3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaA2B2及其应用的制作方法

3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2及其应用
技术领域
1.本发明属于应用环境微生物领域，涉及一种3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2及其应用。


背景技术：

2.3-溴-4-羟基苯甲酸作为一种重要的化工中间体，广泛应用于工业、农业化学品的合成。此外，3-溴-4-羟基苯甲酸也是很多卤代芳烃(如溴苯腈、辛酰溴苯腈、多溴联苯醚等)降解的中间产物。由于卤素原子的强电子吸附效应，3-溴-4-羟基苯甲酸易对生命细胞产生毒性，对人类健康和生态环境安全具有较大的威胁。此外，3-溴-4-羟基苯甲酸易溶于水，扩散系数高，并易对河流、地下水等造成污染。因此，3-溴-4-羟基苯甲酸的环境污染以及污染环境的修复问题引起了广泛关注。相比于传统的物理和化学修复手段如淋洗、焚烧等，利用微生物修复有机物污染的方法是一种绿色、高效、廉价和无二次污染的方法。代谢途径的多样性使得微生物成为环境中有机污染物降解的主力军。微生物合成的酶在有机污染物的降解、修复过程中起着决定性的作用。提取的降解酶来消除有机污染物残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。从微生物中克隆3-溴-4-羟基苯甲酸的降解基因簇，通过基因工程手段构建高效降解能力的工程菌，也可以构建降解酶的高效表达菌株用于酶制剂的生产。3-溴-4-羟基苯甲酸降解基因簇的获得在3-溴-4-羟基苯甲酸污染的修复领域有着巨大的应用潜力。同时可通过基因改造扩大降解酶的作用底物范围，可广泛应用于环境中卤代对羟基苯甲酸的降解和脱毒，保护环境。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种新的参与3-溴-4-羟基苯甲酸降解的氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2。
4.本发明的另一目的是提供单加氧酶基因phbh2编码的单加氧酶phbh2和双加氧酶基因pcaa2b2编码的双加氧酶pcaa2b2。
5.本发明的又一目的是提供该氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2的应用。
6.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
7.3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2，其核苷酸序列为seq id no.1，基因簇全场长2376bp，主要由单加氧酶基因phbh2、双加氧酶α亚基基因pcaa2和双加氧酶β亚基基因pcab2构成。
8.一种3-溴-4-羟基苯甲酸单加氧酶基因phbh2，其核苷酸序列为seq id no.2。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1176bp，g c含量为69.47％，编码391个氨基酸，分子量为43.2kda。
9.本发明所述的3-溴-4-羟基苯甲酸单加氧酶基因phbh2编码的单加氧酶phbh2，氨基酸序列为seq id no.3。
10.一种双加氧酶基因pcaa2b2，其α亚基基因pcaa2的核苷酸序列为seq id no.4。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为363bp，g c含量为63.37％，编码120个氨基酸，分子量为13.5kda；β亚基基因pcab2的核苷酸序列为seq id no.6。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为840bp，g c含量为65.95％，编码279个氨基酸，分子量为31.6kda。
11.本发明所述的双加氧酶α亚基基因pcaa2编码的双加氧酶α亚基pcaa2，氨基酸序列为seq id no.5；双加氧酶β亚基基因pcab2编码的双加氧酶β亚基pcab2，氨基酸序列为seq id no.7。
12.含有本发明所述的3-溴-4-羟基苯甲酸单加氧酶基因phbh2的重组质粒。
13.作为本发明的一种优选方式，单加氧酶基因片段与酶切好的pbbr1mcs-2进行酶连获得含单加氧酶基因的重组质粒pbbr-phbh2。
14.作为本发明的一种优选方式，单加氧酶基因片段与酶切好的pet-29a( )进行酶连获得含单加氧酶基因的重组质粒pet-phbh2。
15.含本发明所述的重组质粒的重组微生物。
16.作为本发明的一种优选方式，酶连好的含单加氧酶基因的重组质粒pbbr-phbh2转化到表达宿主菌e.coli dh5α获得重组微生物e.coli dh5α(pbbr-phbh2)。
