任一项所述的pcr引物对。
[0205]
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术的方法和用途等，而不用于限制本技术发明的范围。
[0206]
实施例
[0207]
实施例1磁珠引物偶联
[0208]
1、本实施例所述引物由金斯瑞生物科技公司合成，所述试剂mes(2-(n-吗啉)乙磺酸)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma m3671)，edac n'-(乙基亚胺基亚甲基)-n,n-二甲基-1,3-丙二胺单盐酸盐购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma e7750)。tween-20(吐温-20)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8220)，sds(十二烷基硫酸钠)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio s8010)。
[0209]
2、pcr上下游引物针对目的基因甲基化位点设计，上游引物5’末端行进amino modifier c12修饰，目的在于探针氨基与磁珠羟基偶联。
[0210]
引物序列长度为18-25bp，tm值为55-65℃
[0211]
上游引物序列如下：step9-m-f 5’amino modifier c12-ttttcgttatggttcggttt-3'(seq id no.1)
[0212]
探针用纯水稀释至0.1纳摩尔(nanomole)，备用。
[0213]
3、磁珠为luminex公司的表面羟基修饰的magplex磁珠，适用于luminex公司的magpix或luminex100/200液相悬浮芯片系统。也可采用其他羟基表面修饰的磁珠及其他液相芯片系统，在此不做限定。
[0214]
4、偶联步骤：
[0215]
1)取未偶联的magplex磁珠1.25
×
106个，加入到1.5ml离心管中，放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0216]
2)加入10μl 0.1m mes，ph 4.5，充分振荡混匀，超声20s。
[0217]
3)继续在离心管中加入2μl探针(0.1nanomole)，涡旋混匀。
[0218]
4)新鲜配制10mg/ml edac，取0.75μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min。
[0219]
5)再次加入新鲜配制的10mg/ml edac，取0.75μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min。
[0220]
6)加入1ml体积百分比为0.02％tween-20至上述离心管中，放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0221]
7)加入1ml体积百分比为0.1％sds溶放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0222]
8)加入50μl ph8.0的te溶液(其中物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta)涡旋混匀，得到偶联好的捕获磁珠偶联物。
[0223]
9)使用血细胞计数器计数磁珠数量，如需保存，应在2～8℃避光保存。
[0224]
实施例2检测特异性分析
[0225]
1、本实施例所述引物由金斯瑞生物科技公司合成，所述含有m-step9，m-vim，m-foxe1，β-actin甲基化位点的目的区域和nc(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；2
×
epiart hs taq master mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(vazyme，em202-01)；tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公
司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0226]
2、引物探针设计及合成
[0227]
pcr下游引物针对甲基化位点设计，所述的引物的纯度应达到电泳级(page)或hplc级，下游引物5’端进行生物素修饰
[0228]
合成引物，序列如下：
[0229]
下游引物：step9-m-r 5’bodipy-tmrx-ctaaaaaacaatcctaaacacac-3'(seq id no.2)
[0230]
其中bodipy-tmrx表示荧光修饰。
[0231]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解。
[0232]
按照磁珠-引物偶联物的数量为250个/反应，下游引物浓度范围在100-300nm进行磁珠引物配制。
[0233]
3、标准品和阴性参照品合成
[0234]
m-step9，m-vim，m-foxe1，m-β-actin甲基化位点的目的区域标准品和nc阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至10
15
拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取10
10
拷贝/ml作为标准品模板，使用m-vim，m-step9，m-foxe1，m-β-actin分别检测step9磁珠-引物偶联物和step9引物的特异性。
[0235]
4、特异性分析
[0236]
1)m-step9，m-vim，m-foxe1，m-β-actin甲基化位点的目的区域标准品，nc阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测。
[0237]
2)本实施例pcr扩增体系如表1所示：
[0238]
表1.本实施例特异性分析的10μl pcr扩增体系
[0239]
成分体积磁珠pcr引物混合液2.8μl2
×
epiart hs taq master mix5μl转化后dna模板2μlddh2o至10μl
[0240]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0241][0242]
3)洗涤：将步骤2)pcr产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific，
vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0243]
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0244]
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0245]
6)检测结果如表2所示，m-step9，m-vim，m-foxe1，m-β-actin为甲基化位点的目的区域标准品，nc为阴性标准品。
[0246]
表2.磁珠-引物特异性检测结果
[0247]
位置样本b39_step91(1,a1)m-vim292(1,b1)m-foxe1273(1,c1)m-β-actin194(1,d1)m-step96195(1,e1)nc40
[0248]
本检测方法step9引物能够特异性的区分m-step9标准品，说明该方法特异性较好。
[0249]
实施例3多重检测分析
[0250]
1、本实施例所述引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；所述阴性标准品为经重亚硫酸盐转化人类非甲基化dna购自zymo research生物公司(zymo research，d5014)；组织提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(tiangen，dp304)；2
×
epiart hs taq master mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(vazyme，em202-01)；tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0251]
