提高纤维素酶活的基因及在中药饲料添加剂中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物和动物中药饲料技术领域，更具体地说是涉及提高纤维素酶活的基因及在中药饲料添加剂中的应用。


背景技术：

2.长期以来，化学药品、抗生素和激素的毒副作用和耐药性一直都是困扰医学专家的重要因素，尤其是容易引起动物产品药物残留，这已成为一个全社会关注的问题。中药的毒副作用小，无耐药性，不会在肉、蛋、奶等畜产品中产生有害残留，是中药添加剂的一个独特优势，这一优势，顺应了时代潮流，满足了人们回归自然、追求绿色食品的愿望。
3.中药具有营养和药物的双重作用，其内含有多种成分，包括多糖、生物碱、苷类等。中药在动物肠道内，要发挥药效，活性成分必须从组织中释放出来。但是中药活性成分往往被纤维素等包裹，因此，降解纤维素成为中药有效成分释放的关键。现有的纤维素酶虽然能够降解纤维素，但是活性较低。
4.纤维素酶的生产需要有安全无毒的高效表达纤维素酶的菌株。黑曲霉菌株是饲料添加剂目录里面的菌株，其具有营养简单，生长繁殖快，安全无毒等优点。
5.因此，如何提供一种可以提高纤维素酶活的基因，以该基因构建菌株，并将菌株应用于中草药饲料添加剂中是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种基因，该基因编码的蛋白可以对与纤维素酶运输关联的蛋白进行修饰，调节纤维素运输关联蛋白的表达强度，提高酶活。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种提高纤维素酶活的基因，所述基因为trans1基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.一种提高纤维素酶活的蛋白，所述蛋白由trans1基因编码而得，氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.一种高产纤维素酶活的菌株，所述菌株为黑曲霉trans；黑曲霉trans由pcambia1300-trans1重组质粒转化至黑曲霉cbs s13.88而得。
11.一种高产纤维素酶活的菌株的构建方法，包括下述步骤：
12.1)酶切：对pcambia1300质粒和trans1基因进行sal i和hind iii酶切，多酶切产物电泳、胶回收；
13.2)连接：对胶回收产物进行连接，得重组质粒pcambia1300-trans1；
14.3)转化、提取：将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，并提取重组质粒；
15.4)转化、介导：将提取的重组质粒转化农杆菌中，并以农杆菌介导侵染黑曲霉菌，获得黑曲霉trans菌株。
16.所述的trans1基因在中草药饲料添加剂中的应用。
17.所述的蛋白在中草药饲料添加剂中的应用。
18.所述的菌株在中草药饲料添加剂中的应用。
具体实施方式
19.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1
21.菌株和试剂
22.黑曲霉cbs 513.88，质粒pcambia1300(biovector)，农杆菌eha105，大肠杆菌dh5α，限制性内切酶(takara)等。
23.合成基因片段1：gtcgac(saii酶切位点序列)-膜泡介导转运蛋白(编码序列sqtrans1；蛋白序列sqtrans1-amino)-aagcttgg(hindiii酶切位点序列)。质粒提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司
24.方法和步骤
25.天根质粒dna小提试剂盒天根生化科技(北京)有限公司
26.(1)质粒(pcambia1300,购买biovector)提取
27.1)柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12000rpm(13400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
28.2)带有pcambia1300质粒的大肠杆菌dh5α,在lb培养基(酵母提取物5g,胰化蛋白胨10g,氯化钠10g,naoh调ph至7.0)中37℃培养18h，取2ml培养的菌液，加入离心管中，使用台式离心机，12000rpm(13400
×
g)离心1min，吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
29.3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液p1(请先检查是否已加入rnasea)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
30.4)向离心管中加入250μl溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
31.5)向离心管中加入350μl溶液p3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm(13400
×
g)离心10min。
32.6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm(13400
×
g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
33.7)可选步骤：向吸附柱cp3中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm(13400
×
g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3重新放回收集管中。
34.8)向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400
×
g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
35.9)重复操作步骤8)。
36.10)将吸附柱cp3放入收集管中，12000rpm(13400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