17.作为本发明的一种优选方式，酶连好的含单加氧酶基因的重组质粒pet-phbh2转化到表达宿主菌e.coli bl21(de3)获得重组微生物e.coli bl21(pet-phbh2)。
18.含有本发明所述的加氧酶基因簇phbh2pcaa2b2的重组质粒。
19.作为本发明的一种优选方式，加氧酶基因簇片段与酶切好的pbbr1mcs-2进行酶连获得重组质粒pbbr-phbh2pcaa2b2。
20.含本发明所述的重组质粒的重组微生物。
21.作为本发明的一种优选方式，酶连好的含双加氧酶基因的重组质粒pbbr-phbh2pcaa2b2转化到表达宿主菌e.coli dh5α获得重组微生物e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)。
22.本发明所述的氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2、含有该基因簇的重组质粒及重组微生物可以在土壤和/或水体的3-溴-4-羟基苯甲酸残留去除方面的应用。
23.本发明所涉及的单加氧酶phbh2基因、其编码的单加氧酶phbh2、含有该单加氧酶基因的重组质粒、重组微生物在土壤和/或水体的3-溴-4-羟基苯甲酸残留去除方面的应用。
24.有益效果
25.1.本发明从卤代羟基苯甲酸降解菌株pigmentiphaga sp.h8(专利菌种保藏编号为cctcc no：m 2017222)中克隆出3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2。
26.2.将该基因簇中的单加氧酶基因phbh2隆至表达载体pbbr1mcs-2中获得重组表达质粒pbbr-phbh2，通过转化的方法将重组表达质粒pbbr-phbh2转移至表达菌株e.coli dh5α(购自invitrogen公司)，获得重组表达菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)。
27.3.本发明对含有单加氧酶基因phbh2的重组表达菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)进行全细胞转化试验，发现该重组表达菌株可快速将3-溴-4-羟基苯甲酸转化为3-溴-4,5-二羟基苯甲酸。
28.4.将该基因簇中的单加氧酶基因phbh2隆至高效表达载体pet29a( )(购自
novegen公司)获得重组表达质粒pet-phbh2，通过转化的方法将重组表达质粒pet-phbh2转移至高效表达菌株e.coli bl21(de3)(购自invitrogen公司)，获得重组表达菌株e.coli bl21(pet-phbh2)。
29.5.重组表达菌株e.coli bl21(pet-phbh2)经过0.5mm的iptg诱导18h后，大量表达携带his
6-tag的单加氧酶phbh2，进一步通过co-talon亲和层析柱(购自ge公司)进行洗脱纯化获得纯的单加氧酶phbh2。
30.6.本发明对单加氧酶基因phbh2表达的产物phbh2进行酶学降解试验，发现phbh2以nadph和fad为辅因子，可快速将3-溴-4-羟基苯甲酸氧化为3-溴-4,5-二羟基苯甲酸。
31.7.将该基因簇phbh2pcaa2b2克隆至表达载体pbbr1mcs-2中获得重组表达质粒pbbr-phbh2pcaa2b2，通过转化的方法将重组表达质粒pbbr-phbh2pcaa2b2转移至表达菌株e.coli dh5α(购自invitrogen公司)，获得重组表达菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)。
32.8.本发明对含有氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2的重组表达菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)进行全细胞转化试验，发现该重组表达菌株可快速将3-溴-4-羟基苯甲酸转化为终产物2-溴-4-羧基-已二烯二酸。
33.9.利用氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2构建的工程菌株发酵制成降解菌剂，可以高效去除土壤和水体中残留的3-溴-4-羟基苯甲酸。
34.10.利用单加氧酶基因phbh2构建的工程菌株能高效表达phbh2，生产的酶制剂可用于去除土壤和水体中残留的3-溴-4-羟基苯甲酸。
附图说明
35.图1为本发明重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)对3-溴-4-羟基苯甲酸的降解曲线。
36.图2为本发明重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)降解3-溴-4-羟基苯甲酸的代谢产物的质谱检测图。
