一株高产脂肪酶菌株及其在油脂降解中的应用的制作方法

1.本发明涉及一株高产脂肪酶菌株及其在生产脂肪酶、油脂降解中的应用，属于工业微生物领域技术。


背景技术：

2.脂肪酶是参与生物体内脂代谢的重要酶类，因其具有催化酯水解、酯交换反应的特点，在食品、洗涤、制革和医药等行业应用广泛，近年来研究发现部分脂肪酶(特别是微生物脂肪酶)还具有催化酯合成反应的特性，继而开辟了利用脂肪酶催化废弃油脂与低碳醇类酯化得到生物柴油的研究，因此脂肪酶在环境治理和生产新能源方面也具有巨大的应用空间。微生物相比于动植物具有的生长周期短，易培养的优点，使源于微生物的脂肪酶成为了工业生产酶制剂的首选。
3.国内对脂肪酶的应用多集中在假单胞菌、假丝酵母及曲霉几种，本发明分离获得的菌株acinetobacter junii wco-9，其分离环境特殊，同时该菌对油脂的显著降解效果和较高的脂肪酶活性要明显优于同种琼氏不动杆菌 aj11037，经调研发现，该菌株的高脂肪酶活力还未有报道，因此具有极大的研究和应用价值。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
5.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一株高产脂肪酶菌株，其分类命名为acinetobacter junii wco-9，已于2021年8月2日在广东省微生物菌种保藏中心(地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼)登记保藏，保藏编号为gdmcc no：61851。
6.本发明还提供一种如上所述的高产脂肪酶菌株在油脂降解中的应用。
7.优选的是，将植物油和浓度为3～5wt％的pva混合，超声乳化，制成乳化液，将乳化液和lb培养基混合，接种高产脂肪酶菌株acinetobacter juniiwco-9，恒温培养，实现油脂降解。
8.优选的是，所述植物油与浓度为3～5wt％的pva的体积比为1：3～6；所述超声乳化的时间为10～30min；所述乳化液与lb培养基的体积比为3:10～20；所述恒温培养的温度为28～35℃；所述恒温培养的时间为3～5d。
9.优选的是，将植物油和浓度为3～5wt％的pva混合，超声乳化，制成乳化液，将乳化液和lb培养基混合，加入浓度为10wt％罗丹明b制成罗丹明油脂平板，接种高产脂肪酶菌株acinetobacter junii wco-9于油脂平板，恒温培养，实现油脂降解。
10.优选的是，所述植物油与浓度为3～5wt％的pva的体积比为1：3～6；所述超声乳化的时间为10～30min；所述乳化液与lb培养基的体积比为3:10～20；所述浓度为10wt％罗丹明b与乳化液的体积比为1:120～180；所述恒温培养的温度为28～35℃；所述恒温培养的时
间为3～5d。
11.本发明还提供一种如上述的高产脂肪酶菌株在生产脂肪酶中的应用，其特征在于，该高产脂肪酶菌株对c
10-c
18
长链脂肪酸底物的活性在 200～2000u/ml。
12.优选的是，在长链脂肪酸底物溶液中加入tris-hcl缓冲液，混匀，然后加入高产脂肪酶菌株培养得到的粗酶液，37℃水浴反应10～15min，加入浓度为10wt％的三氯乙酸终止反应，再加入浓度为10wt％的na2co3溶液显色， 410nm测定光吸收值，利用对硝基苯酚法测定脂肪酶活性。
13.优选的是，所述长链脂肪酸底物溶液与tris-hcl缓冲液的体积比为 1:10～13；所述tris-hcl缓冲液的浓度为40～60mmol/l，ph为8.0；所述长链脂肪酸底物溶液与粗酶液的体积比为6～8:1；所述长链脂肪酸底物溶液与浓度为10wt％的三氯乙酸的体积比为1：2～4；所述长链脂肪酸底物溶液与浓度为 10wt％的na2co3溶液的体积比为1：2～4。
14.优选的是，所述粗酶液的生产方式为：将高产脂肪酶菌株划线活化，挑取单菌落于15～30ml lb液体培养基30℃，150～300r/min摇瓶培养12～24h 制备种子液，种子液按0.5～2％接种量接种于含有30～60ml lb培养基的发酵瓶中，振荡培养36～72h；发酵液充分摇匀后6000～10000r/min离心3～8min 取上清液即为粗酶液；
15.所述长链脂肪酸底物溶液的生产方法为：取长链脂肪酸底物加入异丙醇中，混匀，得到长链脂肪酸底物溶液；所述长链脂肪酸底物与异丙醇的质量体积比为1.5～4.5mg:1ml；所述长链脂肪酸底物为对硝基苯葵酸、月桂酸、豆蔻酸、硬脂酸、棕榈酸酯中的任意一种。