37.11)将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12000rpm(13400
×
g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
38.质粒pcambia1300、合成基因片段1的酶切和电泳
39.往41μl pcambia1300质粒溶液或合成的基因片段溶液，溶液中加入2μl saii、2μl hindiii和5μl酶切缓冲液，总体积为50.0μl，在30℃酶切2h。使用琼脂糖凝胶电泳试剂盒(上海一基实业有限公司)进行电泳。
40.1)打开试剂盒，依照说明书清点各种试剂，并按实验需要量将50
×
电泳缓冲液稀释为1
×
电泳缓冲液待用；将核酸荧光染料与6
×
loading buffer按1:1比例混合备用。
41.2)把u型凝胶托盘放入制胶槽中，插好梳子，置于一水平面上。
42.3)将0.25g琼脂糖加到盛有适当体积1
×
电泳缓冲液的三角瓶或玻璃瓶中。
43.4)将瓶口用封口膜轻轻盖住，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖完全熔化(熔化到没有小颗粒物为止)。
44.5)将温热的凝胶溶液倒入u型凝胶托盘中(超过二分之一处)。
45.6)将凝胶室温放置15-30min完全冷却至凝固，小心拔除梳子，将凝胶托盘移入电泳槽，梳井(点样孔)一端朝负极方向，加入1
×
电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没。
46.7)将样品与6
×
loading buffer和核酸荧光染料充分混合(20μl样品 1μl6
×
loading buffer 1μl核酸荧光染料)，用微量移液器将以上混合物缓慢加入梳井内，注意避免引入气泡。
47.8)盖上电泳槽盖，样品应向阳极(红色插头)泳动，提供5-10v/cm的电压。
48.9)当样品与染料在凝胶中迁移到足够距离时，关上电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖，在dna电泳图谱观察仪中观察核酸条带。
49.胶回收
50.使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒回收质粒pcambia1300、dna片段的酶切、电泳产物。
51.1)从琼脂糖凝胶中割下含目的条带的胶块，称重。
52.2)加入胶块重量3-6倍的bufferb2，50℃水浴5-10分钟溶胶。
53.3)选做，对于《500bp的片段，加入1/3bufferb2体积的异丙醇。
54.4)将溶胶液移入吸附柱中，8000
×
g离心30秒。倒掉收集管中液体。
55.5)加入500μl wash solution，9000
×
g离心30秒，倒掉收集管中液体。
56.6)重复步骤5)一次。
57.7)空吸附柱于9000
×
g离心1分钟。
58.8)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μlelution buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中dna溶液。
59.质粒pcambia1300和合成基因片段1的连接
60.使用dna ligation kit ver.2.1(takara)进行连接。
61.1)将酶切的质粒pcambia1300与酶切的dna片段混合制备成体积为10μl的dna溶液，质粒和dna片段的体积比为1:3。
62.2)向上述dna溶液中加入等体积的solution i，充分混匀。
63.3)16℃反应14h。
64.转化大肠杆菌和筛选
65.1)从-80℃冰箱中取100μl e.coli dh5α感受态细胞悬液，冰上溶解10分钟。
66.2)取10μl上述连接产物加入感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
67.3)42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。
68.4)加入890μl lb液体培养基(不含kan)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(kanr)。
69.5)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含kan的lb筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
70.大肠杆菌转化子长出后挑取部分转化子接种于lb液体培养基，37℃、200rpm培养12-16小时后，提质粒验证，验证正确的同源重组质粒命名为pcambia1300-b(pcambia1300与合成基因片段1连接)。
71.农杆菌介导转化黑曲霉和筛选同源重组菌株
72.(1)农杆菌感受态细胞的制备
73.1)在新活化的农杆菌eha105的lb平板(lb液体培养基添加5％琼脂)上，挑取单克隆于lb液体培养基。
74.2)28℃、220r/min振荡培养至od600达到0.6-0.7。
75.3)取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min。
76.4)去除上清，用1ml 10％无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基。
77.5)洗好的菌体用100μl 20％无菌甘油重悬，-70℃保存备用。
78.(2)质粒pcambia1300-b转化农杆菌
79.1)将100μl农杆菌eha105感受态细胞置于冰上，加入10μlpcambia1300-b，充分混匀，冰上放置30min。
80.2)置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化。
81.3)加1ml无抗生素的ym液体培养基(酵母膏0.3％，胰蛋白胨0.5％，麦芽糖0.5％，自然ph)于28℃、240r/min培养2-3h。
82.4)4000r/min离心1.5min收集菌体，将上清吸去500μl，剩余液体重悬培养菌后直接涂布含卡那霉素30μg/ml的ym平板，28℃、230r/min培养36h。
