微凝胶类肝载体及其制备方法与流程

1.本技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种微凝胶类肝载体及其制备方法。


背景技术：

2.与二维细胞的表面不同，三维培养需要细胞适应它们的形态和表型等，是一种具备良好增殖条件以及功能活性诱导的培养系统。现有的二维细胞培养模型在体外研究细胞生长时往往不是很理想，因为它们不能形成更自然的组织样结构，这对细胞性能有重大影响。例如，二维培养细胞被认为更容易受到药物作用的影响。此外，在二维平面上进行细胞培养，由于细胞间相互作用有限，导致细胞分化受到抑制。因此一个更合适的细胞培养环境可以提高药物敏感性的预测，并有助于理解组织形态发生。
3.近年来，不同的生物材料，如纳米纤维支架，多孔海绵支架、水凝胶和微胶囊是用于三维细胞培养的研究热点。在现有的胶原蛋白中，尤其是i型胶原蛋白的使用频率较高，它们具有在体内模拟富含胶原的组织，简单易行的显著优点。组装三维水凝胶的能力通过不同浓度的胶原蛋白溶液聚合，即可生成刚度不同的3d凝胶载体，可供不同细胞迁移所需的载体孔径，然而，胶原基质成分单一，缺乏存在细胞外基质其他重要成分。此外，人们普遍认为，三维培养为细胞以不受限制的方式快速增殖提供了平台，但是，三维培养细胞不受限制地快速增殖，在长时间培养后容易出现中心的细胞坏死的情况。


技术实现要素：

4.本技术的主要目的旨在提供一种为肝脏细胞提供快速增殖平台的微凝胶类肝载体，适于肝脏细胞的体外长期培养。
5.本技术的另一目的旨在提供一种上述微凝胶类肝载体的制备方法。
6.为了实现上述目的，本技术提供以下技术方案：作为第一方面，本技术涉及一种微凝胶类肝载体，包括由i型胶原蛋白、基质胶交联而成的生物凝胶，所述生物凝胶上携带有肝脏细胞及生长因子，所述肝脏细胞包括肝干细胞、肝脏非实质细胞和肝肿瘤细胞中的一种或两种的组合。
7.进一步设置：所述肝脏细胞的组合中肝脏非实质细胞的质量比例为5-10%，所述肝干细胞或肝肿瘤细胞的质量比例为90-95%。
8.进一步设置：所述i型胶原蛋白为鼠尾i型胶原蛋白，且所述鼠尾i型胶原蛋白、基质胶和生长因子三者的混合质量比例为1：1：1。
9.进一步设置：所述生长因子包括肝细胞生长因子或表皮细胞生长因子，且所述生长因子的终浓度为10-30
µ
g/ml。
10.作为第二方面，本技术涉及一种如上所述的微凝胶类肝载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将预冷的i型胶原蛋白、基质胶及生长因子按照质量比例为1:1:1进行混合后，加入细胞数量大于预设数量的所述肝脏细胞并混匀；
将上述混匀后的材料添加到细胞孔板，升温至预设温度后使i型胶原蛋白及基质胶凝胶化；将上述凝胶化的材料进行低速离心以形成凝胶类肝载体；将所述凝胶类肝载体自由漂浮在培养基中孵育，直到所述凝胶类肝载体的大小基本恒定。
11.进一步设置：将所述凝胶类肝载体置于细胞培养基中孵育至其大小恒定状态，且每间隔1-2天更新细胞培养基。
12.进一步设置：更新细胞培养基时，舍弃原细胞培养基上清液，使用磷酸缓冲溶液洗涤下层物质，随后添加新鲜细胞培养液。
13.进一步设置：所述i型胶原蛋白、基质胶及生长因子混合前的预冷温度为0
ꢀ‑
10
°
c。
14.进一步设置：将所述肝脏细胞先置于体积百分数为5%co2，37℃的培养箱中进行培育，每24小时更换培养箱内的培养基。
15.进一步设置：将凝胶化的材料置于离心机的最小离心半径处并以300rpm的离心速度进行离心10min。