16.本发明的一株高产脂肪酶菌株，通过以下研究方法得到：采集厨余油脂污染环境的土壤，经过生理盐水预处理、富集培养和稀释涂布，分离筛选出一株产脂肪酶菌株，菌株理化性质为lb培养基(ph 7.0左右)、30℃、有氧条件下良好生长，在lb固体培养基上生长16h能够形成明显的单菌落，菌落形状呈圆形隆起，颜色为白色，革兰氏阴性菌，球状，多二联体。利用 16s rdna通用引物f27/r1492扩增该菌株16s rdna序列，经测序比对结果表明该菌株分类地位为琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)，本发明将其命名为acinetobacter junii wco-9(后续简写为wco-9)，菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏号gdmcc no：61851，菌落形态和系统发育树分别如图1、2所示；其16srdna序列如seq id no：1所示。
17.本发明至少包括以下有益效果：
18.(1)本发明的一株高产脂肪酶菌株，其理化性质：菌落圆润隆起，呈白色，革兰氏阴性菌，多二联体，30℃，lb培养基，有氧条件下生长良好，12-16h 可生长至对数期。
19.(2)本发明分离获得的菌株acinetobacter junii wco-9，其分离环境特殊，同时该菌对油脂的显著降解效果和较高的脂肪酶活性要明显优于同种琼氏不动杆菌aj11037，经调研发现，该菌株的高脂肪酶活力还未有报道，因此具有极大的研究和应用价值。
20.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明：
21.图1为本发明菌株wco-9的形态学特征，其中：a是菌株wco-9的菌落形态；b是菌株
wco-9的革兰氏染色形态；
22.图2是菌株wco-9基于16s rdna序列的系统进化分析；
23.图3是实施例1中挑取纯化后的菌株单菌落，进行革兰氏染色的流程图；
24.图4是菌株wco-9对油脂的降解图；
25.图5是实施例3标准曲线绘制的材料用量图表；
26.图6是实施例3绘制的标准曲线；
27.图7是实施例3对硝基苯酚法测定的菌株wco-9对不同链长脂肪酸底物的水解活性。
具体实施方式：
28.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
29.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
30.实施例1：
31.一株高产脂肪酶菌株，其特征在于，其分类命名为acinetobacter junii wco-9，已于2021年8月2日在广东省微生物菌种保藏中心(地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼)登记保藏，保藏编号为 gdmcc no：61851；
32.其中，菌株wco-9的筛选纯化及鉴定过程：
33.富集培养基：酵母膏0.2g/l，nacl 0.5g/l，na2hpo
4 3.5g/l，kh2po
4 1.5 g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，罗丹明油脂培养基：175ml lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l) 25ml乳化液，固体培养基中加入琼脂粉15g/l，再按培养基：10wt％罗丹明b＝1000：1加入罗丹明b溶液摇匀染色。乳化液的配制：配制4wt％聚乙烯醇(pva)溶液和10wt％罗丹明 b溶液并分别用4层纱布和细菌微孔过滤器过滤，备用，将4wt％pva和橄榄油以体积比3：1混合，用超声破碎仪置于冰上处理20min，期间每3-5分钟取出搅拌摇匀，直至溶液全部变为乳白色，表面无黄色油珠即为合格的乳化液(乳化液现配现用，4℃放置有效期为1周)。
34.采集西南科技大学范围内长期受到油脂污染的土样，采集土壤表层及以下1-2cm的土壤。取土样5g于45ml生理盐水中，30℃，200r/min振荡混匀 1h，静置后取1ml上清液于20ml富集培养基中，30℃，200r/min振荡培养 24h，将过夜培养24h后的菌液按10-1-10-8
梯度稀释，选取10-6-10-8 3个梯度各取100μl均匀涂布于罗丹明油脂筛选平板，涂布平板置于30℃恒温培养箱黑暗培养2d，标记产生透明圈的菌落，挑取各平板全部菌落于lb平板划线纯化2-3次，挑取单一菌落于20ml lb液体培养基培养至od600为0.6-0.8 后对菌种进行甘油保藏。