37.图3为本发明重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)对3-溴-4-羟基苯甲酸的降解曲线。
38.图4为本发明重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)降解3-溴-4-羟基苯甲酸的终产物的质谱检测图。
39.图5为本发明氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2编码的单加氧酶和双加氧酶对3-溴-4-羟基苯甲酸的代谢机制。
40.图6为本发明单加氧酶phbh2表达和纯化的sds-page电泳图。
41.图7为本发明单加氧酶phbh2的最适反应温度及最适反应ph的研究结果图。
42.生物材料保藏信息
43.h8，分类命名为pigmentiphaga sp.h8，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：m 2017222，保藏日期为2017年04月28日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
具体实施方式：
44.实施例1 3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2的克隆
45.1.1菌株h8的基因组总dna的提取
46.菌株h8大量培养后，采用ctab法提取高纯度、大片段的基因组总dna，溶于te(ph 8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考f
·
奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。
47.1.2基因组测序与目的基因获取
48.将检测合格的pigmentiphaga sp.h8基因组dna送至上海凌恩生物科技有限公司，利用illumina hiseq 2500平台结合pacbio rs单分子测序平台进行细菌全基因组完成图测序。基因组测序结果表明，所述菌株h8基因组草图大小为5.99mb，预测共5600个开放阅读框(orf)。利用比较基因组学和比较蛋白质组学的方法，从基因组中获得降解3-溴-4-羟基苯甲酸的氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
49.1.3单加氧酶基因phbh2功能验证
50.1.3.1单加氧酶基因phbh2的pcr扩增
51.引物序列：
52.phbh2-f1：ctgggtacctgatcacgctggaggagc(kpni)(seq id no.8)；
53.phbh2-r1：tccagatctctaggcctcgatcggcaacc(bglii)(seq id no.9)。
54.使用引物phbh2-f1和phbh2-r1扩增单加氧酶基因phbh2，pcr扩增体系如下：
[0055][0056]
pcr扩增程序：
[0057]
a.98℃变性2min
[0058]
b.98℃变性15s，60℃退火15s，68℃延伸80s，进行30个循环
[0059]
c.68℃延伸5min，
[0060]
d.10℃5min。
[0061]
1.3.2酶切、酶连与转化
[0062]
将pcr扩增获得的phbh2基因使用kpni和bglii进行分步酶切，载体pbbr1mcs-2使用kpni和bamhi进行分步酶切，酶切产物用dna纯化试剂盒进行回收。
[0063]
按照如下反应体系，将经过kpni/bglii双酶切后的phbh2基因片段酶连至pbbr1mcs-2载体，构建成重组质粒pbbr-phbh2。
[0064][0065]
16℃温育12小时。
[0066]
将构建好的pbbr-phbh2转化至100μl表达宿主菌株e.coli dh5α的感受态细胞，具体方法参照f.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》p23。涂布至含有50mg/l卡那霉素的lb平板，培养18h后挑取阳性克隆子，获得重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)。
[0067]
1.3.3重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)对3-溴-4-羟基苯甲酸的降解
[0068]
将重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)以及对照菌株e.coli dh5α(pbbr1mcs-2)分别在含有50mg/l卡那霉素的lb培养液中培养12h。6000rpm离心收集菌体，并用无菌的基础盐溶液离心、洗涤菌体2次后，再用基础盐溶液重悬菌体。按照od
600