16.相比现有技术，本技术的方案具有以下优点：在本技术的微凝胶类肝载体中，不仅能够为肝脏细胞提供良好的培养基质，而且携带有肝脏细胞增殖和存活所需的生长因子，并能实现肝脏细胞不同组合方式的装载，为细胞不受限制的快速增殖提供了平台，并且肝脏细胞在经过长时间的培养后不易出现中心细胞坏死的情况，适用于肝脏细胞的体外长期细胞培养，有利于药物筛选和形态发生研究应用。并且本技术的微凝胶类肝载体的制备方法操作简便，适于推广使用。
17.本技术附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
18.本技术上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1为本技术的微凝胶类肝载体的heprg细胞和c3a细胞在培养12天后的形态学观察结果；图2为本技术的实施例一中微凝胶类肝载体的heprg细胞培养第12天，显微镜下观察细胞三维形态学的观察结果；图3为本技术的实施例二中微凝胶类肝载体的c3a细胞培养第12天，显微镜下观察细胞三维形态学的观察结果；图4为本技术的实施例一中微凝胶类肝载体的heprg细胞培养第12天，荧光显微镜下观察细胞存活染色的观察结果；图5为本技术的实施例二中微凝胶类肝载体的c3a细胞培养第12天，荧光显微镜下观察细胞存活染色的观察结果；图6为本技术的实施例一中微凝胶类肝载体的heprg细胞培养第12天，荧光显微镜下细胞标志物表达的观察结果；图7为本技术的实施例二中微凝胶类肝载体的c3a细胞培养第12天，荧光显微镜下
细胞标志物表达的观察结果。
具体实施方式
19.下面详细描述本技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能解释为对本技术的限制。
20.为解决现有三维培养细胞不受限制地快速增殖会导致长期培养后出现中心细胞坏死的情况，本技术提供了一种能够为肝脏细胞快速增殖提供平台的微凝胶肝载体及其制备方法，适用于体外长期肝脏细胞培养，药物筛选和形态发生研究应用。
21.所述微凝胶类肝载体包括由i型胶原蛋白、基质胶交联而成的生物凝胶，所述i型胶原蛋白具体为鼠尾i型胶原蛋白，鼠尾i型胶原蛋白是一种天然培养基和一种天然的黏附剂，可用于制备三维胶原凝胶，构建细胞生长的三维空间，基质胶聚合形成具有生物学活性的三维基质，能够模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。通过所述i型胶原蛋白和基质胶交联形成供体外肝脏细胞培养的三维支架，且采用i型胶原蛋白和基质胶交联形成的生物凝胶性质温和，能够支持肝脏细胞存活和在生长的特定条件下被诱导形成固体形式，肝脏活细胞与所述生物凝胶相互作用，能够使得肝脏细胞的体积、尺寸、载体密度、细胞密度、机械性能及稳定性发生变化。
22.所述生物凝胶上还携带有肝脏细胞及生长因子，所述肝脏细胞包括肝干细胞、肝脏非实质细胞和肝肿瘤细胞中的一种或两种的组合，本实施例中优选采用肝干细胞和肝脏非实质细胞以及肝肿瘤细胞和肝脏非实质细胞的两个细胞组合方式，其中，在两种细胞组合方式中的肝干细胞和肝肿瘤细胞的质量比例均为90-95%，肝脏非实质细胞的质量比例为5-10%。
23.所述生长因子为用于刺激肝脏细胞生长活性的细胞因子，其包括肝细胞生长因子或表皮细胞生长因子，可用于促进肝脏细胞的发生、生存和再生，抑制肝脏细胞凋亡。并且，在本实施例中的所述i型胶原蛋白、基质胶和生长因子三者混合的质量比例为1:1:1，且所述生长因子的终浓度为10-30
µ
g/ml。