35.挑取纯化后的菌株单菌落，按图3步骤进行革兰氏染色，观察菌落形态，其菌落为白色隆起呈圆形，边缘圆润规则，表面湿润，细菌呈球状或短杆状、无芽孢、不运动、多二联体，革兰氏阴性菌(如图3)。
36.扩增菌株wco-9的16s rdna序列并测序，经过blast比对和n-j法聚类分析(如图2)，确定该菌株为不动杆菌属细菌，其分类地位为琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)，
16s rdna比对结果显示本发明的wco-9菌株与acinetobacter junii atcc 17908(ncbi登录号：nr_117623.1)高度一致，序列一致性达99.93％，同时系统发育树也表明两者同源性极高。经查询， acinetobacter junii atcc 17908菌株在中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号accc no：11037，由此我们将它作为本发明菌株的对照菌株，实验中以aj11037命名。
37.实施例2：菌株wco-9对油脂的降解实验：
38.将4wt％pva和植物油以体积比4:1混合，用超声破碎仪处理20min制成乳化液，将30ml乳化液和170ml lb培养基混合，加入200μl 10wt％罗丹明b染色倒平板制备罗丹明油脂平板；将菌株wco-9和菌株aj11037培养至相同od
600
(od
600
＝0.6-0.8)后，分别取10μl菌液点于油脂平板，30℃恒温培养4d后在紫外灯下观察透明圈，根据所产生的降解圈结果表明，菌株 wco-9对多种油脂都有明显的降解效果，并且效果要显著优于aj11037(如图4，图中左边为wco-9)，(油脂降解圈直径大小说明wco-9菌株的油脂降解能力要明显优于aj11037)。
39.实施例3：菌株wco-9的脂肪酶活性测定：
40.标准曲线的绘制：称取0.08346g对硝基酚，先用少量95％乙醇溶解，然后用水定容至l00ml，浓度为6mmol/l。按图5所示分别加入不同量的对硝基酚溶液和50mmol/l tris-hcl(ph 8.0)缓冲液，然后每管加入0.25ml 10％三氯乙酸，再加入0.25ml 10％na2co3溶液，总体积为1.5ml，410nm测定光吸收值。然后，绘制标准曲线，如图6所示；每组3个重复；
41.将待测菌株(菌株wco-9和菌株aj11037)划线活化，挑取单菌落于 20ml lb液体培养基30℃，200r/min摇瓶培养16h制备种子液，种子液按1％接种量接种于含有50ml lb培养基的发酵瓶中，振荡培养48h；发酵液充分摇匀后8000r/min离心5min取上清液即为粗酶液，以异丙醇为溶剂，分别称取对硝基苯葵酸、月桂酸、豆蔻酸、硬脂酸、棕榈酸酯底物45mg于15ml异丙醇，配制反应底物溶液(底物现配现用)，反应体系：首先加入915μl 50 mmol/l tris-hcl(ph 8.0)缓冲液，75μl反应底物溶液，混匀，然后加入10 μl粗酶液，37℃水浴锅反应10min，快速加入250μl 10％三氯乙酸终止反应，再加入250μl 10％na2co3溶液显色，410nm测定光吸收值；每组3次重复，空白对照为沸水处理20min的灭活酶液，1个酶活单位(u)定义为该实验条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需要的酶量：
42.酶活计算公式:a＝([a
1-a0]
×
k c0)
×v1
×
n/(v2×
t)
[0043]
式中：a
‑‑
样品酶活(u/ml)；a1‑‑
样品酶液的吸光度od值；a0‑‑
对应酶液的空白吸光度od值；k
‑‑
对硝基苯酚标准曲线的斜率；c0‑‑
对硝基苯酚标准曲线的截距；n
‑‑
稀释倍数；v1‑‑
反应液的体积/ml；v2‑‑
酶液的体积/ml；t
‑‑ꢀ
反应时间/min；
[0044]
根据测定结果，菌株wco-9脂肪酶对于c
10
长链底物的水解活性达到 1576u/l，对c
12
和c
14
链长底物的水解活性分到为1425u/l和1469u/l，对 c
16
和c
18
两种长链脂肪酸底物的水解活性也分别有540u/l和249u/l，都要显著高于他人保存的琼氏不动杆菌aj11037(如图7)。
[0045]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。