2、按照实施例1说明的方法，进行探针设计及合成，序列如下
[0252]
上游引物：foxe1-m-f 5’amino modifier c12-tttgttcgtttttcgattgttc-3'(seq id no.3)
[0253]
上游引物：vim-m-f 5’amino modifier c12-atgttacgcgtttttttgtc-3'(seq id no.4)
[0254]
上游引物：β-actin-m-f 5’amino modifier c12-tttaatgttacgtacgatttttc-3'(seq id no.5)
[0255]
按照实施例1说明的方法进行磁珠-引物偶联，将偶联的磁珠-引物偶联物进行细
胞计数器计数微珠数量。
[0256]
3、按照实施例2说明的方法，进行引物设计及合成，序列如下
[0257]
下游引物:foxe1-m-r 5’bodipy-tmrx-taacgctataaaactcctaccgc-3’(seq id no.6)
[0258]
下游引物:vim-m-r 5’bodipy-tmrx-aactccaccttctcgttaatac-3'(seq id no.7)
[0259]
内参基因引物:
[0260]
下游引物:β-actin-m-r 5’bodipy-tmrx-gtaggatggtatggggga-3'(seq id no.8)
[0261]
其中bodipy-tmrx表示荧光修饰。
[0262]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解。
[0263]
按照每种磁珠-引物偶联物的数量为2500个/反应，每种下游引物浓度范围在100-300nm进行磁珠引物配制。
[0264]
4、组织样本的提取：天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)，按照说明书方法，对5个人类结直肠癌组织样本和5个非结直肠癌样本组织进行dna提取。
[0265]
5、使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化dna和人类非甲基化dna(zymo research，d5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织dna样本作为待测样本。
[0266]
6、多重检测
[0267]
1)本实施例pcr扩增体系如下表3所示：
[0268]
表3.本实施例多重检测的10μl pcr扩增体系
[0269]
成分体积pcr引物混合液(2.5μm)2.8μl2
×
epiart hs taq master mix5μl转化后dna模板2μlddh2o至10μl
[0270]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0271][0272]
2)洗涤：反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0273]
3)液相芯片平台检测：步骤2)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0274]
4)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检
测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0275]
7、实验结果如表4所示，nc为阴性对照，pc为阳性对照。
[0276]
表4.本实施例结直肠癌样本多重检测结果
[0277]
位置样本b39_step9b55_foxe1b66_vimb72_β-actin1(1，a1)c17965604345672(1，b1)c2902784.564.57953(1，c1)c375456897.53404(1，d1)c4809204.5832314.55(1，e1)c5879.58223645926(1，f1)h15543435517(1，f1)h23590.554.5657.58(1，g1)h331131414479(1，a2)h433.592.54265010(1，b2)h53259.55254211(1，c2)pc847652.5548.563212(1，d2)nc34.554315213(1，e2)h41435237
[0278]
阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应nc值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于2个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将结直肠癌样本区分出来。
[0279]
实施例4检测特异性分析
[0280]
1、本实施例的引物由金斯瑞生物科技公司合成，含有m-step9，m-vim，m-foxe1，β-actin甲基化位点的目的区域和nc(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；2
×
taq master mix(所需的taq酶、dntp混合物，mgcl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自takala公司(takala，rr001b)；sape原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(life technologies，s-866)；tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigmat3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigmal7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbiot8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0281]
2、引物探针设计及合成
[0282]
pcr下游引物针对甲基化位点设计，引物的纯度应达到电泳级(page)或hplc级，下游引物5’端进行生物素修饰。
[0283]
合成引物，序列如下：
[0284]
下游引物：step9-m-r 5’biotin-ctaaaaaacaatcctaaacacac-3'
[0285]
其中biotin表示生物素修饰。
[0286]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解。
[0287]
按照磁珠-引物偶联物的数量为2500个/反应，下游引物浓度范围在100-300nm进行磁珠引物配制。
[0288]
3、标准品和阴性参照品合成
[0289]
m-step9，m-vim，m-foxe1，m-β-actin甲基化位点目的区域标准品和nc阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至10
15
拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取10
10
拷贝/ml作为标准品模板，使用m-vim，m-step9，m-foxe1，m-β-actin分别检测step9磁珠-引物偶联物和step9引物的特异性。
[0290]
4、特异性分析
[0291]
1)m-step9，m-vim，m-foxe1，m-β-actin甲基化位点的目的区域标准品，nc阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测。
[0292]
2)本实施例pcr扩增体系如表5所示：
[0293]
表5.本实施例特异性分析的10μl pcr扩增体系
[0294]
成分体积磁珠pcr引物混合液2.8μl2
×
taq酶mix5μl待测模板2μlddh2o至10μl
[0295]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0296][0297]