为1的初始接种量向含有0.2mm 3-溴-4-羟基苯甲酸的基础盐溶液中接入重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)和对照菌株e.coli dh5α(pbbr1mcs-2)，于30℃摇床中开展全细胞转化实验。发现该重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2)可在4h内将0.2mm的3-溴-4-羟基苯甲酸几乎完全降解，而不携带phbh2基因的对照菌株e.coli dh5α(pbbr1mcs-2)不能降解3-溴-4-羟基苯甲酸(图1)，表明单加氧酶基因phbh2编码的蛋白是催化3-溴-4-羟基苯甲酸起始降解的关键酶。降解产物经uplc-ms鉴定为3-溴-4,5-二羟基苯甲酸(图2)。
[0069]
1.4双加氧酶基因pcaa2b2功能验证
[0070]
1.4.1基因簇phbh2pcaa2b2的pcr扩增
[0071]
引物序列：
[0072]
pca-phbh2-f：ctaggtaccgttttccctctacccaagga(kpni)(seq id no.10)；
[0073]
pca-phbh2-r：cataagcttctaggcctcgatcggcaacc(hindiii)(seq id no.11)。
[0074]
使用引物pca-phbh2-f和pca-phbh2-r扩增基因簇phbh2pcaa2b2片段，pcr扩增体系如下：
[0075][0076]
pcr扩增程序：
[0077]
a.98℃变性2min
[0078]
b.98℃变性15s，60℃退火15s，68℃延伸140s，进行30个循环
[0079]
c.68℃延伸8min，
[0080]
d.10℃5min。
[0081]
1.4.2酶切、酶连与转化
[0082]
将pcr扩增获得的phbh2pcaa2b2基因簇片段以及载体pbbr1mcs-2分别使用kpni和hindiii进行分步酶切，酶切产物用dna纯化试剂盒进行回收。
[0083]
按照如下反应体系，将经过kpni/hindiii双酶切后的phbh2pcaa2b2片段酶连至同样经过kpni/hindiii双酶切的pbbr1mcs-2载体，构建成重组质粒pbbr-phbh2pcaa2b2。
[0084][0085]
16℃温育12小时。
[0086]
将构建好的pbbr-phbh2pcaa2b2转化至100μl表达宿主菌株e.coli dh5α的感受态细胞，具体方法参照f.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》p23。涂布至含有50mg/l卡那霉素的lb平板，培养18h后挑取阳性克隆子，获得重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)。
[0087]
1.4.3重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)对3-溴-4-羟基苯甲酸的降解
[0088]
将重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)以及对照菌株e.coli dh5α(pbbr1mcs-2)分别在含有50mg/l卡那霉素的lb培养液中培养12h。6000rpm离心收集菌体，并用无菌的基础盐溶液离心、洗涤菌体2次后，再用基础盐溶液重悬菌体。按照od
600
为1的初始接种量向含有0.2mm 3-溴-4-羟基苯甲酸的基础盐溶液中接入重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)和对照菌株e.coli dh5α(pbbr1mcs-2)，于30℃摇床中开展全细胞转化实验。发现该重组菌株e.coli dh5α(pbbr-phbh2pcaa2b2)可在4h内将0.2mm的3-溴-4-羟基苯甲酸完全降解(图3)。降解终产物经uplc-ms鉴定为2-溴-4-羧基-已二烯二酸(图4)。由此推断出氧化酶基因簇phbh2pcaa2b2的功能，即：单加氧酶基因编码的蛋白phbh2催化3-溴-4-羟基苯甲酸起始降解反应，将其转化为3-溴-4,5-二羟基苯甲酸；随后双加氧酶基因pcaa2b2编码的蛋白pcaa2b2进一步将3-溴-4,5-二羟基苯甲酸降解为2-溴-4-羧基-已二烯二酸(图5)。
[0089]
实施例2 3-溴-4-羟基苯甲酸单加氧酶基因phbh2的高效表达与酶纯化2.1单加氧酶基因phbh2的pcr扩增
[0090]
引物序列：
[0091]
phbh2-f2：caacatatgagcgagcgtacccaggt(ndei)(seq id no.12)；phbh2-r2：
[0092]
aataagcttctagtggtggtggtggtggtgggcctcgatcggcaacccgg(hindiii)(seq id no.13)。
[0093]
使用引物phbh2-f2和phbh2-r2扩增单加氧酶基因phbh2(3’端携带编码his标签的核苷酸序列gtggtggtggtggtggtg)，pcr扩增体系如下：