24.另外，本技术还涉及一种采用上述材料来制备微凝胶肝载体的方法，具体包括以下步骤：首先，将预冷的i型胶原蛋白、基质胶和生长因子按照1:1:1的质量比例进行配制混合，再加入预设数量的所述肝脏细胞进行混匀，所述肝脏细胞先置于体积百分数为5%co2，37℃的培养箱中进行培育，并培育至预设数量为止，且在培育期间每24小时更换一次培养箱内的培养基。本实施例中肝脏细胞的预设数量为1
×
106以上。
25.待上述材料全部混匀后，将混匀后的材料添加到细胞孔板中，操作温度提高至预设温度后，保持一段时间使生物材料加速凝胶化，但细胞形态仍未发生变化。
26.优选地，在上述步骤中，预冷温度在0℃-10℃之间，i型胶原蛋白的热稳定性较差，并且基质胶在10℃以上会发生胶凝现象，故先将本技术的生物材料进行预冷，能够使i型胶原蛋白、基质胶和生长因子顺利混匀，随后升温至预设温度为25-37℃，此时i型胶原蛋白和基质胶发生胶凝反应形成生物凝胶，并且在25-37℃温度下的肝脏细胞能够生成大量的线
粒体和白蛋白，肝脏细胞的生物活性高，同时避免温度过高导致细胞失活。
27.随后，将上述凝胶化的材料放入离心机进行离心，具体将所述凝胶化材料置于离心机的最小离心半径处以最小的机械力对其进行离心，并以300rpm的离心速度进行离心10min，从而快速凝胶化形成凝胶类肝载体。
28.再将所述凝胶类肝载体置于细胞培养基中孵育至大小恒定状态，在孵育过程中，所述凝胶类肝载体自动漂浮在培养基中。具体可将所述凝胶类肝载体在约37℃的温度下保持自由漂浮2-12天，并且每间隔1-2天需要更新培养基，更换培养基时，需舍弃原始培养基的上清液，使用磷酸缓冲溶液洗涤下层沉淀物质（含所述凝胶类肝载体），随后再添加新鲜细胞培养液。
29.以下为制备本技术微凝胶类肝载体的具体实施例。
30.实施例一以肝干细胞（heparg细胞）为例，所述为凝胶类肝载体的制备方法包括以下步骤：（1）准备生物材料：鼠尾i型胶原蛋白、基质胶和肝细胞生长因子（hgf），并将上述材料保存在0
°cꢀ‑
10
°
c之间。
31.（2）肝脏细胞选择肝干细胞（heparg细胞）和肝脏非实质细胞进行培养，肝脏细胞于体积百分数为5%co2，37℃的培养箱中培养至数量达到1
×
106的数量级以上，且需要在细胞培养期间，每24小时更换培养基。
32.（3）将鼠尾i型胶原蛋白、基质胶和肝细胞生长因子按照质量比例为1:1:1进行配制混合，且肝细胞生长因子的终浓度为10
µ
g/ml。
33.（4）鼠尾i型胶原蛋白、基质胶和肝细胞生长因子在混合配制完毕后，再添加所述肝脏细胞进行混匀，待全部混匀后，将混匀的材料添加到细胞孔板中，升高温度至25-37℃，并在升温的过程中，本技术的生物材料凝胶化的加速相变，而后等待一段时间完成生物材料的凝胶化形变，并在该凝胶化过程中，肝脏细胞的形态未发生任何变化。
34.（5）将所述凝胶化生物材料置于离心机的最小离心半径处以最小的机械力进行离心，并以300rpm进行离心10min，使得所述凝胶化生物材料能够快速地凝胶化形成凝胶类肝载体。
35.（6）将所述凝胶类肝载体在温度约为37℃的培养基中保持自由漂浮2-12天来进行孵育，直到所述凝胶类肝载体的大小基本恒定为止。在孵育所述凝胶类肝载体期间，每间隔1-2天需对细胞培养基进行更换，舍弃培养基的上清液，再使用磷酸缓冲溶液洗涤下层沉淀物质两次，再添加新鲜培养液。
36.实施例二以肝肿瘤细胞（c3a细胞）为例，所述为凝胶类肝载体的制备方法包括以下步骤：（1）准备生物材料：鼠尾i型胶原蛋白、基质胶和肝细胞生长因子（hgf），并将上述材料保存在0
°cꢀ‑
10
°
c之间。
37.（2）肝脏细胞选择肝肿瘤细胞（c3a细胞）和肝脏非实质细胞进行培养，肝脏细胞于体积百分数为5%co2，37℃的培养箱中培养至数量达到1