3)荧光标记：制备sape混合液，包括sape原液(life technologies，s-866)1.875μl；1
×
tm杂交液(0.2m nacl，0.1m tris，0.08％triton x-100，ph 8.0)125μl。将步骤2)pcr产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific,vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配制好的sape混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置pcr仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0298]
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0299]
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0300]
6)检测结果如表6所示，m-step9，m-vim，m-foxe1，m-β-actin为甲基化位点的目的区域标准品，nc为阴性标准品。
[0301]
表6.磁珠-引物偶联物特异性检测结果
[0302]
位置样本b39_step91(1,a1)m-vim252(1,b1)m-foxe1373(1,c1)m-β-actin284(1,d1)m-step97195(1,e1)nc42
[0303]
本检测方法step9引物能够特异性的区分m-step9标准品，说明该方法特异性较好。
[0304]
实施例5多重检测分析
[0305]
1、本实施例的引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；阴性标准品为经重亚硫酸盐转化人类非甲基化dna购自zymo research生物公司(zymo research，d5014)；组织提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(tiangen，dp304)；2
×
taq master mix(所需的taq酶、dntp混合物；mgcl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自takala公司(takala，rr001b)；sape原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(life technologies，s-866)，tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0306]
2、按照实施例1说明的方法，进行探针设计及合成，序列如下
[0307]
上游引物：
[0308]
foxe1-m-f 5’amino modifier c12-tttgttcgtttttcgattgttc-3'(seq id no.3)
[0309]
上游引物：
[0310]
vim-m-f 5’amino modifier c12-atgttacgcgtttttttgtc-3'(seq id no.4)
[0311]
上游引物：
[0312]
β-actin-m-f 5’amino modifier c12-tttaatgttacgtacgatttttc-3'(seq id no.5)
[0313]
按照实施例1说明的方法进行磁珠-引物偶联，将偶联的磁珠-引物偶联物进行细胞计数器计数微珠数量。
[0314]
3、按照实施例2说明的方法，进行引物设计及合成，序列如下
[0315]
下游引物：
[0316]
foxe1-m-r 5’biotin-taacgctataaaactcctaccgc-3'(seq id no.6)
[0317]
下游引物：
[0318]
vim-m-r 5’biotin-aactccaccttctcgttaatac-3'(seq id no.7)
[0319]
内参基因引物：
[0320]
下游引物：
[0321]
β-actin-m-r 5’biotin-gtaggatggtatggggga-3'(seq id no.8)
[0322]
其中biotin表示生物素修饰。
[0323]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解。
[0324]
按照每种磁珠-引物偶联物的数量为2500个/反应，每种下游引物浓度范围在100-300nm进行磁珠引物配制。
[0325]
4、组织样本的提取：天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)，按照说明书方法，对5个人类结直肠癌组织样本和5个非结直肠癌样本组织进行dna提取。
[0326]
5、使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化dna和人类非甲基化dna(zymo research，d5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织dna样本作为待测样本。
[0327]
6、多重检测
[0328]
1)本实施例pcr扩增体系如下表7所示：
[0329]
表7.本实施例多重检测的10μlpcr扩增体系
[0330]
成分体积磁珠pcr引物混合液2.8μl2
×
taq酶mix5μl转化后dna模板2μlddh2o至10μl
[0331]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0332][0333]
2)荧光标记：制备sape混合液，包括sape原液(life technologies，s-866)5.25μl；1
×
tm杂交液(0.2m nacl，0.1m tris，0.08％triton x-100，ph 8.0)350μl。将步骤1)pcr产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific，vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配制好的sape混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置pcr仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0334]
3)液相芯片平台检测：步骤2)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0335]
4)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0336]
7、实验结果如表8所示，nc为阴性对照，pc为阳性对照。
[0337]
表8.本实施例结直肠癌样本多重检测结果
[0338]
位置样本b39_step9b55_foxe1b66_vimb72_β-actin1(1，a1)c1480790873.58342(1，b1)c2708.58037515783(1，c1)c3937744.5881695.54(1，d1)c498631.59888125(1，e1)c575.5523275726(1，f1)h15143435507(1，f1)h23633.5216058(1，g1)h33840.5118.55079(1，a2)h451434371510(1，b2)h54433.511350511(1，c2)pc729982.576069612(1，d2)nc353846.56013(1，e2)h3288.56845
[0339]
阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应值nc值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于2个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将结直肠癌样本区分出来。
[0340]
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本技术所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。