[0094][0095]
pcr扩增程序：
[0096]
a.98℃变性2min
[0097]
b.98℃变性15s，60℃退火15s，68℃延伸80s，进行30个循环
[0098]
c.68℃延伸5min，
[0099]
d.10℃5min。
[0100]
2.2酶切与酶连
[0101]
将pcr扩增获得的phbh2基因以及载体pet29a( )分别用ndei和hindiii进行分步酶切，酶切产物用dna纯化试剂盒进行回收。
[0102]
按照如下反应体系，将经过ndei/hindiii双酶切后的phbh2基因片段酶连至同样酶切好的pet29a( )载体，构建成重组质粒pet-phbh2。
[0103][0104]
16℃温育12小时。
[0105]
2.3转化
[0106]
将构建好的pet-phbh2转化至100μl表达宿主菌株e.coli bl21(de3)的感受态细胞，具体方法参照f.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》p23。涂布至含有50mg/l卡那霉素的lb平板，培养18h后挑取阳性克隆子。
[0107]
2.4phbh2的表达与纯化
[0108]
将重组表达菌株e.coli bl21(pet-phbh2)接至100ml lb培养基中，37℃培养至od
600 0.6左右，添加0.5mm的iptg于16℃诱导培养18h后，离心收集菌体。用磷酸盐(以下简称pbs)缓冲液离心洗涤菌体两次，超声波破碎，15000g离心20min取上清。将上清液进一步通过co-talon亲和层析柱(购自ge公司)进行洗脱纯化获得纯的携带his标签的phbh2，并用sds-page电泳检测其纯度(图6)。
[0109]
2.5单加氧酶phbh2的酶学特性
[0110]
phbh2转化3-溴-4-羟基苯甲酸采用如下标准酶促反应体系：1ml 20mm的tris-hcl缓冲液(ph 8.0)中含有0.2mm的3-溴-4-羟基苯甲酸，0.3mm nadph，0.02mm fad，0.05μm phbh2。35℃条件下反应10min。沸水浴加热3min后，15000g离心20min取上清。取400μl上清
液，加入600μl甲醇后混匀，再使用有机相滤器过滤后上高效液相色谱定量检测3-溴-4-羟基苯甲酸的残留浓度，计算降解率。
[0111]
为了考察辅因子对phbh2酶活的影响，以不添加辅因子的标准酶促反应体系为空白对照，分别添加nadh、fmn、nadph和fad的不同组合(所使用的nadh和nadph浓度均为0.3mm浓度，fad和fmn浓度均为0.02mm)，测定不同辅因子条件下phbh2的相对酶活。结果表明，当nadph和fad同时存在时，phbh2酶活最高(设为100％)；当nadph和fmn同时存在时，phbh2相对酶活为12.4％；只添加nadph或nadh时，phbh2相对酶活分别只有11.6％和1.6％；只添加fad或fmn时，phbh2没有酶活。这些结果表明，nadph和fad是phbh2的最佳辅因子，phbh2催化3-溴-4-羟基苯甲酸反应时需要以nadph为电子供体和h供体。
[0112]
使用上述标准酶促反应体系，将phbh2催化3-溴-4-羟基苯甲酸的反应设置在不同的温度下(10-50℃)进行，考察phbh2的最适反应温度。酶促反应结束后沸水中放置3min来终止反应，12000rpm，离心10min，上清液经0.22μm的水相滤膜过滤后进行hplc检测，测定不同温度下phbh2对3-溴-4-羟基苯甲酸的降解率，以最适温度下的降解效率为100％，计算相对酶活。实验结果表明，在10-45℃范围内phbh2对3-溴-4-羟基苯甲酸都有一定的活性,；当温度在20～40℃时，相对酶活在60％以上，且最适反应温度为35℃；当温度在10℃时，相对酶活仍然能达到40％左右；当温度达到50℃时，phbh2失去酶活(图7a)。
[0113]
将上述标准酶促反应体系中的缓冲液更换为以下四种不同ph值范围的缓冲液：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph 4.0-6.0)、磷酸盐缓冲液(ph 5.0-8.0)、tris-hcl缓冲液(ph 7.0-8.5)和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ph 8.5-10.0)，每0.5ph一个梯度。35℃条件下，将phbh2在上述不同ph值的缓冲液中对3-溴-4-羟基苯甲酸进行酶促反应，然后沸水中放置3min来终止反应。12000rpm离心10min，上清液经0.22μm的水相滤膜过滤后进行hplc检测，测定不同ph条件下phbh2对3-溴-4-羟基苯甲酸的降解率，以最适ph的降解率设为100％，计算相对酶活力。实验结果表明，phbh2的最适反应ph是8.0；当ph在7.5-8.5，phbh2的相对活力保持在60％以上；当ph》10或《6时，几乎检测不到phbh2的酶活(图7b)。