83.5)挑取单菌落接种到含卡那霉素的ym液体培养基中，28℃、250r/min培养48h，将菌液用于保存-20℃，得到含有质粒pcambia1300-1的农杆菌。
84.(3)黑曲霉霉菌丝的制备
85.1)从-80℃冰箱取出甘油管保藏的黑曲霉，置于室温下，快速解冻。
86.2)吸取适量菌液加到淀粉培养基平板上，用涂布棒将菌液涂布均匀(或者用无菌接种环蘸取适量菌液作平板划线分离)，34℃恒温培养5天。
87.3)待平板上长出单菌落后，用无菌牙签挑取单菌落移至装有察氏培养基(加入15％的琼脂)的斜面试管中，34℃培养6天。长出的孢子用灭菌的自来水冲洗。适当稀释后，孢子的浓度为1x106个/ml.取0.1ml孢子液涂布与察氏培养基平板，挑取最先出现的菌落，接种到察氏培养基(加入15％的琼脂)的斜面试管中，34℃培养6天。再次重复一次操作循环：长出的孢子用灭菌的自来水冲洗。适当稀释后，孢子的浓度为1x106个/ml.取0.1ml孢子
液涂布与察氏培养基平板，挑取最先出现的菌落，接种到察氏培养基(加入15％的琼脂)的斜面试管中，34℃培养6天(为一个操作循环的流程，此次操作计为第一个操作循环流程)。
88.如此，进行5个操作循环流程的操作，在第五个操作循环流程，得到一个生长最快，产孢子数目最多的菌落，此为选育的菌落。
89.4)将选育的菌落接种到察氏培养基(加入15％的琼脂)的三角瓶中(50ml三角瓶装入察氏培养基25ml)，120rpm,34℃培养5天，将三角瓶中菌液全部转移至50ml离心管，8000rpm离心5min，弃去上清。
90.5)加入20ml生理盐水，反复吹打混匀，8000rpm离心洗涤5min，弃上清，再加入5ml生理盐水，留待转化用。
91.(4)含有质粒pcambia1300-b的农杆菌转化里氏木霉。
92.1)试剂的配制
93.无机盐液：将2.61g kcl、7.48g kh2po4和29.8g nano3溶于80ml水中，再加水定容至100ml，用5m koh调ph至5.5，高压灭菌，4℃保存。
94.50％葡萄糖(w/v)：50g葡萄糖溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，高压灭菌。
95.1m mgso4：24.7g mgso4溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，高压灭菌。
96.mm微量元素溶液：将1.1g h3bo3、2.1g znso4·
7h2o、0.16g cuso4·
5h2o、0.5g mnc12·
4h2o、0.5g feso4·
7h2o、0.17g coc12·
6h2o、0.15gn
a2
moo4·
2h2o和0.1g edta溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存。
97.mm选择培养平板：取20ml无机盐溶液、20ml 50％葡萄糖溶液、2ml 1mmgso4溶液、1ml mm微量元素溶液加入到957ml经高压灭菌含有20g琼脂粉的蒸馏水中使总体积至1l，充分混匀(即琼脂浓度2％)。当温度降至60℃，加入1ml 100mg/ml潮霉素b(终浓度100μg/ml)和1ml 0.2m头孢噻肟(终浓度0.2mm)，加入1ml 200mm乙酰丁香酮(终浓度0.2mm)，混合均匀后制成mm选择培养平板。
98.pda培养基：
①
称量和熬煮：按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。
②
加热溶解：把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15-20g(提前粉碎到40目)，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所1000ml。
99.2)农杆菌转化黑曲霉
100.在含有200μm乙酰丁香酮的im培养基平板上贴一层玻璃纸滤膜(尽量不要产生气泡)，将100μl黑曲霉菌丝悬液与100μl转化有质粒pcambia1300-b的农杆菌培养液等体积混合均匀后涂布于滤膜上，22.5℃避光培养3天。
101.3)筛选
102.将滤膜转移至含有200μm头孢噻肟(目的杀死农杆菌细胞)和100μg/ml潮霉素的mm选择培养基平板，30℃培养5天，待菌落长出后，挑取菌落进行鉴定，筛选得到同源重组成功的菌株命名为黑曲霉菌株trans。
103.三、纤维素酶酶活提高的黑曲霉菌株的构建
104.(3)黑曲霉菌株发酵
105.黑曲霉菌株trans选育：挑取黑曲霉菌株trans孢子用无菌水稀释到孢子浓度为1
×
107/ml，涂布pda平板，30℃培养72h得到单菌落，单菌落接种到pda斜面，30℃培养108h左右，得到黑曲霉菌株trans孢子。同时以出发菌株黑曲霉cbs 513.88作为对照。
106.接种发酵：孢子接种于装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，孢子最终浓度为1
×
108孢子/ml发酵培养基，30℃、130r/m培养96h。其中，发酵培养基组成：mm微量元素液6ml，麸皮20g，甘蔗渣(粉碎过20目筛)12g，葡萄糖5g，蛋白胨2g，自来水定容至1l。
107.发酵结束后，用滤纸过滤发酵液，测定滤液的纤维素酶酶活，测定方法依据文献(冯月，蒋建新，朱莉伟，菅红磊。纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究。北京林业大学学报，2009，第31卷，增刊1)。测定的黑曲霉菌株trans或出发菌株黑曲霉cbs 513.88发酵液的滤纸酶活。
108.黑曲霉菌株trans纤维素酶活为2.08u/ml；出发黑曲霉cbs 513.88发酵液的滤纸酶活为1.8u/ml。
109.实施例2(对比例)
110.合成的基因序列为sqtrans2，如seq id no.3所示；对应的氨基酸序列为sqtrans2-anino，如seq id no.4所示，菌株构建方式同实例1，得到的转化菌株为黑曲霉trans-2，黑曲霉菌株trans-2纤维素酶活为1.96u/ml
111.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
112.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。