×
106的数量级以上，且需要在细胞培养期间，每24小时更换培养基。
38.（3）将鼠尾i型胶原蛋白、基质胶和肝细胞生长因子按照质量比例为1:1:1进行配制混合，且肝细胞生长因子的终浓度为10
µ
g/ml。
39.（4）鼠尾i型胶原蛋白、基质胶和肝细胞生长因子在混合配制完毕后，再添加所述肝脏细胞进行混匀，待全部混匀后，将混匀的材料添加到细胞孔板中，升高温度至25-37℃，随后一段时间内所述生物材料发生凝胶化的加速相变，且在所述生物材料凝胶化的时间内，肝脏细胞形态未发生变化。
40.（5）将所述凝胶化生物材料置于离心机的最小离心半径处以最小的机械力进行离心，并以300rpm进行离心10min，使得所述凝胶化生物材料能够快速地凝胶化形成凝胶类肝载体。
41.（6）将所述凝胶类肝载体在温度约为37℃的培养基中保持自由漂浮2-12天来进行孵育，直到所述凝胶类肝载体的大小基本恒定为止。在孵育所述凝胶类肝载体期间，每间隔1-2天需对细胞培养基进行更换，舍弃培养基的上清液，再使用磷酸缓冲溶液洗涤下层沉淀物质两次，再添加新鲜培养液。
42.此外，将本技术的微凝胶类肝载体进行相关测试，结果显示：（1）图1分别示出了本技术实施例一和实施例二中的微凝胶肝载体的heprg细胞和c3a细胞在培养12天后的形态学观察结果，微凝胶肝载体中的heprg细胞和c3a细胞均呈现圆形微凝胶形态，且结构稳固。
43.（2）图2示出了本技术实施例一中的微凝胶类肝载体的heprg细胞培养第12天，显微镜下观察细胞三维形态学的观察结果，结果显示在微凝胶类肝载体中，heprg细胞不同于二维平面内的平铺状结构，其在三维空间中呈现为长形细胞的立体结构状态。
44.（3）图3示出了本技术实施例二中的微凝胶类肝载体的c3a细胞培养第12天，显微镜下观察细胞三维形态学的观察结果，结果显示在微凝胶类肝载体中，c3a细胞不同于二维平面内的平铺状结构，其在三维空间中呈现为圆形细胞立体结构状态。
45.（4）图4示出了本技术实施例一中的微凝胶类肝载体的heprg细胞培养第12天，荧光显微镜下观察细胞存活染色的观察结果，结果显示在微凝胶类肝载体中，绿色荧光细胞（活细胞）数量居多，且未出现中心坏死的情况。
46.（5）图5示出了本技术实施例二中的微凝胶类肝载体的c3a细胞培养第12天，荧光显微镜下观察细胞存活染色的观察结果，结果显示在微凝胶类肝载体中，绿色荧光细胞（活细胞）数量居多，且未出现中心坏死的情况。
47.（6）图6示出了本技术实施例一中的微凝胶类肝载体的heprg细胞培养第12天，荧光显微镜下细胞标志物表达的观察结果，图中，1指向为细胞核，2指向为白蛋白，3指向为甲胎蛋白，结果显示在微凝胶类肝载体中，heprg细胞的白蛋白和甲胎蛋白表达丰富。
48.（7）图7示出了本技术实施例二中的微凝胶类肝载体的c3a细胞培养第12天，荧光显微镜下细胞标志物表达的观察结果，图中，1指向为细胞核，2指向为白蛋白，3指向为甲胎蛋白，结果显示在微凝胶类肝载体中，c3a细胞的白蛋白和甲胎蛋白表达丰富。
49.综上所述，采用上述制备方法制得的微凝胶类肝载体，不仅能够为肝脏细胞提供良好的培养基质，而且携带有肝脏细胞增殖和存活所需的生长因子，并能实现肝脏细胞不同组合方式的装载，为细胞不受限制的快速增殖提供了平台，并且肝脏细胞在经过长时间的培养后不易出现中心细胞坏死的情况，适用于肝脏细胞的体外长期细胞培养，有利于药物筛选和形态发生研究应用。并且本技术的微凝胶类肝载体的制备方法操作简便，适于推广使用。
50.以上所述仅是本技术的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。